层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
一、实验目的和内容
目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；
2. 熟悉凝胶层析的一般过程；
3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；
2. 凝胶柱柱效测定；
3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管
2. 实验材料和试剂
Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）
三、实验步骤
清洗层析柱
测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积
根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量
称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS
在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出
关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液
（重复使用的填料，从此步开始）
边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降
等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积
待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口
通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)
始终保护凝胶上端有一段液体
准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切
沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免
将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）
打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子
按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次
加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽
将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）
柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2
其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。[Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000]
四、注意事项
1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。
4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。
五、演示
（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法
1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。
3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。
4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。
5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV 数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。
6. 上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。
7. 测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。
记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。
数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A
（二）部分收集器的操作方法：
1.将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或
“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢"和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。
2.定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或“顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在“顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。
七、背景资料
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。
凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。
图1 凝胶层析的原理
（一）层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用20 -30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm 左右长的层析柱，其直径在1 -5cm 范围内，小于1cm 产生管壁效应，大于5cm 则稀释现象严重。
由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 (一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m 。 ⑴ 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 20－30cm ，柱高与直径的比较 5:1─10:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。 ⑵ 分级分离时柱高与直径之线为 20:1─100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 ⑶ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20 — 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
（二）凝胶的类型
常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下： 种类及主要用途 化学组成 部分 型号 颗粒大小 （/目数） 分离性能（Da ） 溶胀时间/h 20-25℃ 90-100℃
葡聚糖凝胶（Sephadex G-） 由葡聚糖和甘油基通过醚
桥交联而成
G-10 100-200 ＜700 3 1
G-15 120-200 ＜1500 3 1
G-25
50-400 100-5,000 3 1 G-50
