FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建

FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建

目的设计并构建靶向甲酰肽受体FPR基因的shRNA 慢病毒表达载体并鉴定。方法根据GenBank数据库提供的FPR基因序列，设计合成针对FPR的shRNA序列，构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体，并通过测序鉴定。结果成功构建的重组质粒测序结果与Genebank 中的FPR cDNA 序列相符。结论构建FPR基因shRNA干扰载体，为该基因的相关实验研究提供载体。

Abstract：Objective To construct and identify FPR shRNA lentiviral vector. Methods Genome sequences of FPR gene was retrieved from Genebank. The shRNA sequences for FPR were synthesized and cloned into PDS019_pL/shRNA/GFP/F to generate shRNA lentiviral vector. The recombinant vectors was identified by sequencing.Results The sequence identified by sequencing were the same as the targeting one. Conclusion The constructed FPR shRNA lentiviral vectors were constructed，which may be used for the further research the role of FPR in the malignant behavior of the cancer.

Key words：FPR；Vector construction

甲酰肽受体（Formyl peptide receptor，FPR）在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。设计并构建针对FPR基因的RNA 干扰靶点慢病毒载体，为后续研究FPR在恶性肿瘤生物学行为中的影响提供基础。

1资料与方法

1.1一般资料PDS019_pL/shRNA/GFP表达载体购自诺百生物科技（上海）有限公司。BsmbⅠ内切酶、EcoRI内切酶、T4DNA ligase 及GeneRuler DNA Ladder购自Fermentas公司；质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Ayxgen公司；大肠杆菌STBL3 菌种购于TaKaRa公司；引物Oligo由Invitrogen公司合成；10×Oligo Annealing Buffer購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1利用在线软件设计并合成针对人类FPR的基因序列的干扰靶序列。

1.2.2干扰序列退火成双链DNA。在PCR扩增仪上进行退火反应，退火条件：95℃，5 min；72℃，5 min；自然降温至PCR的Block温度（25℃）。

1.2.3 PDS019_Pl/shRNA/GFP干扰慢病毒骨架载体经BsmbⅠ、EcoRI双酶切后，按照Axygen胶回收试剂盒说明进行胶回收。纯化后的酶切载体进行OD质检并定量。

1.2.4 PCR酶切产物与线性化的干扰骨架载体过夜连接。

RNA干扰shRNA原理及设计

RNA干扰/shRNA原理及设计 RNAi概述：RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA 发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 RNAi基本原理示意图：

RNAi类别： 1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。 化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA 有效片段的筛选。 2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA(miRNA),后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。

