实验四 血涂片的制备与染色
实验四血涂片的制备与染色
【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。
【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。
【器材】
1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。
2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。
3．吸耳球。
4．显微镜。
5．酒精灯或Bunsen灯。
6．采血针。
7．注射器和针头。
【试剂】
1．瑞氏（Wright）染液
（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml 甘油密闭保存。
（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。
2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。
3．瑞-吉复合染液
（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min，共5d，以后存放1周即能使用。
（2）Ⅱ液：即磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。
【标本】 EDTA抗凝静脉血或末梢血。
【操作】
1．采血
（1）静脉采血法：用EDTA·K2抗凝1～2h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm。
（2）皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备。
2．制作涂片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方移动接近血滴，使血液沿推片边缘展开，将推片与载玻片呈30°～45°角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片（图1-12），血涂片应呈舌
状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完。贫血病人推片速度要快。
图1-12 血涂片制备示意图
3．干燥涂片
（1）空气干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。
（2）加热干燥：握住涂片，在距离酒精灯或Bunsen灯火焰上方50mm处晃动，但不能直接对着火焰。
4．标记涂片在载玻片的一端用记号笔编号，注明患者姓名或门诊/住院号。
5．染色
（1）瑞氏染色法：待血涂片干透后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。然后将玻片平置于染色架上，滴加染液（I液）3～5滴，使其迅速盖满血涂片，约0.5～1min后，滴加等量或稍多的缓冲液（Ⅱ液），轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合。5～10min后用流水冲去染液，待干。
（2）吉姆萨染色法：将固定的血涂片置于被pH6.4～6.8磷酸盐缓冲液稀释10～20倍的吉姆萨染液中，浸染10～30min（标本较少可用滴染）。取出用流水冲洗，待干燥后显微镜检查。
（3）瑞一吉复合染色法：操作步骤同瑞氏染色法，只是染色时将瑞一吉复合染液Ⅰ液和Ⅱ液替代瑞氏染液的Ⅰ液和Ⅱ液。
6．观察结果将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。
【注意事项】
1．瑞氏染液新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。
2．采血
（1）不能采集以下部位的血液：①示指或拇指血液。②感染部位血液，如甲沟炎。③耳垂部位血液，含单核细胞太多。
（2）不能使用肝素抗凝标本。
（3）玻片必须清洁、干燥、无尘。①新玻片：应在清洁液中浸泡过夜，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。②已用过的玻片：应在60℃清洁液中加热20min，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。③边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。
（4）使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。
3．制作涂片许多因素可影响血涂片的厚度，针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。涂片质量不佳及可能原因见表1-1，图1-13。
表1-1 涂片质量不佳及可能原因
涂片质量不佳可能原因
不规则间断和尾部太长推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏
有空洞载玻片污染脂肪、油脂
白细胞和血小板尾部分布不规则制片技术差
涂片太长或太短推片角度不佳
涂片没有尾部血滴太大
涂片很短血滴太小
涂片没有边缘空隙推片太宽
有细胞退变现象固定延迟、固定时间太短、甲醇污染
血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快
白细胞破损推片时用力过猛
图1-13 血涂片质量比较
（A为涂片质量好，B、C、D、E、F、G、H、I为涂片质量差）
4．干燥涂片血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。
5．染色步骤
（1）操作注意事项及操作不当的后果见表1-3。
表1-2 染色操作注意事项及操作不当的后果
操作注意事项操作不当的后果
加染液应适量过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使
细胞深染不易检查。
冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗染料沉着在血涂片上
冲洗时间不能过久脱色
冲洗完的血涂片应立放于支架上剩余水分浸泡脱色
（2）染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间，特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。
6．结果观察低倍镜下观察血涂片应厚薄适宜，细胞不重叠，头尾及两侧有一定的空隙，一些体积大的特殊细胞常在血涂片的尾部出现。如有可能，干燥后的血涂片先用中性树胶封片后再观察，不仅能长期保存血涂片，而且观察效果更佳。染色质量不佳及原因见表1-3。
表1-3 染色质量不佳及可能原因
染色效果可能原因纠正措施
