金菩嘉FISH技术

第三节 FISH技术

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）技术是生物学领域的一项技术，广泛的应用于临床诊断、细胞遗传学研究、竞争性整组DNA杂交试验，以及基因图谱绘制中。因本书主要介绍病理技术，所以首先要讲述一下FISH在病理诊断中的应用。特别是在实体瘤方面，HER-2/neu基因探针已经得到了广泛的应用。1998年美国政府FDA 批准了作为基因治疗的一种单克隆抗体Herceptin，可配合化疗来治疗部分按期转移性乳腺癌病人，约25%-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu肿瘤基因的放大或过度表达，这部分人适合Herceptin治疗。在下文的实验操作中，我们将重点介绍HER-2基因的FISH操作。

一、FISH原理

FISH技术的原理是利用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

二、乳腺石蜡切片FISH操作步骤方法

1、实验试剂

（1）20×SSC（pH5.3）：氯化钠88g，柠檬酸钠44g，去离子水400mL充分溶解。室温下12mol/L HCl调节PH值至5.3，用去离子水定容至500mL，高压灭菌，使用期间2-8℃储存，保存期不要超过6个月。

（2）2×SSC(pH7.0±0.2)：20×SSC(PH5.3)100mL，去离子水800mL,充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L。使用期间2-8℃储存，保存期不要超过6个月。

（3）变性液：甲酰胺35mL，20×SSC(PH5.3)5 mL充分混匀，室温下调节PH值至7.0-8.0，用去离子水定容至50mL，使用期间2-8℃储存。

（4）甲酰胺洗涤液：甲酰胺75mL，20×SSC(PH5.3)15 mL充分混匀，室温下调节PH值至

7.0-8.0，用去离子水定容至150mL，使用期间2-8℃储存。

（5）30%(W/V)酸性亚硫酸钠：15g酸性亚硫酸钠溶于40mL去离子水中，轻轻摇动至完全溶解，加去离子水定容至50mL。

（6）蛋白酶K储存液（20mg/mL）：0.1g蛋白酶K干粉溶于5mL2×SSC(pH7.0)溶液中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，-20℃分装储存。

蛋白酶K工作液（200ug/mL）：

取0.4 mL蛋白酶K储存液（20mg/mL）溶于40mL 2×SSC(pH7.0)溶液中。

（7）0.1%NP-40/2×SSC洗液：20×SSC（pH5.3）40mL，NP-40 0.4mL，去离子水300mL充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，去离子水定容至400mL。使用期间2-8℃储存，保存期不要超过6个月。

2、操作步骤

预处理程序：

（1）样本的制备：10%中性福尔马林固定，石蜡包埋组织，切片厚度为4μm。

（2）将组织粘附于经硅化处理的载玻片上，80℃烤片机烤片30分钟以上，放入65℃烤箱烤片过夜，使组织切片更紧的粘附在玻片上防止脱片。

（3）脱蜡：二甲苯10分钟×2； 5分钟×1，随后浸入100%乙醇中5分钟。

（4）将切片依次置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各两分钟，随后浸入去离子水中3

分钟，吸取多余水分。

（5）50℃，30%(W/V)酸性亚硫酸钠处理20-30分钟。

（6）于2×SSC溶液中漂洗2次，每次 5分钟。

（7）将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育10-30分钟。

（8）于2×SSC溶液中漂洗2次，每次 5分钟。

（9）将切片置于0.1M HCl中室温浸泡5-10分钟，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次 5分钟，将切片置于-20℃预冷的70%、85%、100%乙醇中各2分钟脱水。

（10）将切片室温浸入丙酮溶液中2分钟，自然干片。

（11）56℃，烤片2-5分钟。

标本准备及变性

（12）将盛有变性液的容器置于73±1℃水浴箱中约30分钟，使溶液达到所需温度，将玻片在变性液中浸泡5分钟。

（13）将玻片依次置于预冷的70%、85%、100%乙醇中各3分钟进行梯度脱水。玻片自然干燥后，置于45-50℃烤片机上预热2-5分钟后与探针杂交。

探针混合物准备及变性

（14）将7μl杂交缓冲液、1μl去离子水、2μl探针加入到微量离心管中，离心1-3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。

（15）装有探针混合物的试管置于73±1℃水浴箱中变性5分钟之后，将该试管置于45-50℃水浴箱中，杂交前取出。

探针与样本杂交

（16）将10uL变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。（17）将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。