GenePharma shRNA表达载体使用说明书

GenePharma shRNA 表达载体使用说明 RNA干扰实验设计 在使用载体法针对某一基因进行RNＡ干扰研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因抑制效率的检测。 1、实验对照组的确立 在一个完善的RNA干扰实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。通常，这些对照组包括阴性对照、阳性对照、转染试剂对照。 阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（shNC），可以表达与目的基因序列无同源性的siRNA片段；另一种是将目的siRNA的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。 阳性对照组的设立对于RNA干扰研究是很有必要的，尤其对于第一次接触RNA干扰的用户而言。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。阳性对照通常采用已验证的对某些基因有效抑制的siRNA片段。本试剂盒中包括针对人GAPDH基因的表达载体（shGAPDH），该载体在导入细胞中后，可以有效抑制GAPDH基因的表达。上海吉玛还向用户提供其他的阳性对照以资选择，详细情况请参见本公司的产品目录或《RNAi产品使用手册》。 2、细胞转染条件的确定 使用DNA载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA的导入情况。最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。上海吉玛公司提供的shRNA表达载体有一部分载体中包含绿色荧光蛋白的表达框架，转入细胞后可以表达绿色荧光蛋白，是用荧光显微镜或流式细胞仪可以很容易的确定转染效率；如果您所定购的载体中不含绿色荧光蛋白的表达框架，您可以先使用可以表达绿色荧光蛋白的表达载体来确定转染效率和转染条件，然后使用同样的条件来转染shRNA表达载体。 还用一种方法可以用于确定转染条件，就是采用阳性对照载体来转染细胞（如shGAPDH），检测对照载体对基因的抑制效率，然后采用抑制效率较高时的转染条件来进一步转染shRNA表达载体。 3、基因抑制效率的检测 通常用两大类方法来检测RNA干扰对目的基因表达的抑制效率，一类方法是直接检测目的基因在不同水平如mRNA和蛋白水平的变化，具体的方法如qPCR和Western杂交等；另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。通常在有效片段筛选过程中多选用qRT-PCR和western杂交等方法直接检测目的基因的变化情况，可以很直观地反映基因的真实情况，不过也有一部分研究人员通过检测细胞效应如细胞增殖速率等指标间接反映基因变化。 RNA干扰实验操作 由于在RNA干扰实验中有多种条件选择如试剂和细胞株等，在本实验操作中以shNC为阴性对照，shGAPDH为阳性对照，RNAi-Mate为转染试剂，Hela细胞为实验细胞株，按照上述条件分步阐述RNA干扰实验的操作过程。如果用户使用不同的细胞株和转染试剂，可根据吉玛公司的《RNAi产品使用手册》进行相应的调整。 1 转染条件的确定 如果您选用可表达绿色荧光蛋白的pGPU6/GFP/Neo或pGPH1/GFP/Neo载体，可以直接用这些载体来确定转染效率；如果选用其他载体，可用其他表达绿色荧光蛋白的载体来确定转染条件，或使用阳性对照载体如shGAPDH来去确定转染条件。 选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。DNA 的用量及其与转染试剂的比例可在推荐范围内适当调整。1、转染前一天，接种0.4-1.0×105细胞/孔至24孔板中，加入500μl含血清培养液，37oC 5% CO2培养至40-70%融合。 2、在50 μl Opti-MEM I培养液或其它无血清培养液中加入0.5-0.8μg DNA，混匀。 3、使用前轻轻混匀RNAi-Mate试剂，切忌离心处理。用30μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1-4μg RNAi-Mate试剂（可以分别设立DNA/RNAi-Mate的不同用量组，通常DNA 和RNAi-Mate的用量在1：2-1：5范围内，针对不同的细胞需要不同的用量），轻轻混匀，室温放置5分钟。 4、将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合，定容到100μl；轻柔混匀，室温放置30分钟，以便形成siRNA/RNAi-Mate（或DNA/RNAi-Mate）复合物。 5、将100μl DNA/RNAi-Mate复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板，使DNA/RNAi-Mate混合物均匀覆盖细胞。 6、细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。 7、如果使用可以表达绿色荧光蛋白的DNA载体来检测细胞的转染效率，细胞转染后24-48 h后，使用荧光显微镜观察计数表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场观察计数同一视野中的总细胞数，转染细胞率=荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%。或使用DAPI等染料染核后，使用流式细胞仪进行计数，然后计算转染效率。 8、也可使用阳性对照的抑制率来标定转染效率。例如使用shGAPDH来抑制细胞内GAPDH基因的表达，如果转染效率较高，shGAPDH对GAPDH基因的mRNA和蛋白水平的抑制率通常分别为50-90%和50-90%。反之，如果shGAPDH对GAPDH基因表现出较高的抑制率，也表明细胞的转染效率较高，可以满足进一步实验需要。 9、如果在转染条件摸索实验中没有找到较高效率的转染方法，请更换转染方法和试剂。如无其他方法选择，可以使用流式细胞仪将转染的细胞分选出来用于后续实验。如果无法分选细胞，可以在计算RNA 干扰抑制效率时去除转染效率的影响，也可以使用抗生素对转染后的细胞进行初筛后再进一步检测抑制效率。 2 细胞的转染1、设定合理的实验组，包括转染试剂对照（mock transfection）、阴性对照(negative control)、阳性对照（positive control）和目的基因实验组。 2、按照前面实验确定的细胞接种量接种。37oC 5% CO2培养至40-70%融合。 3、按照前面实验确定的转染条件转染细胞。如果需要转染不同培养量的细胞，试剂的用量可以根据本公司《RNAi产品使用手册》第9页和第13页所述进行相应的变化。 4、转染后24-48h后，收集细胞进行下一步的检测工作。通常，目的基因在转染后24-48h内就会表现出表达抑制，但有一些蛋白比如稳定性较强、半衰期较长的蛋白在转染后含量降低比较缓慢，所以需要延长检测时间。 3 基因抑制效率的检测1、在本公司的《RNAi产品使用手册》（14页-19页）中较详细地介绍了使用荧光定量PCR技术和Western blot方法检测目的基因表达变化的操作步骤和注意事项，用户可以酌情选用。 2、用户也可选用其他间接的方法（如目的基因的生物学功能或细胞生物学特性的变化）来检测目的基因的抑制情况。鉴于这方面的检测手段多种多样，需要用户自己进行选择，在此不再赘述。

