单抗制备流程

单抗制备技术原理和流程

单克隆抗体简单回顾

机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌一组能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，即抗体。抗原上可以引起机体产生抗体的结构叫做抗原决定簇，或者抗原表位，一个抗原可以有多个不同的抗原表位。由单一B淋巴细胞产生仅识别某一特定抗原表位的抗体为单克隆抗体。由多种B 淋巴细胞产生，识别多个抗原表位的抗体被称为多克隆抗体。

图1. 抗原表位与抗体分子的特异性结合。

单克隆抗体的特点

特异性高：单抗特异性太高，以至于无法跨物种应用。

抗体组成：仅有一种抗体亚型组成，比如IgG1、IgG2、IgG3。

批次差异：和多抗一样，容易产生批次间差异。

实验检测：由于单抗特异性高，因此检测时，产生的背景更少，结果重现性。

抗原变异：但是相比于多抗，单抗对微小抗原变化（如轻微变性、糖基化异质性、多态性）的包容性更弱。但可以通过合并靶抗原相同的两种及以上抗体进行补偿。

抗体制备：对制备技术要求高，制备杂交瘤细胞的时间较长，花费更高，制备周期更长。

单克隆抗体的应用

1.分析抗原的细微结构及探测抗原的特定结构域；

2.可用于分离、特征化及纯化特定分子抗原；

3.产品可直接用于临床诊断和治疗，或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物，直接导向肿瘤等。

单克隆抗体的制备

单抗制备的方法主要包括杂交瘤技术和展示抗体库技术。实验室主要用杂交瘤技术，而大规模生产中主要用杂交瘤技术或者展示抗体库技术。抗体库技术的要求更高，制备时间更短，易于人源化，因此更适合规模生产。杂交瘤技术发展多年，颇受认可，实验操作较为简单，可生产特异性强的单抗，因此在大多数实验室中应用。

1. 杂交瘤技术

关于杂交瘤技术，我们已经开展过几次专题解读，这里不再赘述。您可以移步查看下列文章：

杂交瘤技术简述及基本原理

杂交瘤细胞系如何建立

杂交瘤筛选—选择培养基筛选

杂交瘤筛选—特异性抗体筛选

杂交瘤细胞克隆方法

图2. 杂交瘤技术制备单克隆抗体原理示意图。

2. 抗体库技术

抗体库技术是在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体（比如噬菌体，哺乳细胞等），进行重组抗体的表达。下面，我们以噬菌体抗体库技术举例，讲解抗体库技术原理。

噬菌体抗体库技术原理

噬菌体展示技术是利用基因工程手段将外源基因片段插入噬菌体特定蛋白基因，利用噬菌体表达并展示重组融合蛋白的技术。2018年的诺贝尔化学奖颁给了噬菌体展示的发明者——乔治.史密斯。噬菌体展示主要包括重组噬菌体、辅助噬菌体和宿主细菌等，先后发展出了噬菌体M13，λ, T4，T7展示系统。辅助噬菌体是指由能为噬菌体提供复制和包装过程所需要的酶和结构蛋白质的完整噬菌体，即不含外源基因。丝状噬菌体pIII蛋白和pVIII蛋白最常用于展示外源性重组蛋白。外源蛋白能够融合在PIII蛋白中间或者N段。

图3. 噬菌体展示技术原理。

抗体库生产单抗流程

（1）抗体库构建

选取高质量的mRNA，逆转录得到抗体的轻链和重链的DNA，将PCR扩增得到的轻链和重链基因与载体连接，导入感受态细菌中。如果该噬菌体不包含噬菌体所需的全部基因，还要加入辅助噬菌体。然后进行细胞培养，重组蛋白得到展示与表达。

（2）淘选

利用免疫反应进行淘选。即将表达的单抗与靶抗原进行免疫反应，在经过洗脱，稀释和扩增结合的噬菌体。经过3-4轮，即可得到高度特异性的抗体噬菌体。

（3）分析

淘选得到的噬菌体还需要经过ELISA检测。主要过程是在包被有靶抗原的板子上加入噬菌体孵育，洗脱未结合的噬菌体，加入偶联酶的噬菌体抗体和酶特异性显色剂。若是发生显色反应，说明噬菌体抗体能与靶抗原结合。选出显色的噬菌体用于单抗的生产。

通过高通量测序技术，还能对抗体的序列进行分析。生产出的抗体，也能用于下游检测，如ELISA，免疫荧光，免疫印迹，和免疫沉淀等。检验合格的单抗能在科学研究、临床诊断、医药研究等方面发挥重要作用。