玻片洗涤

（18）46±1℃，50%甲酰胺/2×SSC溶液 10分钟×3(pH7.0-8.0)

（19）46±1℃，2×SSC 10分钟(pH7.0)

（20）46±1℃，0.1%NP-40/2×SSC，5分钟(pH7.0±0.2)

（21）室温，70%乙醇3分钟

（22）暗处自然干燥玻片

（23）室温，将15ulDAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片(DAPI自冰箱取出平衡到室温后轻弹混匀)

（24）暗处放置10-20分钟，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察玻片（所用不同荧光染料的激发光和发射光波长及滤光镜选择见如下附表）

（25）结果判定：

①探针：包括HER2和17号染色体，17号染色体为内对照，标记颜色为红和绿

②结果判断：计数30个细胞，统计Ratio值（Ratio值=30个细胞核中HER2信号总数/30

个细胞核中17号染色体信号总数）。Ratio值<1.8为阴性结果，提示样本无HER2基因扩增；Ratio值>2.2为阳性结果，提示样本中HER2基因发生扩增；Ratio值在1.8-2.2之间时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做FISH实验来判断最终结果，如下图：

图4-07该样本Ratio值<1.8为阴性结果图4-08该样本Ratio值在1.8-2.2之间为可疑

图4-09 该样本Ratio值>2.2为阳性结果

③结果分析注意事项：计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞；杂交不均匀的区域

不要分析；细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析；背景深影响信号判断的区域不要分析；计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定；分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位；如果超过25%的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析；如果超过10%的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。

FISH技术已经广泛的运用到分子病理技术中，除乳腺癌中Her-2基因的检测外，套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma, MCL)也可以通过FISH技术与其他淋巴瘤做鉴别诊断（CCND1基因在套细胞淋巴瘤中重排和(或)高表达，该基因可用FISH技术检测到）；慢性粒细胞性白血病亦可以通过FISH技术进行鉴别诊断。这种诊断的意义在于可以为患者选择较好的治疗方案提供病理学依据。因此，随着技术的不断进步，FISH技术会凸显出其在辅助病理诊断方面的优越性。

FISH技术在白血病中的应用~

FISH技术在白血病中的应用 目前荧光原位杂交技术已被广泛用于遗传性疾病、肿瘤研究及临床诊断和治疗监测。在临床应用中，荧光原位杂交技术凭借其较高的灵敏度和特异度，已在产前诊断、实体瘤（乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌）以及血液系统肿瘤的诊断和治疗检测中得到了迅速的发展。 血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一，随着对疾病发病机制的深入研究，发现细胞遗传学对肿瘤分型、诊断、治疗和预测预后都具有重要的意义。但常规的细胞遗传学分析（CC）方法只能分析中期染色体，而对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。而FISH技术弥补了CC在这方面的不足，因此被广泛用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。 在临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在以下几个方面： ①染色体异位形成的融合基因检测 如慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）的BCR-ABL融合基因检测，急性粒细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）M3中的PML-RARA融合基因检测和M2b中的AML1-ETO融合基因检测。对融合基因的检测不但有助于对疾病的诊断，还能帮助我们估计患者预后情况以及选择有效的治疗方案。 ②基因缺失的检测 一些关键基因的缺失有助于我们对肿瘤进行诊断以及预后判断。但是目前的染色体显带技术分辨率低，只有大于4.5 Mb的缺失才能检测到，而FISH分辨率高，可以弥补染色体显带技术用于检测微小缺失的不足。在临床应用中，如通过荧光原位杂交发现慢性淋巴细胞性白血病患者的P53基因缺失提示患者的预后很差，疾病进展较早，且对联合化疗不敏感，多数生存期仅为3个月。而同样在慢性淋巴细胞性白血病患者中，如检测到13q单一缺失则提示患者预后较好，中位生存期可达到133个月。 ③对异性间造血干细胞移植的植入状态监测 目前异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem celtransplantation，allo-HSCT)是治疗血液系统恶性和非恶性疾病的有效手段。移植后动态监测供／受者混合性嵌合体比例变化判定移植是否成功，对指导移植后治疗和预测复发具有十分重要的意义。FISH技术具有操作简便、快速及结果敏感可靠等优点，通过性染色体计数探针动态监测供／受者混合性嵌合体比例变化对异性异基因造血干细胞移植后植入状态进行检测。 ④微小残留病灶（minima residual disease，MRD）的检测 白血病患者经化疗缓解后，体内的白血病细胞并未完全清除，仍残留一定数目的白血病细胞，这些残留的白血病细胞是导致复发的根源。通过对肿瘤细胞特异的染色体异常进行跟踪监测，可间接了解体内白血病细胞负荷，便于预测疾病进展和有无复发迹象。 下面我们介绍CLL、MDS、MM相关的FISH探针。