两种方法研究不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰效应

江西农业学报2010，22(10)：118—121A c t a A 鲥cul t urae Ji angxi 两种方法研究不同茎部长度串联s hR N A 表达 载体对E G FP 基因的干扰效应 肖红卫1，刘中华2，刘西梅1，郑新民H ，乔宪凤1，李莉1 (1．湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室，湖北武汉430064； 2．西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌712100) 摘要：目的：旨在观察不同茎部长度串联s hR N A 表达载体对EG FP 基因的干扰作用。方法：采用体外培养的V et o 细胞，选用不同茎部长度串联s hR N A 表达载体+E G FP 表达栽体+脂质体转染的方法。将构建好的干扰载体转染V et o 细胞，然后使用实时荧光定量R T —PC R 对其沉默效应进行定量分析。在小鼠腿部肌肉注射干扰质粒，实时荧光定量R T —PC R 对其沉默效应进行定量分析。结果：转染V ero 细胞时，pG enes i l R 21、pG enes i l R 27和pG enes i l R 29荧光表达量仅为对照质粒pEG FP —C l 的4．3％、3，O ％和6．9％；小鼠腿部肌肉注射干扰质粒时，pG enes i l R 21、pG enes i l R 27和pG enes i l R 29荧光表达量仅为对照质粒pE G FP —C 1的2．5％、1．3％和5．1％。结论：在细胞和个体水平，不同茎部串联干扰载体对目的基因的抑制效应均很明显(达到90％以上)，比单一位，最产生的沉默效应要强许多，不同茎部长度干扰效应彼此间差异不显著。 关键词：s hR N A 表达裁体；V er o 细胞；脂质体；E G FP 表达载体；转染 中图分类号：Q TS6文献标识码：A 文章编号：100l 一8581(2010)10—0118—04 St udy on Si l enc i ng E f f e ct of T andem s hR NA E xpr ess i on —-vect or s E m br ac i ng D i f i er ent St em s on E G FP G ene bv T w o M et hods X I A O H ong —w e i ‘，U U Zho ng —h na2，U U X i —m ei l ，Z H E N G X i n —m i nl ’，Q IA O X i an —f en91，L I L i l (1．I nst i t ut e of A ni m al H us ba ndr y a nd V et er i nar y S c i enc e ，H ube i A cadem y of A gr i eulr ur al Sc i ences ：K e y Lab of 胁m s ／Em br yo En- gi neer i n g a nd M o l ecu l ar B r eedi n g of H ubei P r ovi nce ，W uhan430064，C hi na ；2．C ol l ege of V et er i nar y ，N or t hw est Sci —t e ch U ni ver s i -t y of A gr i cul t u r e a nd For es t r y 。Y ang l i ng 712100。Chi na ) A bs t r a ct ：I n or der t o st udy t he s i l enci ng e ff e ct of dif f erent s hRN A expr essi on —vect or s on E cFP ge ne 。i n vit r o cult i vated V er o ee l h w el D g used ，dif f er ent sh R N A expre ssi on —vec t or s ．E G 即expre ssi on —vec t or s a nd l i posom e w er e m i xed a nd t r ans f ected i nt o V e r o cel l s ．and t hen t he f l uor es cence quan t i t ati ve R T —P C R m e t hod w a s us ed t o det ect t he s i l enci ng eff ect of sh R N A expr e ssi on —vec t or s o n E 卿gene ．