基因编辑技术的概念和原理-完整版

基因编辑技术的方法、原理及应用

Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2015, 5, 32-41 Published Online July 2015 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/db1477862.html,/journal/hjbm https://www.wendangku.net/doc/db1477862.html,/10.12677/hjbm.2015.53005 Methods, Principles and Application of Gene Editing Yuchang Zhu1, Xiaojiang Zheng1, Yibing Hu2* 1School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei 2College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing Jiangsu Email: *huyb@https://www.wendangku.net/doc/db1477862.html, Received: Jul. 1st, 2015; accepted: Jul. 24th, 2015; published: Jul. 27th, 2015 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/db1477862.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Fast development of gene editing technologies provides more powerful tools for gene function analysis. Now researchers can easily manipulate targeted gene with the Zinc Finger Nuclease (FZN), Transcription Activation Like Effector Nuclease (TALEN) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins (CRISPR) technologies emerged in the last dec-ade. These technologies revolutionized gene functional analysis and medical treatment. In this re-view, several typical gene editing technologies were listed, and their principles, characteristics and application were discussed. Keywords Gene Editing, Methods, Principles, Application 基因编辑技术的方法、原理及应用 朱玉昌1，郑小江1，胡一兵2* 1湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 2南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 Email: *huyb@https://www.wendangku.net/doc/db1477862.html, 收稿日期：2015年7月1日；录用日期：2015年7月24日；发布日期：2015年7月27日 *通讯作者。

高中生物 第一章 基因工程 第2课时 基因工程的原理和技术学案 浙科版选修3

第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基

基因编辑技术最新进展

基因编辑技术最新进展 人体内已命名的基因共有25000多条，目前已知一部分基因（3000）的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗，最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法（genetic therapies）。目前最广泛的遗传疗法手段为：1. 以病毒载体感染方式引导的源基因导入；2. 以RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。这些手段在治疗严重复合型免疫缺陷疾病（SCID）以及Wiskott-Aldrich综合征方面获得了成功。尽管如此，RNAi 技术在应用的广泛性上还存在局限。 基因编辑技术（genome editing technologies）是针对DNA本身进行的操作手段。最近应用型基因编辑领域的"鼻祖"，美国麻省理工学院张锋教授等人发表在《Nature Medicine》杂志上的一篇综述详细介绍了这些技术的原理以及在临床上的应用前景。 基因编辑技术的基本原理

归巢酶，ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9四种核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列，引起DNA双链断裂（DSB）。根据其识别方式的不同可以分为：蛋白质与DNA的识别与切割，包括归巢酶，ZFN，TALEN； RNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割，即CRISPR/cas9。在特异性方面，归巢酶具有一个较大的DNA识别结构域，此结构同时负责DNA的切割；ZFN与TALEN是由多个酶亚基组成的复合体，分别具有特异性识别DNA的能力与 DNA内切活性。在应用方面，归巢酶及ZFN需要通过人工突变的方式构造切割不同DNA序列的工程酶，LALEN则需要复杂的分子克隆达到此目的。与之不同，在CRISPR/cas9系统中，可以通过简单的sgRNA的变化达到切割不同的基因片段的目的。切割完成后，目的位点会出现双链断裂（DSB）的结果并引起生物体的主动修复。NHDJ修复以另外一条未被切割的DNA链为模板，从而保证修复结果的准确。在反复不断地断裂-修复过程中，容易在切割位点造成插入或缺失突变，这样就达到了造成基因紊乱的目的。另外，研究人员利用HDR的修复机制可以人为制造想要得到的突变结果，从而达到基因修复的效果。 基因编辑疗法简介 基因编辑在疾病治疗方面的应用模式主要为：矫正/沉默有害突变，插入保护性突变，加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。对于突变引起的有害基因的活化，可以通过简单的沉默或敲除的方式达到治疗的目的，如亨廷顿氏舞蹈症（一种显性突变引起的家族性遗传病），但是对于突变引起的正常基因的失活，则需要通过HDR的方式对目的序列进行编辑，使其恢复到原有的健康状态，如泰萨氏病（一种隐性基因突变引起的遗传性疾病）。 基因编辑的效率 基因编辑的效率受到编辑方式，细胞类型，位点序列等多个因素的影响。总体上来讲，NHEJ要比HDR效率更高。对于我们更关心的HDR方式，主要受到4个因素的影响：1，修饰的本质，如改变的序列幅度；2，其识别特异性的干扰，如