第三代试管Fish技术与A-CGH技术的区别

选择第三代试管婴儿，到底选择什么样的技术合适，选择什么样的技术成功率更高， 具体的需要根据每个人的年龄，身体情况，还有需求来选择，在泰国，做第三代试管 婴儿，用的最多的是FISH技术，还有A-CGH技术。 PGS-FISH早在1990年就已经作为胚胎染色体检查的一种手段，一开始，科学家相信 通过FISH筛选出正常染色体的胚胎可能会增加试管婴儿的成功率。他们在胚胎初期，即胚胎在试管培育过程中的第三天，从已经发育到6-8个细胞的胚胎中抽出1个细胞，从而检测5种染色体以检查出胚胎的性别。但这项技术在技术上使不完善的，只能筛 查部分的染色体，所以对于有其他染色体异常或有遗传病的患者则没有办法真正解决 问题。 另一种更完善的基因检测PGD-aCGH，即囊胚移植前基因检测，则披世多年，而且被 广泛用在美国的试管婴儿医院。因为用aCGH这种检测方法，我们可以检测到更精确 的数据，从而可以知道人体/胚胎全部的24种染色体是否全部正常，因此更能提高试 管婴儿的成功率。 aCGH是胚胎在试管中培养到第5天到第6天时，对已经发育成的囊胚进行46条（22对+X+Y）染色体进行全部检测，只要有一根染色体有问题，就不再被移植，做这个 检测的淘汰率较高，但剩下的都是精英。被移植的精英囊胚着床率及生育率极高，从 而大大降低了胎停及流产风险。说实话，做试管成着床但停育的人非常多，包括现在 35岁以上的女性自然怀孕的流产率也高，就是因为高龄产妇的胚胎染色体更容易发生变异，因此，aCGH应该被以下人群强烈考虑： 1）想追求更高的试管婴儿着床率及生育率 2）习惯性流产的人群 3）纯粹是为了下一代优生考虑

4）做性别选择 5）高龄女性 泰嘉运刘顾问(weixin：laney8）总结：由于国内最近去国外寻求性别选择的越来越多，我从实际经验中也总结到，成功率最高是做aCGH，而第二则是没有做性别选择，直接移植囊胚的，最后一名则是做FISH性别选择的。究其原因，主要原因是做FISH是第 三天胚胎还未长成囊胚时，被生生抽出一个细胞，对还未发育完善成囊胚的胚胎多少 有点伤害，而如果是培育到囊胚阶段的胚胎，生长的潜力是比较强的，移植着床率也 更高。 PGD-aCGH的时间表示例： 1/1 月经的第2-5天，开始打促排针 1/11 取卵（如果要做子宫镜检查的，可以这一天做） 1/12 受精情况D1报告（看你取的卵实际受精了多少个胚胎） 1/16 囊胚情况D5天报告（看第5天出了多少囊胚，没长到囊胚的则再培养到第6天）1/17 囊胚情况D6天报告 (胚胎在试管中只能长到这一天，不能到第7天。这一天还没发展到囊胚，则不可再用) 1/25-30 左右出aCGH报告，可看出哪些胚胎染色体在哪一条是不正常的，不正常的胚胎是不可以用的，因为会导致流产或者其他异常结果。正常的胚胎则着床率非常高。