The f l uor escence quan t i t ati ve R T —P C R m e t hod W a s al so use d t o detect t he s h R N A ’S e ffe c t of gen e s i l ence aft er t he pl as ．Il l i ds w er e i nj ect ed i n t o t he l e g m u gcl e of rnon ∞．‰r esult s show ed t hat ：(1)The E G FP expr es s i on of pG enesi l R21。pG e ne si l R 27and pG e ne si l R 29W as r es p ect i v el y r egul at ed dow n t o 4．3％。3．0％and 6．9％of t he cont r ol pl asm i d pE G FP —C I aft er be i ng tr ansf ec t ． ed t o V e r o c ei l s ．(2)nl e E G _肿expre ssi on of pG enes i l R21，pG e ne si l R 27and pG enes i l R29W as r es p ect i v el y r e du ced t o 2．5％．1．3％and 5．1％of pE G FP —C I aft er bei ng i nj ect ed i nt o t he l eg m u scl e of m ouge ．T he s e r esul t s i ndi eat ed t ha t t he t a ndem s hRN A had a si g-nif i can t s i l en ci ng e ff e ct t o E G FP ge ne and i nh i bi ted t he gen e expr e ssi on do w n t o 10％．a nd t he dif f erent s h R N A ?ha d no s i g ni f icant di f f erence i n t he s i l en ci ng effec t ． ’ K e y w o r ds ：shR N A expr es s i on vect or ；V er o ce l l s ；L i posom e ；EcFP expr es s i on vect or ；T r ans f eet i on R N A 干扰(R N Ai nt er f erence ，R N A i )是将双链R N A R N A (shR N A )…。前者只能引起短暂的干扰效应，而后(ds R N A )导入细胞引起特异基因m R N A 降解的一种细 胞反应过程。它是转录后基因沉寂(PT G S)的一种¨J 。。 1998年，Fi r e 等旧。发现由正义和反义R N A 退火形成的 ds R N A 引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义 R N A 强10倍以上。目前，在哺乳动物细胞中，主要应用 两种相关的技术来实现R N A i 。一种方法是向哺乳动物细胞直接转染人工合成的长度为19bp 并且3’端具有2个突出碱基的小干扰RN A (s i R N A )，另一种方法是用表达质粒或者病毒载体在哺乳动物细胞中表达小发卡 者可以获得稳定而持久的基因沉默。s hR N A 表达载体虽然可在哺乳动物细胞及个体水平产生稳定而持久的干扰效应垆40，但目前普遍采用的单位点shR N A 干扰载体效果并不理想。已有研究将设计好的多条shR N A 序列克隆到同一载体上不同启动子之后，可以获得比单位点 干扰载体更强的沉默效应。 本试验针对EG FP 基因，设计不同茎部长度(21、27、 29 bp)的shR N A 干扰序列各4条，然后将同一茎部长度 的4条序列克隆到同一表达载体的不同启动子之后，构 St gU 3期：2010—0r 7—06 ． 基金项目：国家自然科学基金项目(30671495)；湖北省国际合作项目(2009B FA 012)；动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课 题(20I O ZD l 03)。作者简介：肖红卫(19r 79一)，男，江苏大丰人，助理研究员，研究向：转基因动物。刘中华(1980一)，男，河南沁阳人，在读博士生，研究 向：动物生物技术。肖红卫、刘中华同为第一作者。+通讯作者：郑新民。