图4. 利用噬菌体抗体库的临床应用流程。

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

生产装置工艺过程风险分析

工艺过程风险分析 公司主要原料、辅料、产品的理化性质、危险特性、毒性辨识分析： 涉及的危险化学品有氢氧化钠、四氢呋喃。其中氢氧化钠属第8.2类碱性腐蚀品，四氢呋喃属第3.1类低 分析评价单元的划分 根据项目整体工艺条件、布置、功能综合考虑，分为生产装置、罐区、导热油炉、成品库房四个评价单元 一、生产装置单元 1、单元概况 本单元为公司主要生产单元，集中了公司主要设备设施、生产人员，原料1,4-丁二醇在催化剂作用下脱水生成四氢呋喃，再经精馏提纯、脱水、干燥等工序得到合格产品—四氢呋喃。 1.1主要设备 精馏塔、加热釜、催化反应釜、产品储罐、进料罐、搅拌器、沉降罐、脱浑罐、冷凝器、分子筛塔、各种机泵及附属温度表、压力表、液位计、流量计、管线、闸、阀等 1.2主要物料及产品 原料1,4-丁二醇；辅料氢氧化钠、催化剂、分子筛；产品四氢呋喃

1.3控制工艺指标 1.3.1压力：-0.05-0.08MPa —常压 1.3.2最高控制温度：225℃ 2、工艺流程 2.1反应机理 C 4H 10 O 2 催化剂 C 4H 8O+H 2O 2.2工艺流程： 2.3工艺操作过程简介 2.3.1原料精制：开原料真空泵，原料从储罐抽到原料罐加热滏中，控制加热滏液面低于65%-75%，控制加热滏温度110℃-120℃，轻组分自塔顶蒸出后进原料精馏塔精馏，控制精馏塔一定真空度，再沸器持续升温，控制塔底温度150℃，待回流罐见液面后，开启回流泵，建立平衡，平衡正常后，控制回流罐的液面50%-60%，塔内轻组分在气液分离器进一步分离出来，待回流罐采样分析合格后，开始自回流罐向反应器进料脱水。 2.3.2反应转化：提纯得1,4-丁二醇，自回流罐用泵打入反映其中进行脱水反应。反应器顶部温度维持在80℃，以110kg/h 的速度从顶部得到含有80%的四氢呋喃水溶液，进入四氢呋喃粗品罐。 2.3.3精制分离：粗品四氢呋喃用泵打入粗品精馏塔，控制塔底温度66℃左右蒸馏，控制塔一定真空度，回流罐见液面后建立回流，控制回流液罐面60%左右，开始自回流少量采出头馏分去粗品罐，待回流采出组分分析合格后，用泵送碱洗塔。 2.3.4碱洗：碱洗塔塔低加热，控制温度低于70℃快速蒸出。蒸出物经冷凝器冷凝后经泵送入固碱脱水搅拌器，进一步脱出游离水分，用泵送入沉降罐2-5hr,待分离后自顶层液面取得提浓的四氢呋喃，四氢呋喃进一步去精馏塔进行蒸馏，控制塔底温度65℃左右，控制塔一定真空度，塔顶蒸出的四氢呋喃进分子筛罐提纯后的成品四氢呋喃，成品四氢呋喃包装装桶，塔底碱液回收到碱洗备用。 3、工艺过程风险分析 3.1工艺过程中的危险及控制失效影响

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

生产过程风险分析

目录 一、危险、有害因素评价分析 二、生产过程危险辨识分析 三、生产设施、装置的危险评价分析 四、各危险、有害因素评价分析小结 五、具体评价方法及评价过程 六、风险评价 一、危险、有害因素评价分析 一、危险、有害因素 烟台昌霖工业有限公司是一家生产醇酸漆、工业防腐漆的化工企业。主要的危险场所有甲类原料储罐区、成品库等。从以下几个方面对其主要的危险及有害因素加以辨识和分析评价。 二、危险物质特性分析评价及本企业重大危险源辨识 根据GB12268-90《危险货物品名表》、《危险化学品目录》（2002年）和GB18218-2000、《重大危险源辨识》和《关于开展重大危险监督管理工作的指导意见》等国家法律、法规和标准中规定的危险物质分类原则，对本企业使用的原料、中间产品、最终产品中涉及的危险物质进行分类、确认和分析，并按照生产和储存场所的情况进行重大危险源辨识和分析。 1）危险有害物质分布和特性评价分析 （1）危险物质的分布 按照本企业油漆生产工艺及配方的需求，油漆的生产过程主要应用的原材料为各类树脂、溶剂油、豆油、200#、二甲笨、甲苯等。主要产品为：醇酸清漆、工业防腐漆等。其中使用的原材料大部分属于乙类易燃液体，有200#、二甲苯。产品主要填料有：钛白粉（属非危险品）、滑石粉（属非危险品）、沉淀硫酸钡（属非危险品）及少量着色颜料。填料与颜料与上述有机溶剂混配而成为产成品，其火灾危险性分类为乙类或丙类物质。因此，火灾是本公司首要预防和回避的危险。 本公司在生产、储运过程中存在的主要危险物质和分布情况如下: A.易燃物质： 本公司用于涂料生产的原材料和产品主要属于易燃物质，具体的基本危险特性如下：