荧光原位杂交技术FISH技术在疾病分型诊断中的应用

荧光原位杂交技术(FISH)技术在疾病分型诊断中的应用.txt铁饭碗的真实含义不是在一个地方吃一辈子饭，而是一辈子到哪儿都有饭吃。就算是一坨屎，也有遇见屎壳郎的那天。所以你大可不必为今天的自己有太多担忧。荧光原位杂交技术（FISH）技术在疾病分型诊断中的应用 生命科学的发展，生物技术的进步使我们对疾病本质的认识不断地深入，也使我们拥有更多新的治疗方法和药物应对疾病的威胁。如何准确有效地利用这些新的治疗方法和药物治愈疾病是我们迫切需要研究的内容。如何对疾病进行正确的分型和诊断却是上述工作的基础。只有全面地把握病情，并在此基础上进行准确的判断和分析，才能为病患制定及时有效的治疗方案。因此我们要求疾病的诊断工作能提供更为准确和及时的结果。而古老的“望、闻、问、切”和传统的常规手段已远远无法满足我们对疾病诊断的要求，迫切需要将新的技术引入疾病诊断领域。 荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末，Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后，FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用，显示出与一些传统技术相比的明显优势。 与传统的免疫组织化学法（IHC）相比，FISH具有良好的稳定性和可重复性。目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的临床诊断。免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。由于蛋白的表达和本身的构象受各种因素的影响很大（例如酸、碱和变性剂），检测条件的稳定性对检测结果至关重要。此外，免疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断，对于一些弱阳性的结果，不同的检测者容易产生分歧。上述的因素都可能影响医生对病情的最终诊断。荧光原位杂交技术检测的对象是细胞中的DNA，致密的双螺旋结构使DNA可以历经千百万年而依然保持良好，其结构稳定，不易被环境条件影响，为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。此外，荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数，客观地量化了检测地结果。如果借助于相应的FISH操作系统（例如Abbott-Vysis公司的Hybrit杂交仪和VP2000样本预处理系统）和染色体成像系统（例如AI公司的CytoVision）就能实现整个FISH操作的自动化，最大限度的降低操作者和检测者的主观因素，确保结果的准确性。 PCR由于灵敏度高，操作简便快捷是近年来应用比较多的基因诊断技术，但PCR诊断技术的假阴性和假阳性的比例较高，对同一样本也只能作一次分析，不能重复实验结果。随着探针技术的不断发展，FISH目前的灵敏度已经接近或达到PCR的水

荧光原位杂交技术FISH

荧光原位杂交技术FISH 1 目的 通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。 2材料与仪器 2.1材料 件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次； 72℃再延伸8 min。 2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产 物，并用微量分光光度计测定其浓度。 3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNase

inhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。 4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。 5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。 6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于 -80℃放置20 min。 7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃ 离心10 min沉淀RNA。 8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。 3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果 1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和 100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。 2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。 3) 选取上述脑组织切片于室温条件下经含有2%H2O2的0.1 mol/L DEPC-PB处理10 min 以阻断内源性过氧化物酶，再用0.1mol/L DEPC-PB室温漂洗10 min，接着用含 0.3%Triton X-100的0.1 mol/L DEPC-PB处理20 min，在用乙酰化液处理10 min，后 于0.1mol/L DEPC-PB中清洗2次，每次10 min，后加入预杂交液，60℃预杂交1 h 以封闭非特异结合位点。 4) 分别于两组切片中加入探针并使探针终浓度为1 μg/mL。于60℃杂交炉中恒温孵育 16-20 h，同时设立省略探针的空白对照，以上操作严格在无RNA酶环境下进行。 5) 杂交后组织切片置于wash buffer中60℃浸洗2次，每次20 min，接着切片在RNase buffer中室温孵育5 min，后加入终浓度为20 μg/mL的RNase，37℃作用30 min以消化未结合的cRNA探针。 6) 接下来恒温37℃条件下依次用2×SSC，0. 2×SSC溶液各浸洗切片2次，每次20 min， 再在TS7.5溶液中室温孵育5 min，后置于TBS溶液中室温封闭1 h，加入地高辛抗体（POD-anti-DIG,1:100）室温孵育过夜。

FISH技术全攻略

FISH（荧光原位杂交）技术全攻略 荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。 1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？ 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。 2 如何保证FISH操作中的温度？ 最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有