太蓝涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳
光在含1％硼酸的95％乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检
太红冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不
佳、涂片干燥前加封片
规范操作。新鲜配置中性水。保证染液质量不佳
太淡染色时间太短、冲洗时间太长复染。应先加缓冲液，后加染液，或加染液与缓冲液
的混合液，不可先加染液
染料沉积染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏用甲醇冲洗2次，并立即用水冲掉甲醇，待干后复染蓝色背景固定不当、涂片未固定贮存过久、使用肝素抗凝剂注意涂片的固定。使用EDTA抗凝静脉血
血涂片及骨髓涂片的制片与读片
血涂片及骨髓涂片的制作与读片 潘志强 2006-3-30 实验准备 一．器材： 载玻片：每只动物一块 盖玻片：每只动物一块 滴管：4个 橡皮吸头：4个 中号镊子：4把 大剪刀：4把 眼科镊：4把 玻璃棒：4根 烧杯：1000 ml，2个 量筒：100ml、500 ml、1000 ml各一 蜡笔 棕色小口瓶 碾钵 载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。 二．试剂： 瑞氏染液240ml 瑞氏染料粉剂0.1g 纯甲醇（AR）60ml 将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。染料存放越久，染色效果越好。 磷酸盐缓冲液 1%KH2PO4 30ml 1%Na2HPO4 20ml ，定容至1000ml。 甲醇 鸡蛋清：蒸馏水与鸡蛋清按1/1的比例稀释。 中性树胶：如果中性树胶过于粘稠，可将中性树胶与二甲苯按7/3的比例稀释。 二甲苯
实验步骤 一．涂片 （一）血液涂片的制作 （1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。 （2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。 （3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。 （4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。 （5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。 （6）每只动物涂片一张。 （7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。 （8）置30min～1hr后较利于观察红细胞的形态。 注意事项： ●如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。 ●载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不 是30°而是35°～40°左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。 ●如用力过猛白细胞容易破损。 （二）骨髓涂片的制作 用手术剪刀剪掉大腿部的肌肉，充分暴露股骨，再用大剪刀从上端剪断第2股骨，用中号 镊子夹股骨以挤出骨髓，如果骨髓不易取出，可用直头眼科镊插入骨髓腔挑出骨髓，置骨髓于 一载玻片上，由于骨髓液的纤维蛋白原含量较高，易于凝固，可先在骨髓液内加5~10倍的稀 释后鸡蛋清，充分混匀，取1滴至另一载玻片上，涂片。涂片方法同血液涂片，但推片要快并 迅速使之干燥。每只动物涂片一张。 二．染色 （一）血液涂片的染色 （1）将待染涂片平放于染色架上。 （2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置1～3分钟。 （3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色5～10分钟（白细胞数多或骨 髓标本时间应长一些，如20～30min）。 （4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。 （5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。 （6）甩干或晾干玻片。 （7）封片。 （二）骨髓涂片的染色 同血液涂片。
实验四 血涂片的制备与染色
实验四血涂片的制备与染色 【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。 【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。 【器材】 1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。 2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm 宽度的推片。 3．吸耳球。 4．显微镜。 5．酒精灯或Bunsen灯。 6．采血针。 7．注射器和针头。 【试剂】 1．瑞氏（Wright）染液 （1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油密闭保存。 （2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。 2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。 3．瑞-吉复合染液 （1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min，共5d，以后存放1周即能使用。 （2）Ⅱ液：即磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。 【标本】 EDTA抗凝静脉血或末梢血。 【操作】 1．采血 （1）静脉采血法：用EDTA·K2抗凝1～2h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm。 （2）皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备。
实验一 血涂片的制备