50-400 500-30,000 3 1 G-75 120-400 1,000-8,000 24 3 G-100 120-400 1,000-15,000 72 3 G-150 120-400 1,000-30000 72 5
G-200 120-400 1,000-60,000 72 5
聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel p-） 由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成 P-2 50-400 200-1,800 4 2
P-4 50-400 800-4,000 4 2
P-6 50-400 1,000-6,000 4 2
P-10 50-400 1,500-20,000 4 2 P-30 50-200 2,500-40,000 12 3 P-60 50-200 3,000-60,000 12 3 P-100 50-200 5,000-100,000 24 5
P-150 50-200 15,000-150,000 24 5
P-200 50-200 50,000-20,000 48 5
P-300 50-200 60,000-400,000 48 5
琼脂糖凝胶（Sepharose gio-gel ） 由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖 A 0.5m 50-400 ＜10,000-500,000 A 1.5m 50-400 ＜10,000-1,500,000 A 5m 50-400 10,000-5,000,000 A 15m 50-400 10,000-15,000,000 A 50m 50-400 100,000-50,000,000 A 150m 50-200 1,000,000-150,000,000
（三）凝胶的选择
根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2 倍，例如Sephadex G-200 的吸水量为20 ，1 克Sephadex G─200 吸水后形成的凝胶体积约40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200 号筛目的的Sephadex G-200 效果好；脱盐用Sephadex G-25 、G-50 ，用粗粒，短柱，流速快。
（四）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2 小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24 小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（五）样品溶液的处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15 短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
（六）防止微生物的污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
（1）叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02 ％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20 ℃时约为40 %。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。（2）可乐酮[Cl 3C-C(OH)(CH3)2 ] 在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02 % 。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
（3）乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
（4）苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001%-0.01 %。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
除了直接加入抑菌剂，在位消毒（Sanitization-in-place, SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）对层析介质和仪器的保养十分重要。SIP的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。CIP的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP 时，往往已经包含了SIP，不必再重复。新一代Bioprocess凝胶由于拥有很高的化学稳定性，大都可用至1-2M NaOH在位清洗。BioProcess离子交换、疏水层析介质以40cm/h, 用0.5-2M NaOH相反方向洗四个体积，再以最少3cv平衡缓冲液再生。凝胶过滤介质CIP 的方法相同。但流速需减至20cm/h，接触至少一至二小时。SOURCE介质用二至五个柱体积1M NaCl、1M NaOH、1M HCl、1M NaCl 的顺序以180cm/h 洗柱。每个溶液间需用二个柱体积蒸馏水过柱。去除脂类及疏水性强的蛋白, 使用递增式梯度以4~10cv 70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用最
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操 作 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。 ②凝胶介质的处理和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约 1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。 ③上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经μm孔径滤膜过滤或10， 000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为 mol/L；Sephacryl凝胶应为 mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达 mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在 1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。 ⑤分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。
层析柱装柱流程
层析柱装柱流程标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