PNA-FISH技术

医学科学设计与研究作业 姓名：王祥璞 学号：20166020268 班级：16届口腔基础医学

检测并定位牙周致病菌的创新型方法：PNA-FISH技术 Luzia Mendes 、Catarina Ferreira、 Miguel Goncalves Pinto 均毕业 于波尔图大学牙科学院的牙周部。 Rui Rocha、Andreia Sofia Azevedo 、Nuno Filipe Azevedo毕业于波尔 图大学工程院化学工程系的能源、生物科技、环境、工艺学实验室。 关键字 PNA-FISH技术（肽核酸-荧光原位杂交技术）、组织浸润、伴放线放线杆菌（Pg）、牙龈卟啉单胞菌(Aa)、牙周疾病 摘要 目的：我们的目的是通过应用FISH(荧光原位杂交技术)开发肽核酸（PNA）探针，用以检测龈下菌斑和牙龈组织中的伴放线放线杆菌以及牙龈卟啉单胞菌，并对其位置进行定位。 方法：针对每种微生物设计各自的PNA探针，优化之后的PNA-FISH方法 可以使得每种微生物和它们各自的探针（也就是PNA-FISH复合物）同时杂交。在对Pg和Aa代表菌株进行测试之后，PNA-FISH方法就可以用来对患有重度牙 周炎的患者收集的龈下菌斑和牙龈样本中的微生物进行监测。 结果：对于（Pg PNA1007和 Aa PNA235）两种探针而言最佳的杂交环境是59℃ 150分钟。Pg PNA1007探针和 Aa PNA235探针的特异性和敏感性分别都 达到了100%和99.9%。临床样本的结果表明PNA-FISH方法可以监测并区分位于龈下菌斑和牙周组织内混合微生物群中的目标细菌。 讨论：这项研究为监测并定位临床样本中的Pg和Aa细菌提供了一种新的高 精度的方法，并且仅需要短短的数小时。通过使用这种方法我们就可以观测微 生物菌落中的这些菌种在牙周袋内的空间分布，并且在活体牙龈组织中首次应 用了FISH（荧光原位杂交技术）技术。 1.介绍 牙周炎是由易感个体的龈下菌斑和宿主防御系统之间的失衡所导致的。过 去十年来有关牙周膜的研究都非常的重要，然而，因为多种微生物复杂的性质 以及进行体内研究的困难，有关科研和诊断目的方面的性质依然具有挑战性。 现代的分子生物学方法已经取代了传统的培养方式，并且提供了一些新的资源，这些资源不仅仅可以区分单一的微生物，还对所有具有潜在致病性的群体也具 有非常的重要作用。 在这种情况下，生物膜研究中FISH（荧光原位杂交技术）的应用得到了重视，因为它可以通过标记的DNA探针和细菌核糖体RNA进行杂交对微生物进行 原位鉴定。一些人已经通过使用这项技术在体内观测到了龈上、龈下牙龈生物 膜中牙周病原菌的空间分布，以及他们入侵宿主上皮细胞的能力。

FISH技术及其在环境微生物中的应用

哈尔滨师范大学 学年论文 题目 FISH技术及其在环境微生物中的应用 学生李晓晶 指导教师王继华教授 年级 2009级 专业生物科学 系别生物学系 学院生命科学与技术学院 哈尔滨师范大学 2012年4月

论文提要 荧光原位杂交与微量自动照相集成技术(FISH)能够同时在单细胞水平原位进行细胞的分类鉴定和细胞对底物的吸收特性研究,这是微生物学研究领域的一大突破。目前,这一技术已有效应用于工程系统(污水处理厂、生物反应器等)和自然生态系统中微生物的研究。污染水体的原位强化净化及其生态修复与微生物也有着密切的关系,因此,这一技术的应用不仅能够提高工程系统污水处理效率, 也将为受损水生态系统的原位修复提供科学依据。

FISH技术及其在微生物学中的应用 李晓晶 摘要：微生物对整个生态系统具有重要的影响,了解和检测微生物的种类具有十分重要的意义。但是传统的培养方法又不能满足科学研究的需要,荧光原位杂交技术(FISH)就是今年发展起来的一种快速准确检测微生物的方法。较全面地介绍了FISH技术的优点、微生物的分离和固定方法，以及原位杂交过程，同时对FISH技术在环境微生物学中的应用作了详细研究。 关键词：荧光原位杂交检测环境微生物学种属特性功能特性 污水处理、受损水生态系统的原位修复均与微生物有着密切的关系。因此,对于相关微生物的研究是这一领域的重要研究内容之一。当前,在自然界的微生物群落中绝大部分种类尚不能进行培养(如海水中可培养的微生物只占到总数的0.001%～0.1%；淡水水体或底泥中相对较多,但也只占到总数的0.25%[1])。为了在尽量不破坏周围环境的基础上研究这些尚无法培养的微生物,在过去的十多年里,微生物学家引入了分子生物学技术,如荧光原位杂交(FISH)、多聚酶链(PCR)、DNA测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等[2]。这些技术在微生物生态学中的应用揭示了环境中微生物群落结构和多样性的大量信息。然而,这些方法一般不能检测微生物在其生存的微生态环中的功能特性。而在研究微生物时,不管是研究微生物的富集培养和分离,还是研究微生物技术的应用都需要在了解微生物分类鉴定的同时,了解微生物的各种功能特性。 有研究者已经开发了一些可以同时研究微生物分类鉴定和功能特性的方法,如FISH/CTC还原结合、MAR(微量自动照相术)和免疫荧光联用技术、FISH-微电极技术等,但这些技术在研究复杂环境微生物群落中的个体微生物时存在很多局限[3-4]。上世纪末,研究者开发研究了一种新技术,即荧光原位杂交(FISH)和微量自动射线照相(MAR)集成技术(本文中FISH/MAR技术),也有称其为MAR- FISH、STARFISH、Micro –FISH等[5-6]。应用FISH/MAR 能同时在原位水平从复杂微生物种群中获得特定微生物的种属和功能特性,从而更好地了解特定微生物在环境中的作用,更清楚地解释自然或人工生态系统中微生物多样性和微生物群落结构多样性的原因及其与微环境的相关关系。 1 FISH 技术简介 1.1原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是: 如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 1.2实验流程