实验二、血涂片的制备和血细胞的观察 目的要求 1.掌握血涂片的的制备方法 2.认识红细胞及各种白细胞的典型形态 基本原理 涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。 实验用品 1.器材：医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片； 2.试剂：Wright’s染液：Wright’s色素粉末0.1g，溶于60 ml甲醇。 方法与步骤 1．采血采血前用70％酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后，刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核白细胞较多）。 2．涂片挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以45°为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（图2-2）。推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀，初学者可把玻片放在桌上操作。 3．染色待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wright’s染液盖满血膜为止，染色1～3 min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置2～5 min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干。 4．镜检显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核，淡红色，缘部分染色较深，中心较浅，直径7-8微米。白细胞数目少，为圆形。 颗粒白细胞（1）嗜中性颗粒白细胞：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1-5叶，直径10-12微米；（2）嗜酸性颗粒白细胞：略大于嗜中性白细胞，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色，直径10-15微米；（3）嗜碱性颗粒白细胞：体积略小于嗜酸性白细胞，细胞质中有大小不等被染成紫色的颗粒，颗粒数目较嗜酸性白细胞的颗粒少，核1-2叶，染成淡蓝色，直径10-11微米。 无颗粒白细胞（1）淋巴细胞：可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红细胞大小相似，圆形，核致密，染成深紫色。周围仅一薄层嗜碱性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，核圆形。直径6-8微米。（2）单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14-20微米。 血小板为不规则小体，直径2 - 3微米。其周围部分浅蓝色，中央有细小的紫红色颗粒，聚集成群。 实验报告内容 绘制人血涂片镜下图
血涂片制作
血涂片制作 将血标本均匀地涂抹在清洁干燥的载玻片上，经染色后在显微镜下检查，这是血细胞形态学检查的基本方法，临床应用很广，特别是对各种血液病的形态学诊断很有价值。但是，如果血徐片制备不良，染色不佳，常使血细胞的形态学鉴别和诊断发生困难，甚至导致错误的结论。如血膜过厚，细胞重叠缩小；血膜太薄，白细胞多集中于边缘。因此，制备厚薄适宜、分布均匀的血涂片是血液学检验的基本技术之一。 一、载玻片的清洁 新载玻片上常有游离碱质，必须用约lmol／L HCI浸泡24h 后，再用清水彻底冲洗，干燥备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或合成洗涤剂的清水中煮沸20min，再用热水将肥皂和血膜洗净，用清水反复冲洗，干燥备用。如急用载玻片，可将其置0、9乙醇中浸泡lh，用蒸馏水洗净后，擦干或烘干备用。使用载玻片时，只能手持玻片边缘，切勿用手触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 二、制作血涂片的标本 血涂片既可由非抗凝的静脉血和毛细血管血制备，也可由
EDTA抗凝血制备。EDTA抗凝血中，钙离子被螫合后，能阻止血小板聚集，推片时血小板均匀平铺，显微镜下易于对血小板进行观察评价。但有时可观察到因EDTA引起的红细胞皱缩及白细胞丛集现象。但随着血液分析仪的逐步普及，血标本多为EDTA抗凝血，除作全血细细胞计数及多参数分析外，制备血涂片也非常方便，虽有上述弊端，但显微镜下易于发现。 三、血涂片的制备 血涂片的制备方法很多，如手工推片法、自动推片法、载（盖）玻片压拉法、旋转涂片法、棕黄层（buffy－coat）涂片法及厚血膜涂片法等，现介绍如下。 1、手工推片法取血标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持25～30o的平面夹角，平稳地将血向前推动，血液即在载玻片上形成一薄层血膜。将制成的血膜在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。 一张良好的涂片，要求厚薄适宜，头体尾分明，边缘整齐，两侧应留有空隙。玻片的一端应留有贴标签的地方。涂片的好坏与血滴大小、推片与载片之间角度、推片时的速度有关。血滴大、角度大、速度快，则血膜厚；反之则血膜薄。血膜分布不匀，主要是推片边缘不齐、用力不匀或载玻片不清洁
血涂片的制备及染色
血涂片的制备及染色 摘要 血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。 关键词：血涂片制备，染色 前言 血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室血细胞计数板的指导方针。本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。 列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。 为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。 血涂片制备 载玻片 载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。典型玻片为75×25mm，约有1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。 最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。 载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。载玻片可以是平面的或有磨砂或涂层面以供书写。与有直角边缘的载玻片相比，圆边或有破口的载玻片使用上更安全，降低了皮肤和手套割破或刺破的几率。 载玻片的清洗 脏的载玻片需浸透在60℃的清洁剂中清洗15-20分钟，然后用热水冲洗并干燥。新载玻片需置于重铬酸钾洗涤液中（20g Cr 2 K 2 O 7 溶于100mL水并加入900mL浓硫酸）48小时。之后用流动自来水彻底冲洗。载玻片应保存于95%甲醇中，使用前小心擦拭干净并干燥。 血涂片制备方法 典型的血涂片制备方法是：人工（楔入，盖玻片），半自动（楔入，旋转），以及自动（楔入）。 楔入法（“推”） 人工、半自动及自动化环境中常用此法。若正确使用楔入法，可有足够大的区域供显微镜检测使用：这种区域中所有的细胞彼此几乎不接触或分离（单层部分）。对于显微镜检查来说，涂片上距推动起始处最远的部分会很薄（导致产生形态改变），然而距推动起始处邻近的部分会很厚。 自动化装置能够制得优质的血涂片，比通过人工方法得到的血涂片相比更具一致性。楔入法制备的主要问题是不同类型细胞的不均匀分布。特别是单核细胞（以及其他大的白细胞）被推向铺展膜（“羽状”边缘）底部以及两侧。与以单克隆抗体为基础的流式细胞术分类计数仪相比，