层析柱装柱流程 装柱材料 层析柱：BXK层析柱装柱仪器：?KTA 装柱器 装柱溶液 20%乙醇 匀浆的准备 精确计算所需介质的量（这对固定柱高的层析柱尤其重要）。1L填充柱所需的介质量大约是1.15L自然沉淀匀浆的量，于干净烧杯中，取 100%沉降胶（静止放置一天以上，倾去20%乙醇后的胶为100%沉降胶）与等体积20%乙醇混合备用。 安装层析柱 1.?检测层析柱的各个部件，确保干净、完整，拧上下端堵头，拧紧膨胀圈，然后 将层析柱垂直固定在铁架台上。 2.?将装柱器安装在层析柱上端。 3.?往层析柱中加入适量的20%乙醇，打开下端口，重力流，排除下筛网中滞留的气 泡，在液面低至1-2cm高度时关闭层析柱下端出口。 装柱 1.?用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将摇匀的介质加入到层析柱中，这可以减少气泡 的产生。迅速用20%乙醇填满柱子和装柱器，装上装柱器盖子，连接到?KTA 上。 2.?打开层析柱下端，开始以30cm/h流速装柱，直至柱床界面平稳。停止装柱。 3.?打开装柱器盖子，用虹吸法去除界面上端的液体，去掉装柱器，然后小心的用 20%乙醇封满柱子剩余部分。 4.?将上端转接头一端连上?KTA，打开机器，以装柱流速用装柱液排出转接头管路 中及筛板中残留的气泡，然后将转接头另一端装到层析柱上，使转接头下端刚好接触胶界面。(装柱流速约为70-100%的最大流速） 5.?拧紧膨胀圈，继续用装柱流速压柱，至少保持3个柱体积，以界面不变为主， 在界面处做上记号。
6.?关闭泵，并关闭柱子下端出口，使层析柱上端和泵断开（转接器上接口是打开 的），略拧松膨胀圈，缓慢向下转动调节杆，到记号处停止，然后再拧紧膨胀圈，关闭上接口。 7. 检测柱效
凝胶渗透柱层析法
凝胶渗透柱层析法 南大生科院基础实验中心庄苏新、罗喜牛 4、试剂与配制： 4-1、试剂： (1)、葡聚糖凝胶 (2)、磷酸氢二钠 (3)、磷酸二氢钠 (4)、血红蛋白 (5)、核黄素 4-2、试剂配制： (1)、磷酸缓冲液（0.05 mol / L,pH 7.4）的配制： 分别称取磷酸二氢钠克；磷酸氢二钠克于一烧杯中，加蒸馏水毫升，搅拌溶解即可。 (2)、样品溶液的配制： 分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升， 搅拌溶解即可(2.0mg/ml)。 5、操作步骤： （1）、选择固定层析柱： 观察层析柱底端过滤及其它部件连接是否完好？将选择的层析柱垂直固定到台式铁架上，关闭柱底端出口，并向柱内注入一定量的平衡缓冲液，然后再打开柱底端出口，排除柱低端和连接出口的塑料管道内气泡，气泡排除完毕，再次关闭柱底端出口，并在层析柱内留有适量的平衡缓冲液。 （2）、装柱方法： 将烧杯中处理好的葡聚糖凝胶，用玻棒充分搅拌成悬浮液，随即用玻棒引流缓缓倒入层析柱中，静置约5分钟（或出现明显分层现象），再打开层析柱底端出口，让其柱内液体流出，同时柱内葡聚糖凝胶此时也向柱底端下沉，当柱床体积表面不下沉时，此时的高度即为柱床体积的实际高度，观其柱床体积高度是否与实验要求相一致。如果柱床体积过高或过低，则需要弃去多余或添加适量的葡聚糖凝胶，但是，无论是弃去多余葡聚糖凝胶还是添加适量的葡聚糖凝胶，首先需要关闭层析柱底端出口。然后用玻棒将柱床体积上部（要有足够的磷酸缓冲液，便于搅匀）1/3处充分搅匀，搅匀后用滴管吸去多余的葡聚糖凝胶或继续添加适量的葡聚糖凝胶悬浮液，如此反复多次操作，直至沉积高度达到实验所需的柱床体积高度为止。同时在装柱过程中要防止柱床流干。柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整等。（3）、平衡方法： 柱装好后，使柱床体稳定5.0—10.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用 2.0倍于床体积的磷酸缓冲液进行充分的平衡。同时也使层析柱床体稳定。平衡完毕，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内平衡缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备加样。 （4）、加样方法： 加样前先启动已调试完毕的色谱工作站（如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置），使整个装置处于工作状态。然后按实验要求吸取1.0毫升样液沿柱管内壁缓缓加入，加样完毕，打开层析柱底端出口，等样液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗涤。（5）、洗涤方法： a、洗涤柱内壁：取少量磷酸缓冲液（与上样量等体积），沿柱内壁四周缓缓加入柱内，加完毕，打开层析柱底端出口，等洗涤液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口。
层析柱使用说明书
目录 一产品介绍 (2) 二产品特点 (2) 三技术参数 (2) 四操作说明 (2) 五操作注意事项 (4) 六售后服务承诺 (5) 七合格证 (5) 八随机附件 (6)
一产品介绍: 层析过程是采用特殊的吸附剂，从植物提取液中选择性地吸附其中的有效部分，去除无效成分的一种分离纯化新工艺。可以解决植提生产中所面临的剂量大、产品吸潮和重金属残留等实际问题。经层析技术处理后所得到的精制物，可使有效成分高度富集，杂质少，提取得率仅为原生物的2～5%，而一般水煮法为30%左右，醇沉法为15%左右；可有效地去除吸潮成分，并增强产品的稳定性；可有效地去除重金属。层析分离工艺所得提取物体积小，不吸潮，容易制成外型美观的各种剂型，尤其适用于颗粒剂、胶囊剂、片剂等的生产。该技术将是对中药提取工艺影响最大、带动面最广的技术进步之一。用于生物工程、制药工业、精细化工领域的分离纯化设计制造的工业制备，具有分辨高、选择性好、流动连续、效率高、处理稳定、样品可多可少、易于操作的特点，适用于含量少的复杂高分子物质的分离纯化，是中草药、化学合成药及生物活性物质有效成分分离提纯的核心设备。 二产品特点: ①合理的高径比，精密的进出口流体分布装置，保证层析柱装填效果和填 料再生效果，为高效分离提供了保障。 ②产品采用不锈钢材料，并进行内外抛光，耐腐蚀、使用寿命长、硬度高、 运输安全，质量有保障。 ③本设备确保无污染、效率高、操作方便等。 三技术参数
四操作说明 层析操作流程一般为：预处理，逆流洗柱，水洗，吸附，解吸、再生等工艺。 1、预处理：在吸附树脂的生产过程中，一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步纯化处理，因此树脂内部往往残留少量单体，致孔剂和其他有机杂质，所以在使用之前必须进行预处理。 吸附树脂预处理方法如下： （1）将准备装柱使用的新树脂，用2倍左右体积的甲醇或其他水溶性溶剂（如乙醇、丙酮）浸泡2小时，并不时搅动，使树脂充分溶胀。 （2）、将已充分溶胀的吸附树脂装柱，以每小时3至4倍床体积的流速，将5至8倍的甲醇或其他水溶性的溶剂（如乙醇、丙酮）通过树脂层，至流出液加水稀释不变混。 （3）、甲醇处理后，以每小时6至8倍床体积的流速将去离子水通过树脂层，置换出甲醇即可投入使用。 2、逆流洗柱：逆流洗柱是用水洗除去水离子及破碎填料，树脂装入交换柱后，用蒸留水反洗树脂层，展开率为50-70%，直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止，再用50%-100%乙醇10-15倍体积慢速淋洗。2、用约2倍体积的4-5%HCl溶液，以2m/h流速通过树脂层。全部通入后，浸泡4-8小时，排去酸液，用洁净水冲洗至出水呈中性。冲洗流速为10-20m/h。 3、用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液，按上面进HCl的方法通入和浸泡。排去碱液，用洁净水冲洗至出水呈中性。流速同上。酸碱溶液若能重复进行2-3次，则效果更佳。经预处理后的树脂，在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量，以保证树脂获得充分的再生。 3、水洗：水洗目的主要是除去层析柱上所附着的渣滓。 4、吸附：吸附操作自上而下(或自下而上)通液，可采用不同流速，以选取最佳条件，一般流速sV 2—8。流出液每间隔一段时间取样检测，达泄漏点
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 2、蛋白质样品洗脱曲线：
生物制药工艺学习题 第七章 凝胶层析