FISH技术

FISH 为了使探针与靶序列的退火速率达到最大值，通常在高离子强度的溶液(6×SSC)，并在比T m值低12-20℃条件下进行杂交反应 1. 探针制备 1.1 探针沉淀 取10ul用切刻平移法制备的探针 加入25ul无水乙醇+1ul NaAc(3M, pH5.2)，混匀，于-20℃静置30min以上 12000rpm离心30min 弃上清，1ml 70%乙醇洗涤 吸去乙醇，残留的乙醇让其自然挥发干净 1.2 探针变性 向探针中加入10ul杂交液，充分吹打混匀(~吹打100次) 12000rpm离心10s 65℃预热5min 75℃变性5min 立即置于冰上冷却 2. 中期染色体标本处理 寻找分裂相，做好标记，划杂交区域（用铅笔画背面） 50℃烘烤2h 加标本变性液，70℃变性2.5min 立即用70%，90%和100%冰乙醇依次脱水，每次脱水5min 晾干

3. 杂交 将10ul 探针加在杂交区域，盖上盖玻片，用封片胶封好四周 置于湿盒中，37℃杂交12-24h 4. 洗脱，免疫荧光检测与信号放大 42℃-50℃，50%甲酰胺/2×SSC中洗4次，每次5 min (待盖玻片脱落时计时) 42℃-50℃，1×SSC中洗3次，每次5 min 加100-200ul BloI(3%BSA, 0.1%tween20/4×SSC)，37℃孵育15-30min 加100-200ul avidin-FITC于标本上，37℃孵育30-60min 42℃-50℃，0.1%tween20/4×SSC中洗3次，每次5 min 加100-200ul BloII(3%BSA,5%山羊血清，0.1%tween20/4×SSC)，37℃孵育 15-30min 加100-200ul anti-avidin抗体于标本上，37℃孵育30-60min 2×SSC室温下清洗 自然干燥，PI或DAPI复染，加上抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片 荧光显微镜下观察