基因工程原理与技术思考题

Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母

Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶

基因操作原理

（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考） 第一章 编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include: 1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame) 2.保证转录所必须的调控序列(S-D) 3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer) 4.内含子(intron) Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。 两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。 Development of gene engineering： 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程 第二章 目的基因的获得（DNA的准备） 1.从基因组直接获得 2.RT-PCR 方法获得 3.人工合成法 DNA抽提的基本原理 ?1 获得细胞，裂解细胞 三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。 2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离） 3 纯化（去除RNA） ?RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。 3 纯化（去除蛋白） ?常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。 PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制 PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右

基因工程原理练习题及答案

基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：

《基因工程原理》期末复习思考题教案资料

《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这

些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体

《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准.0001

精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载

基因操作原理名词解释

第一章 1. Gene manipulation 基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 2. Interrupted genes 间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。 3 .Promotor 启动子。DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。4. Subcloning 亚克隆。当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。 第二章 1.Restriction and modification 限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matched ends 匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。 3. Blunt ends 平末端。在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。 4. Isoschizomer ：同裂酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。 5. Isocaudiners ：同尾酶。来源不同、识别序列不同，?但产生相同粘性末端的酶。 6.Site preferences ：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。 7.Star activity 星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 8. Nicking enzyme 切口酶。有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。 9. Klenow fragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。 10 .Sequenase 测序酶。是改造的T7 噬菌体DNA 聚合酶，切除了99% 以上的3'--5' 外切活性。Sequenase Version2 切除了所有的3'--5' 外切活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。 11.Reverse transcriptase 反转录酶。即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。它来自AMV （禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV （Moloney 鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。 12. Terminal transferase 末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。若dNTP 为T 或C ，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP 为A 或G，此二价阳离子首选镁离子。 13. Ligase 连接酶。催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。 14. T4 polynucleotide kinase T4 多核苷酸激酶。催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。 15. Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称CIP 或CIAP，也有来自细菌（BAP）。催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。 16. S1 nuclease Sl 核酸酶。来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。

基因工程原理(徐晋麟) 课件归纳总结要点

第一章基因工程的分子生物学基础 1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产 生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。 基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR 技术；③载体技术；基因转移技术。 2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、 A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。 3、限制性内切酶： I类酶II类酶III类酶 酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分 离 二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列 切割位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识 别位点在识别位点下游24-26bp 限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争 限制作用需要需要不需要 限制酶剪切： 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端

结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（①5’突出的黏性末端；②3’突出的黏性末端。） ③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段 具有平末端。 产生黏性末端的酶： a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核 酸内切限制酶。 b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列， 这类酶称为同裂酶。 4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶 ①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端） 利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。 ②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。 在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。 5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶 液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。 细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量（A260/A280=1.8）。凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。

基因编辑基本原理

1 基本介绍 基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。 而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。 2016年美国间谍首脑发布了一项公开警告，将基因编辑列为潜在的大规模杀伤性武器（WMD）之一。[2] 2 应用技术 这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。 那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？ CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。 3 执行手段 1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。