第七章凝胶层析 一、填空题 1、凝胶层析的分离原理有、、。这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下起主导作用；的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时才起作用。 2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而，颗粒强度随浓度上升而。 3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率，多用于等。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率，多用于等。 4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大倍以上的柱体积， 以上的柱比，较吸液量、较粒的凝胶固定相。5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括、、 、。 6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于，其越小，凝胶孔径越；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于。 二、选择题 1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（） A.凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（） A.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（） A.分子量最大的 B.体积最大的 C.分子量最小的 D.体积最小的 4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（） A.观察柱床有无沟流 B.观察色带是否平整 C.测量流速 D.测量层析柱的外水体积 5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（） A.粗且长的 B.粗且短的 C.细且长的 D.细且短的
三、名词解释 1、全排阻： 2、类分离： 3、分级分离： 4、柱比： 5、操作压： 6、全渗入： 7、分离度R s： 四、问答题 1、试述公式V e=V0+K d V i 各字母的物理意义。 2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？ 3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。 第七章凝胶层析（答案） 一、填空题 1、凝胶层析的分离原理有平衡排除理论、扩散分离理论、流动分离理论。这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下平衡排除理论起主导作用；扩散分离理论的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时流动分离理论才起作用。 2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。 3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离等。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，多用于脱盐等。 4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大25 倍以上的柱体积，25 以上的柱比，较大吸液量、较细粒的凝胶固定相。 5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括分子扩散、涡流扩散、流动相中传质阻力、固定相中传质阻力。 6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度，其越小，凝胶孔径越大；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度。 二、选择题 1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（B ） A.凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（A） A.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低
硅胶层析柱的填装方法
硅胶层析柱的填装方法 硅胶层析柱所用的硅胶是试剂级，100-200目，在实验前将10g左右的硅胶放在托盘中，130℃真空干燥箱内活化16h，活化后放在干燥器中冷却，待用。 将无水硫酸钠盛装在托盘中，在450℃马弗炉中活化2h，后取出放在干燥器中冷却，待用。 一、装柱过程： 1、取40ml烧杯4个，100ml量筒2个（分别倒取二氯甲烷100ml，正己烷90ml），40cm玻璃棒1个，250ml烧杯1个（盛装废液用），铁架台1个，层析柱1个（长350mm，内径20mm），不锈钢铁勺1个，20ml注射器（带针头）2个（以上仪器均干净）。 2、拌硅胶。将活化过的硅胶倒入40ml烧杯中，用另一个20ml烧杯盛取二氯甲烷并缓慢倒入硅胶中，同时用玻璃棒不断搅拌，赶走硅胶中的气泡。 3、倒硅胶。用少量二氯甲烷淋洗层析柱，玻璃棒引流；之后将上述拌好的硅胶沿着玻璃棒倒入层析柱，倒完后缓慢抽出玻璃棒。 4、敲柱子。用橡皮管敲击柱子，赶走层析柱硅胶中的气泡，然后打开活塞，流出洗脱液，让硅胶自然沉降；在此期间，用不锈钢小勺舀取一勺无水硫酸钠，倒入层析柱中；等到柱子快干是关闭活塞（二氯甲烷的液面在无水硫酸钠的表面以上）。 5、走柱子。柱子装好后用20ml二氯甲烷冲洗层析柱2次，注意用玻璃棒引流，缓慢倒下二氯甲烷，并打开活塞，使洗脱液缓慢流下，确保液面保持在硫酸钠表面以上，不能流干；再用40ml正己烷冲洗层析柱，待液面在硫酸钠以上些许时关闭活塞。 6、层析柱至此装好，待用。 二、样品走柱子过程： 1、将样品液转移到装好的层析柱中后，用1-2ml正己烷清洗鸡心瓶，并转移到层析柱内，流出液弃去。 2、用25ml正己烷洗脱层析柱，弃去流出液，关闭活塞。 3、将盛装废液的烧杯移去，将K-D浓缩瓶接在层析柱下，再用30ml二氯甲烷/正己烷淋洗液（体积比2:3）洗脱层析柱，以2-5ml/min流速接收流出液于K-D 浓缩瓶中。 仪器名称规格数量 烧杯40ml 4个250ml 1个 量筒100ml 2个玻璃棒40cm 1个铁架台1个层析柱350mm×20mm 1个不锈钢小勺1个注射器20ml 2个
葡聚糖凝胶G-25的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
凝胶层析.
凝胶层析 简介 凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图11 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 凝胶层析的基本概念 1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 如图3－6 所示，外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi 设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，
葡聚糖凝胶 Sephade LH 使用说明及使用心得
葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 使用说明 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 Sephadex LH-20适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5－7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。 LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为