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓

生产流程风险评估记录

宁海县瑞利塑料厂 生产流程风险评估记录 目录 1、风险评估小组 2、风险分析评估标准（以烟灰缸为代表性产品） 3、产品描述 4、工艺流程图 5、工艺流程图说明 6、危害风险分析 7、显著危害 8、原材料验收控制措施（进料检验规范） 9、注塑料斗磁选控制措施 10、产品装配控制措施 11、金属异物控制措施（验针机操作管理规程）（公司无此项设备）

一、风险管理小组 二、风险分析评估标准 根据产品安全危害造成不良健康后，后果有严重性及发生的可能性，对每种产品安全危害进行评价和分类。应指明在原料、加工和分销中哪个环节每种食品危害可能引入、产生或增加程度

1、评估危害度：风险管理小组根据危害的严重性、危害出现的频率、危害不被发现的可能性等方面，将危害划分为显著危害、非显著危害两种。 2、显著危害是指必须预以控制的、可能发生的、会对消费者健康造成损害。风险评分为分的，可判为显著危害。 三、产品描述（以烟灰缸为代表性产品）

理化 无金属异物 无塑料异物 无其它异物（玻璃） 无油污、其它化学污染 重金属和聚合物含量符合环保要求和客户要求 卫生 无虫害：鼠害、蚊害、蚂蚁、苍蝇及它们的排泄物 无发霉污染 4、包装方式 内包装为贴不干胶、展示盒、白盒纸箱外包装 5、储存条件 储存在清洁、干燥、阴凉、通风场所，防止日晒雨淋、杂物污染 6、运输条件 运输产品的箱体密封完好，卫生清洁 7、保质期限 包装完整未经开封的情况下 10年 8、销售方式 货架 9、销售区域 欧美 10、标签要求 按照客户要求 11、使用方法 烟灰开怀拆开后安装在桌子或其他私人指定的位置，几可使用 12、适合的消费者 成人 四、工艺流程 ?包装 成品检验 产品储存 产品运输 1、胶件注塑 注塑产品不能有批锋，变形，缩 水等问题，IPQC 疋时抽检（新料 做抗性，阻燃测试 注塑机 PA （尼龙）再生料 使用设备 使用材料 纸箱 验收 储存 不干胶 验收 储存 验收 储存 色粉 验收 储存 五、工艺流程说明 步骤 作业要求或作业要点

单克隆抗体制备注意事项

单克隆抗体(McAb)制备技术 1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。 一、材料和方法 (一) 材料 1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压 蒸气灭菌，每瓶80ml分装。 2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes 2ml,0.2mol/L谷 氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。 3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置 -20℃ 中保存。 4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。 5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。 6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。 7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。 8 8-氮杂鸟嘌呤称取8-氮杂鸟嘌呤20mg，溶于4mol/L NaOH 10ml 或0.36%Na2CO3 10ml中，以蒸馏水稀释至1000ml，过滤备用。 9 台盼蓝溶液台盼蓝100mg，溶于PBS 100ml中即成。 10 0.34mol/L蔗糖溶液蔗糖5.8g，蒸馏水50ml，高压蒸气灭菌，分装。 (二) 方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例) 1. 动物免疫将提取的空肠弯曲菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐

生产过程和产品风险评估

1.0目的 为了发现和评估产品在开发过程中和产品生产过程中潜在的失效及其後果，找到能够避免或者减少这些潜在失效发生的措施。 2.0 范围 适用於本厂生产的各工序生产过程(包括工艺、设备、环境等) 和各类型产品的风险评估。 3.0 定义 3.1 DFMEA (Design Failure Mode and Effects Analysis，设计开发中失效模式与後果分析)。 设计FMEA 不是靠程式控制来克服设计中潜在的缺陷，即在体现设计意图的同时，还应保证制造或装配能够实现设计意图,即要考虑制造/装配过程中技术的/能力的限制。 3.2 PFMEA (Process Failure Mode and Effects Analysis，过程中失效模式与後果分析)。 3.2.1 在产品制造过程(包括工艺、设备、环境等)，对构成产品的各子系统、零部件， 成品、过程、服务的各个工序逐一进行分析，找到潜在的失效模式，评估其可 能的後果、风险，找到能避免或减少这些潜在失效发生的措施，预先采取措施 防止发生。 3.2.2 失效分析在於找出零元件或系统的潜在失效极其後果，并为此而采取的可行之 对策。 3.3 潜在风险（Potential Hazard）：按照法律法规要求，客人安全规格，在玩具设计里 固定含有的特徵或部件（如小物件，尖点，利边，小球，磁石，长绳，突出物、 等）必须要避免发生。不能满足PRD (Product requirement document)所定义、客人 要求等的风险。 3.4 RPN (Risk Priority Number，风险序数)：测量失效模式的风险程度。 3.5 失效的类别 物理性失效——任何潜在损害产品机械物理性能的危害；