荧光原位杂交(FISH)技术在产前诊断中的应用

荧光原位杂交（FISH）技术在产前诊断中的应用 发表时间：2011-12-15T08:56:32.513Z 来源：《中外健康文摘》2011年第33期供稿作者：杨国安王宏坤葛华陈鹏[导读] 产前诊断作为出生缺陷干预的重点内容近年来发展迅速。 杨国安王宏坤葛华陈鹏（内蒙古包头医学院第一附属医院中心实验室 014010）【中图分类号】R714【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）33-0078-02 【摘要】目的探讨FISH技术在产前诊断中的应用前景。方法应用国产探针(CSP18 /CSPX/CSPY探针组和 GLP13 /G LP21探针组 ) 对 50例羊水中的细胞进行检测, 从而判断胎儿13、18、21、X和Y染色体的数目有无异常，同时与50例羊水染色体培养结果进行对比。结果严格按照实验流程操作, 50例羊水的FISH均检测成功，与胎儿羊水染色体核型分析的结果相比较, 准确率为100%。但部分F I S H检测结果中出现少量带有异常杂交信号的核。结论 F I S H技术相比羊水培养具有时间周期短，准确率高等特点，具有重要的应用价值，但并不能完全取代羊水培养在产前诊断中的作用。【关键词】荧光原位杂交产前诊断羊水【Abstract】 Objective To study application of fluorescence in situ hybridization(FISH) technology in prenataldiagnosis. Methods Applying national probe (probe group CSP18 /CSPX/CSPY and probegroup GLP13 /GLP21)to detect fifty amniotic fluid cells, then deciding whether the numbers of chromosomal 13,18,21,X,Y are normal,and comparing with consequence of fifty amniotic fluid cell culture. Results According to experiment flow-sheetstrictly, fift FISH detects are successful, and its accuracy rate is 100% compared with consequence of fifty amnioticfluid chromosomal karyotype analysis. But part of FISH detects appeared few hybridization signal. ConclusionFISH technology has a few features including short time cycle and high accuracy rate compared with amniotic fluidculture. Although FISH has important application value, it cant’t totally displace effect of mniotic fluid culture inprenatal diagnosis. 【Key words】fluorescence in situ hybridization prenatal diagnosis amniotic fluid 我国计划生育政策执行30多年来，人口数量得到了显著控制，目前的计生工作重点已经从单纯的控制人口数量转变到提高人口素质。产前诊断作为出生缺陷干预的重点内容近年来发展迅速。目前针对胎儿的产前诊断主要采用羊水培养观察染色体数目及形态结构的异常，这种方法能够准确诊断胎儿的染色体病，但此类方法技术含量高，得到诊断结果所需的时间长。因此临床要求更便捷、准确、快速的诊断方法便应运而生了。 染色体荧光原位杂交（F I S H）技术不仅可用于中期分裂相，还可在间期细胞显示杂交信号，因此，可以用于未培养的细胞,能很快得出诊断结果[1-3]。本文介绍了F I S H技术在产前诊断中的应用。 1 资料与方法 1.1 研究对象 选择2008年5月-2010年10月在我院和内蒙古妇幼保健医院妇产科就诊的唐氏筛查高危孕妇50例，年龄26-45岁，平均年龄32.04岁；孕周14-20周，平均孕周18.4周。全部为唐氏筛查检测高危。高龄（≥35岁）孕妇12例。孕中期妇女先进行唐氏综合症筛查实验，筛查高危结果的孕妇建议进行羊水采集平行作羊水细胞培养和F I S H检测。用22号腰穿针行羊膜腔穿刺抽取羊水30ml分成两份，10ml用于FISH检测，20ml用于羊水染色体培养[4]。 1.2 所用仪器、试剂 所用仪器包括奥林巴斯BX51型荧光显微镜，FISH图像分析系统，37℃二氧化碳培养箱等。试剂为国产荧光原位杂交探针试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。 1.3 FISH检测 采集到的羊水立即进行样本玻片制备及预处理，接着进行样本制备及变性，同时准备探针混合物并变性，然后使探针与样本杂交，最后玻片洗涤后进行结果观察。 采集到的羊水立即离心后取上清，加固定液固定后用细胞混悬液滴片，在室温下老化过夜。老化后的破片在室温下于0.1M H C L溶液中浸泡玻片7—10分钟；前后均用2×S S C（P H7.0）溶液中漂洗玻片2次，每次5分钟；经酒精梯度洗脱，在于74℃，70%的甲酰胺/2×S S C中变性，洗脱，干燥后致46℃烤片机预热。将装有探针混合物的试管置于73±1℃水浴箱中变性5分钟，将10u l变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用树脂胶封片，将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。移去盖玻片，立即将玻片置于盛有50%甲酰胺/2×S S C溶液瓶中，洗涤玻片3次；将玻片先后置于盛有2×SSC溶液和2×SS C/0.1%NP-40溶液瓶中，洗涤玻片；最后将玻片室温浸泡在70%乙醇中，3分钟后取出玻片，暗处自然干燥玻片。将15u l D A P I复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10—20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。 2 结果 所有50例样本羊水培养和F I S H检测均成功，50例样本中核型分析49例正常胎儿，1例21三体，平均出报告时间为3周。F I S H检测为49例正常，1例21体，平均出报告时间为3天。两种试验方法所检测的结果一致。（见表1）表1 FISH与核型分析一致性比较