离子交换层析柱的装填及处理
离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。
四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点 (一) 基本原理 凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+ Vi 时出现洗脱峰。 (二)凝胶的类型及性质 1.交联葡聚糖凝胶 交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。在中性条件下，交联葡
层析柱使用方法
层析柱使用方法 层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 1：装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱：则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 2：上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分 配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得 最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦， 就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂 洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
凝胶层析柱特性测试
凝胶层析柱特性分析 （实验报告） 实验日期：2015年4月21日实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：****** 班级：2013级生物技术1班姓名：***** 学号：****** I. 实验目的 1.掌握凝胶层析柱的基本原理； 2.学习凝胶层析柱的操作技术； 3.了解凝胶层析柱的应用。 II. 实验原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。 在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从
柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。 为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数K d来衡量，K d的定义为： i o e d V V V K - = 式中V e ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起， 到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积； V o ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积， 又称凝胶外水体积； V i——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。 洗脱体积V e与V o及V i之间的关系可表示为： V e=V o+K d V i 当某种成分的K d值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即V e=V o。可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分 子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积V o。 当另一种成分的K d=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，V e=V o+V i。 处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分
离子交换层析柱的装填及处理
一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如： R-SO3H＋M+ ————R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－—————R-NH3CL＋OH－ 这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1.2cm，3# 砂芯。 HL-2型恒流泵。 HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。 BS-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。 四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0.45N，PH5.3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸（C6O7H8?H2O）；186g 97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%） 显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。 B、将2.5ml 0.01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时，A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。将经处理已成钠型的树脂置于烧杯中，加进1倍体积的柠檬酸缓冲液，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底逐渐沉积至约1cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬浮液的温度要相对恒定（特别是
凝胶层析实验步骤及细节
温州大学第四届生物学科实验技能大赛 血清凝胶层析 实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告 实验时间： 5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。下午1:30开始血清离心操作及层析操作。 实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具 实验后：清理实验器具 凝胶层析的实验步骤
实验试剂和用品 1. 试剂 Sephandex 4B 凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水 2. 主要实验用具 铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）<多孔板、筛板>（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒 凝胶层析定义 凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 实验原理 不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 凝胶柱的制备 在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。