基因工程原理讲义：目的基因的克隆

第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月

目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆

1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建

目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：

浅谈基因编辑技术在农作物领域中的应用与问题探究

现代农业研究 近年来，农作物转基因技术得到了快速发展，将基因编辑技术应用在农作物育种上，能得到多个新的生物品种，尤其在玉米、大豆、棉花等农作物上有着较好应用。转基因技术的应用，一定程度推动了农业领域发展，但是还存在一定安全问题，要想充分利用作物转基因技术，还要注重基因编辑农作物的管理和检测，以便能发挥基因编辑技术在研发新品种上的作用，尽可能提高农作物营养价值。 1基因编辑技术在农作物领域的应用 1.1ZFN 技术 ZFN 主要负责识别和结合特定的核苷酸序列，将ZFN 技术应用到作物育种中，可对植物基因进行重新编辑。锌指核酸酶由锌脂蛋白和核酸酶结构域组成，其中核酸酶结构域对切割点不具有识别特异性，只有在二聚体情况下可使其具备酶活性。因此，需要对任一靶位点设置一对ZFN，以便形成核酸酶二聚体，从而进行DNA 链的切割。有研究学者采用该技术，替换掉烟草中乙酰乳酸酶基因的三个核苷酸点，进而得到抗除草剂的作物[1]。另外，将ZFN 技术应用在玉米作物 中，能合成磷酸酶基因，使得玉米具有抗除草剂性能，同时还能减少玉米中的肌醇六磷酸含量，提高了作物营养品质。尽管当前ZFN 技术在多种植物中取得较好运用，但是由于锌指单元对切割点识别性不高，因此在不同基因改造上的识别差异较大，限制了该技术的广泛使用。 1.2TALEN 技术 该技术是一种基于核苷酸的编辑技术，是由核酸内切酶和DNA 结构域共同组成的，其中DNA 结构域主要是由多个氨基酸序列构成的，重复序列能识别相应的碱基。TALEN 技术运用原理为：结合靶位点两端的序列设置一对TALEN，与识别位点结合后，两个核酸内切酶结合起到形成二聚体，在切割DNA 链后可完成基因编辑。有学者将该技术运用到水稻中，破坏了细菌性病原菌效应蛋白在作物基因组上的位点，进而提高了水稻抗百叶枯病。另外，在这一技术作用下，还能破坏水稻甜菜碱乙醛脱氢酶结合位点，能起到提高水稻品质的作用。而将该转基因技术运用到小麦育种中，能得到抗性较强的小麦，相对于传统育种技术来讲有 浅谈基因编辑技术在农作物领域中的 应用与问题探究 （威海海洋职业学院 264300） 【摘要】随着ZFN 、CPISPR/Cas9等基因编辑技术的发展和运用，大量基因编辑作物生产出来，这种背景下，基因编辑作物的检测及安全成为重点研究问题。本文主要围绕基因编辑技术在农作物领域的应用、针对基因编辑农作物的安全评价监管、基因编辑农作物的检测等方面展开讨论，具体分析了基因编辑技术在农业领域的应用现状，并以保障农作物食用安全为主，加强基因编辑作物有关问题的研究，促进农业领域良好发展。【关键词】基因编辑技术；农作物领域；应用分析 邹丹丹 Discussion on the Application and the Problem of the Gene Editing Technology in the Field of Crop Zou Dandan [Abstract]With the development and application of gene editing technology such as ZFN,CPISPR/Cas9,a large number of gene editing crops have been produced.Under this background,the detection and safe?ty of gene editing crops has become a key research issue.In this paper,the application of gene editing technology in agriculture was analyzed in detail,and the main purpose was to ensure the food safety of crops,to strengthen the research on related problems of gene editing crops,and to promote the good de?velopment of agricultural field. [Keywords]gene editing technology;crop field;application analysis （Weihai Marine V ocational College 264300） 农业经济

基因工程原理练习题及其答案

基因工程复习题 题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。 第一章绪论 1.名词解释： 基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。 克隆：无性(繁殖)系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 2．什么是基因克隆及基本要点? 3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。 A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用； C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。 4.基因工程研究的主要内容是什么？ 基础研究： 基因工程克隆载体的研究 基因工程受体系统的研究 目的基因的研究 基因工程工具酶的研究 基因工程新技术的研究 应用研究：

基因工程药物研究 转基因动植物的研究 在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究 第二章基因克隆的工具酶 1.名词解释： 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。 同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。 同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列 黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 平末端：DNA片段的末端是平齐的。 限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）：在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 限制性核酸内切酶的星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 连杆（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。 激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 2.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以