血涂片与分类流程
血涂片与分类流程Revised on November 25, 2020
血涂片和分类计数的质量控制流程1、目的： 规范血涂片评价和分类计数的质量控制管理流程，确保检验质量。 2、适用范围： 检验科门诊化验室、细胞室 3、职责： 检验科门诊化验室、细菌室检验人员均须熟知并遵守本程序。 4、质量控制流程： 血涂片的制备 玻片：保持中性、洁净、无油腻 制备血涂片：血涂片外观应头、体、尾分明，分布均匀，边缘整齐，两侧留有空隙。血膜外观应厚薄适宜。血膜厚度、长度和血滴的大小、推片与玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。一般血滴大、角度大、推片速度快则血膜厚；反之，则血膜薄。血细胞比容低于正常时，血液粘度高，宜保持较小的角度，可得满意结果；相反，血细胞比容低于正常时，血液较稀，则需用较大的角度和较快的推片速度，才可得满意的血涂片。良好的血涂片的“标准”为血膜由厚到薄逐渐过渡。 染色：血涂片应在1h内完成染色，或在1h内用无水甲醇固定后染色。 血涂片分类计数质量控制流程
血涂片白细胞分类计数方法：是有血涂片经瑞氏染色后，在油镜下根据白细胞形态特点逐个分类计数（一般计数100-200个白细胞），并观察其形态变化，然后求各种白细胞的比值。 血涂片分类计数注意事项：血涂片进行白细胞分类科稳定6-8h，但2h后粒细胞形态即有变化，故需要镜检分类应及早分血片：正确判断是否需要人工显微镜复查，凡出现以下情况之一者，都应当进行显微镜复查。（1）血细胞计数结果明显异常（WBC<×109/L，WBC>×109/L，Hb<50g/L，PLT<50×109/L）。（2）血细胞直方图异常：红细胞、白细胞、血小板任何一项直方图的峰值出现偏移。（3）出现警示信号。这需要我们操作人员在日常生活中严格执行，注意分析检验结果各参数之间的关系，才能对异常结果做出正确判断。加强与医护人员的联系：对在检测中出现的异常和阳性结果，要及时主动和临床医生取得联系，与临床资料进行相关性分析，对有疑问的做到合理解释。 1 、目的：
血涂片的制备与染色
血涂片制备与染色 血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。 （一）血涂片制备 1.载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。 使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 2.血涂片制作方法 取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持30～45○夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。 涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。 一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。 （二）血涂片染色 染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。 血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞特染色法（Wright）、姬姆萨染色法（Giemsa）等。 1.瑞特（Wright）染色法 为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。 （1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。
血涂片的制备
实验二血涂片的制备 Preparation of Blood Smear 实验原理 使用推片将血液在载玻片制成血膜。 试剂器材 载玻片（清洁、干燥、无尘、无油脂、25cm×75cm，厚度0.8mm~1.2mm）、推片。 操作步骤 （1）采血静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴（约0.05ml）抗凝血，如果使用手指采血则直接用洁净玻片蘸 1 滴血。 （2）推片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平 坦地方，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿 推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈 30。~45。角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血 涂片（图1-6），血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。 （3）干燥将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅 速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37 ℃温箱中保温促 干，以免细胞变形缩小。 图1-6 推片（4）标记在载玻片的一端用记号笔编号。 注意事项 1．要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用约1mol/L HCl浸泡24h后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20min，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馏水最后浸洗后擦干备用。边缘破碎、玻面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 2．最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用EDTA抗凝血制备。使用抗凝血标本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后4h内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。制片前标本不宜冷藏。涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。故针对不同病人应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的病人应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。 3．血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端2cm的地方结束涂抹为宜。一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此画线应注意保存血涂片尾部细胞。 4．血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。 实验评价 血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。 血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。除可
血液涂片的制作与染色
血液涂片的制作与染色 日期:2010-06-04来源:作者:点击:1031次我要评论 分享到：检验微博新浪微博网易微博腾讯微博搜狐微 博QQ空间朋友社区人人网 核心提示:做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节 做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。 一．玻片的清洁 1．一般清洗法 （1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。 （2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。2．油污载片清洗法 （1）清洗液 甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。 （2）清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。 二．血涂片制作 取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。 一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。 涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。 三．染色 1．瑞氏染色法（Wright staining） 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中的特异
血涂片及染色操作程序
1.目的 规范血涂片及染色操作程序，确保检测结果准确度。 2.标本种类 人体静脉血或末梢血。 3.适用范围 操作区的血涂片及染色。 4．染色原理 血涂片染色过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。由于血细胞内不同结构所含有的化学成分不同，对瑞氏染料亲和力也不同，涂片经染色后，各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态、特征的目的。 5.试剂与器材 5.1一次性采血针、末梢采血器、棉签、碘酒等。 5.2标准级显微镜载玻片、推片、瑞氏染液、OLYMPUSCH20双目显微镜（日本OLYMPUS公司） 6．操作步骤 6.1薄血膜推片法 取血标本一滴置载玻片的一端1cm处或载玻片一侧的3∕4处。以边缘平滑的推片端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持25～30o的平面夹角，平稳地将血向前推动，血液即在载玻片上形成一薄层血膜；将制成的血膜在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。天气寒冷或潮湿时，应置于37℃温箱中保温促干，以免细胞皱缩。最后在载玻片的一端用记号笔编号。 6.2厚血膜涂片法 取新鲜血液1滴于载玻片的中央，用推片的一角将血滴由内向外旋转涂布，制成厚薄均匀、直径约1.5cm的圆形血膜，待自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使红细胞溶解，脱去血红蛋白，倾去水，血涂片干燥后即可染色并用显微镜检查。本方法特别适合检查疟原虫、微丝蚴等。 6.3染色 平置玻片于染色架上加瑞氏染液3～5滴染色，使其迅速盖满血膜。约1分钟后滴加缓冲液布满，轻轻摇动玻片，使染色液充分混合。5～10分钟后，用水冲去染液，待干。 7.标本要求
7.1玻片必须清洁、干燥、中性且无油腻。 7.2最好使用非抗凝血，也可使用EDTA抗凝血，但必须在采集后4小时内制成血涂片。 7.3使用抗凝血标本不宜冷藏，用前必须混匀。 8.注意事项 8.1推制的涂片应厚薄适宜，血膜应呈舌状，头、体、尾清晰可分。 8.2涂片的好坏与血滴大小、推片与载片之间角度、推片时的速度有关，血滴大、角度大、速度快，则血膜厚；反之则血膜薄。 8.3血膜分布不匀，主要是推片边缘不齐、用力不匀或载玻片不清洁所致。 8.4瑞氏染液使用后，要迅速盖好，避免挥发。 8.5血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落，应在1小时内染色。 8.6染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，冬季室温过低时，染色时间要适当延长。 8.7冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。8.8染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色。 参考文献 1.中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程（第3版）.南京：东南 大学出版社，2006. 2.江苏省卫生厅.医院检验科建设管理规范（第2版）.南京：东南大学出版社， 2013.
做好血液涂片和正确染色
（一）玻片的清洁 1．一般清洗法 （1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。 （2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95 ％乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或 10 ％盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。2．油污载片清洗法 （1）清洗液 甲液10g／L 过锰酸钾水溶液乙液25g／L 草酸水溶液 （2）清洗方法将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95 ％乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。 （二）血涂片制作 取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。 推血片方式