金菩嘉FISH技术

第三节 FISH技术 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）技术是生物学领域的一项技术，广泛的应用于临床诊断、细胞遗传学研究、竞争性整组DNA杂交试验，以及基因图谱绘制中。因本书主要介绍病理技术，所以首先要讲述一下FISH在病理诊断中的应用。特别是在实体瘤方面，HER-2/neu基因探针已经得到了广泛的应用。1998年美国政府FDA 批准了作为基因治疗的一种单克隆抗体Herceptin，可配合化疗来治疗部分按期转移性乳腺癌病人，约25%-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu肿瘤基因的放大或过度表达，这部分人适合Herceptin治疗。在下文的实验操作中，我们将重点介绍HER-2基因的FISH操作。 一、FISH原理 FISH技术的原理是利用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。 二、乳腺石蜡切片FISH操作步骤方法 1、实验试剂 （1）20×SSC（pH5.3）：氯化钠88g，柠檬酸钠44g，去离子水400mL充分溶解。室温下12mol/L HCl调节PH值至5.3，用去离子水定容至500mL，高压灭菌，使用期间2-8℃储存，保存期不要超过6个月。 （2）2×SSC(pH7.0±0.2)：20×SSC(PH5.3)100mL，去离子水800mL,充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L。使用期间2-8℃储存，保存期不要超过6个月。 （3）变性液：甲酰胺35mL，20×SSC(PH5.3)5 mL充分混匀，室温下调节PH值至7.0-8.0，用去离子水定容至50mL，使用期间2-8℃储存。 （4）甲酰胺洗涤液：甲酰胺75mL，20×SSC(PH5.3)15 mL充分混匀，室温下调节PH值至 7.0-8.0，用去离子水定容至150mL，使用期间2-8℃储存。 （5）30%(W/V)酸性亚硫酸钠：15g酸性亚硫酸钠溶于40mL去离子水中，轻轻摇动至完全溶解，加去离子水定容至50mL。 （6）蛋白酶K储存液（20mg/mL）：0.1g蛋白酶K干粉溶于5mL2×SSC(pH7.0)溶液中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，-20℃分装储存。 蛋白酶K工作液（200ug/mL）： 取0.4 mL蛋白酶K储存液（20mg/mL）溶于40mL 2×SSC(pH7.0)溶液中。 （7）0.1%NP-40/2×SSC洗液：20×SSC（pH5.3）40mL，NP-40 0.4mL，去离子水300mL充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，去离子水定容至400mL。使用期间2-8℃储存，保存期不要超过6个月。 2、操作步骤 预处理程序： （1）样本的制备：10%中性福尔马林固定，石蜡包埋组织，切片厚度为4μm。 （2）将组织粘附于经硅化处理的载玻片上，80℃烤片机烤片30分钟以上，放入65℃烤箱烤片过夜，使组织切片更紧的粘附在玻片上防止脱片。 （3）脱蜡：二甲苯10分钟×2； 5分钟×1，随后浸入100%乙醇中5分钟。 （4）将切片依次置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各两分钟，随后浸入去离子水中3

FISH荧光原位杂交技术介绍

FISH技术

经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4．应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交（FISH）技术的发展和进步

于直接检测。在这些方法基础上，有许多关于不同的检测范围、特异性，灵敏度以及分辨率等直接的或间接的改进技术方面的报道。 1 FISH 技术检测位点数目及检测目标的发展 在FISH 技术基本确立之后，FISH 不仅用于单基因或核酸检测，FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。早期的探针较大，是通过载体的增殖、缺口平移法、体外转录法和随机引物DNA 合成法来制备以获得特异性杂交克隆。然而大片断的探针通常带有重复序列造成高荧光背景，采用未标记的核酸进行预处理使其与非特异性位点结合用于抑制非特异性杂交可以克服上述问题，同时也使得研究者扩大了检测目标，实现了整条染色体染色。在细胞遗传学上FISH 技术在染色体分析方面也因此得到了显著的提高。如通过比较基因组杂交（Comparativegenomic hybridization）用于检测染色体区域的缺失和重复。大片段探针一旦和样品非特异性结合就会形成一个信号，混淆染色体上基因的检测，就需要剪切成小片段＜200核苷酸。现在检测手段的提高以及检测软件的不断发展使得FISH技术的检测要求越来越低，灵敏度越来越高。精确的计算机图片处理算法的不断改进形成了亚显微水平的探针高分辨技术。随着检测目标越来越小，FISH技术已用于隐蔽的亚端粒核型基因重排和精确的染色体作图及单拷贝mRNA的检测。 FISH 检测范围的扩大，使得FISH 技术的应用在20 世纪90 年代急速增长。由FISH 技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测。首先是采用不同的荧光素来检测多位点，如双色荧光用于检测特异的核酸序列，每一条染色体、基因或者转录产物分别由一种可以分辨的荧光信号来表示。之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了FISH 应用范围。译码方案主要是针对色彩比例，即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点。前述的每一种方法，或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达12 个。采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着FISH 技术多位点检测的里程碑。尽管可以采用多种方法观测到mRNAs，但是FISH 对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景。色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测。 2 FISH 技术的定量分析阶段[1] Pinkel 等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检