shRNA原理及设计

shRNA原理及设计 RNAi概述：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。RNAi基本原理示意图：

RNAi类别： 1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。 化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。 2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA (miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。

干扰载体构建SOP

shRNA干扰载体构建SOP 目录 第一部分RNA干扰原理及shRNA设计 2 第二部分酶切与回收 6 第三部分退火与连接7 第四部分转化与涂平板9 第五部分挑菌与菌液PCR 11 第六部分质粒提取13

第一部分RNA干扰原理及shRNA设计 标准操作规程(SOP) 1.目的： 了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列 2.仪器与设备： 需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5)。 3.操作步骤 3.1RNA干扰原理 1)RNAi概述：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 2)RNAi原理：RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶 段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 3)RNAi示意图(见图1) 3.2shRNA设计 1)shRNA: 即short hairpin RNA(短发卡RNA) ，包含两个短反向重复序列(其中一个与目的

pLKOshRNA病毒质粒载体构建protocol方法详解

Search for Plasmids: Home Deposit Plasmids Request Plasmids Information Browse Search Pricing FAQ Protocols > pLKO.1 Protocol pLKO.1 - TRC Cloning Vector Addgene Plasmid 10878. Protocol Version 1.0. December 2006. Copyright Addgene 2006, All Rights Reserved. This protocol is provided for your convenience. See warranty information in appendix. Click here for a printable copy. Table of Contents ? A. pLKO.1-TRC Cloning Vector o A.1 The RNAi Consortium o A.2 Map of pLKO.1 o A.3 Related plasmids ? B. Designing shRNA Oligos for pLKO.1 o B.1 Determine the optimal 21-mer targets in your gene o B.2 Order oligos compatible with pLKO.1 ? C. Cloning shRNA oligos into pLKO.1 o C.1 Recommended materials o C.2 Annealing oligos o C.3 Digesting pLKO.1 TRC-Cloning Vector o C.4 Ligating and transforming into bacteria ? D. Screening for Inserts o D.1 Recommended materials Plasmid Cart Your cart is empty. Recently Viewed pLKO.1 - TRC clo... Plasmid 10878 pLVTHM Plasmid 12247 Mammalian RNAi T... Collection

RNA干扰载体的构建的实验流程

RNA干扰载体的构建的实验流程 RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI 系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。 产品技术背景 pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。 插入寡核苷酸设计 pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。 1. 选择干扰序列 在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列： 推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。 RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。 RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。 确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。 设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可以为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是，值得注意的是，遵循这些原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对一个目标基因，我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。 2. 寡核苷酸设计。 （1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。 a) 5’TCGACCC b) 19nt干扰序列正向序列(与目标mRNA一致)。 c) TTCAAGAGA(环状结构)。

FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建

FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建 目的设计并构建靶向甲酰肽受体FPR基因的shRNA 慢病毒表达载体并鉴定。方法根据GenBank数据库提供的FPR基因序列，设计合成针对FPR的shRNA序列，构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体，并通过测序鉴定。结果成功构建的重组质粒测序结果与Genebank 中的FPR cDNA 序列相符。结论构建FPR基因shRNA干扰载体，为该基因的相关实验研究提供载体。 Abstract：Objective To construct and identify FPR shRNA lentiviral vector. Methods Genome sequences of FPR gene was retrieved from Genebank. The shRNA sequences for FPR were synthesized and cloned into PDS019_pL/shRNA/GFP/F to generate shRNA lentiviral vector. The recombinant vectors was identified by sequencing.Results The sequence identified by sequencing were the same as the targeting one. Conclusion The constructed FPR shRNA lentiviral vectors were constructed，which may be used for the further research the role of FPR in the malignant behavior of the cancer. Key words：FPR；Vector construction 甲酰肽受体（Formyl peptide receptor，FPR）在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。设计并构建针对FPR基因的RNA 干扰靶点慢病毒载体，为后续研究FPR在恶性肿瘤生物学行为中的影响提供基础。 1资料与方法 1.1一般资料PDS019_pL/shRNA/GFP表达载体购自诺百生物科技（上海）有限公司。BsmbⅠ内切酶、EcoRI内切酶、T4DNA ligase 及GeneRuler DNA Ladder购自Fermentas公司；质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Ayxgen公司；大肠杆菌STBL3 菌种购于TaKaRa公司；引物Oligo由Invitrogen公司合成；10×Oligo Annealing Buffer購自Invitrogen公司。 1.2方法 1.2.1利用在线软件设计并合成针对人类FPR的基因序列的干扰靶序列。 1.2.2干扰序列退火成双链DNA。在PCR扩增仪上进行退火反应，退火条件：95℃，5 min；72℃，5 min；自然降温至PCR的Block温度（25℃）。 1.2.3 PDS019_Pl/shRNA/GFP干扰慢病毒骨架载体经BsmbⅠ、EcoRI双酶切后，按照Axygen胶回收试剂盒说明进行胶回收。纯化后的酶切载体进行OD质检并定量。 1.2.4 PCR酶切产物与线性化的干扰骨架载体过夜连接。