一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。 涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50 ％的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。 （三）染色 1．瑞氏染色法（Wright staining） 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。 （1）原理瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离子。 如以M ＋代表美蓝，以E －代表伊红，其反应式为： M ＋Cl－＋Na ＋E→M E ↓＋NaCl 美蓝伊红伊红化美蓝（瑞士染料） 将适量的M E（瑞士染料）溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME 溶解，解离为M ＋和E －，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着色。甲醇（AR）的另一个作用是有很强的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。
血液涂片的制作与染色
血液涂片的制作与染色 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
血液涂片的制作与染色 日期:2010-06-04来源:作者:点击:1031次 分享到： 核心提示:做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节 做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。？ 一．玻片的清洁？ 1．一般清洗法？ （1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。？ （2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。？ 2．油污载片清洗法？ （1）清洗液？ 甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。 （2）清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。？ 二．血涂片制作？
取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。？ 一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。？ 涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。？ 三．染色 1．瑞氏染色法（Wright staining）？ 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。？ （1）原理瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离子。如以M+代表美蓝，以E-代表伊红，其反应式为：？ M+Cl- +Na+E→ ME↓+NaCl？ 美蓝伊红伊红化美蓝（瑞士染料）？ 将适量的ME溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解离为M+和E－，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着
血涂片制备
血涂片制备 步骤： 可分5个步骤进行 消毒→取血→推片→染色→观察 操作步骤： （1）采血 静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血。 （2）推片 左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈30。~45。角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。（3）干燥将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37 ℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。 （4）标记在载玻片的一端用记号笔编号。 （4）染色用特种玻璃铅笔在血膜两侧画两条线，防止染液外溢。再将瑞氏染液滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染1分钟。加等量蒸馏水(或缓冲液)与染液混合再染5分钟。最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，自然干燥后，即可观察。 注意事项： 1、要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。使用玻片时，只能手持玻片边缘， 切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 2、最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用EDTA抗凝血制备。使用抗凝血标本 时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后4h内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。 3、涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度 等有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之
则血膜薄。 4、血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察 的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端2cm的地方结束涂抹为宜。 一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现。 5、血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上， 在染色过程中容易脱落。