单克隆抗体制备简要流程

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图: 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6 月） 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ￥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合（融合剂：PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * （三天内做完流式）“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性！ 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫： 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠，间隔一般2?3周，末次免疫后3?4天，分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

制备单克隆抗体的技术要点

制备单克隆抗体的技术要点 1．交瘤技术的技术流程 如图4-1所示。 图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞

用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心10min。最后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定

生产拉线流程风险评估记录(DOC)

生产流程风险评估记录 目录 1、风险评估小组 2、风险分析评估标准（以烟灰缸为代表性产品） 3、产品描述 4、工艺流程图 5、工艺流程图说明 6、危害风险分析 7、显著危害 8、原材料验收控制措施（进料检验规范） 9、注塑料斗磁选控制措施 10、产品装配控制措施 11、金属异物控制措施（验针机操作管理规程）（公司无此项设备）

一、风险管理小组 二、风险分析评估标准 根据产品安全危害造成不良健康后，后果有严重性及发生的可能性，对每种产品安全危害进行评价和分类。应指明在原料、加工和分销中哪个环节每种食品危害可能引入、产生或增加程度。 1、评估危害度：风险管理小组根据危害的严重性、危害出现的频率、危害不被发现

的可能性等方面，将危害划分为显著危害、非显著危害两种。 2、显著危害是指必须预以控制的、可能发生的、会对消费者健康造成损害。风险评分≥5分的，可判为显著危害。 三、产品描述（以烟灰缸为代表性产品）

四、工艺流程 纸箱不干胶胶粒色粉

验收 验收 验收 验收 储存储存 注塑 装配 包装 成品检验 产品储存 产品运输 五、工艺流程说明 步骤 作业要求或作业要点 使用设备 使用材料 1、胶件注塑 注塑产品不能有批锋，变形，缩 注塑机 PA （尼龙）再生料 水等问题，IPQC 定时抽检（新料 做抗性，阻燃测试 2、贴不干胶 不干胶贴法按作业指导书要求 工作台 不干胶 3、组装 将干净的上下盖扣好，检查不会 工作台 产品 脱落 4、装箱 组装好的产品入展示盒内，按订 工作台 展示盒 支架 外 单要求装箱，封箱 箱（白盒） 六、危害风险分析

单克隆抗体制备过程中的两次筛选

单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HA T培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体

说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody ，北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围

的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3?5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟， 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X 105/ml，备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:

单克隆抗体制备全攻略(二)

6、单抗特性的鉴定 ⑴单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。 检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下： a.在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。 b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1- 0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min10分钟，弃上清。 c.加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。 d.向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。 e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。 f.取出离心管，1000r/min5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。 g.用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa 染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。 h.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

0234..生产现场和生产过程、环境存在的风险和隐患辨识、评估分级与控制措施

生产现场和生产过程、环境存在的风险和隐患辨识、评估分级与控制措施 合同订立的一般程序 （赠品不喜欢可以删除） 一、合同订立的需要条件 （一）须有双方或多方当事人 合同为各方达成的协议，属于双方或多方的法律行为，因此，订立合同须由至少两方当事人参与，仅一方当事人不存在订立合同问题。订约当事人是否为双方或多方，决定于参与订约的人是否为相互独立的意思主体。在一般情形下，订约当事人各方的经济目的是相反的，但

在某些情形下，订约当事人各方也可有相同的经济目的，但须能为相互独立的意思表示。（二）须有当事人之间的意思表示的互动 合同订立是由独立的主体相互接触，互为意思表示，直到达成协议的过程。因此，合同的订立须有当事人互为意思表示，从要约、再要约，直到承诺。 （三）须为特定当事人之间为缔约而为意思表示 订立合同只能是在特定的人或者特定范围内的人之间进行，并且当事人须以缔约为目的进行接触，当事人之间相互所为的意思表示是为订约发出的。若不特定的人之间或者虽为特定人之间相互接触，进行协商，但并不是以订约为目的，则不属于合同订立问题。 二、合同订立的程序 合同的签订，一般应基于双方当事人的合意，既意思表示一致。合同订立的过程就是当事人双方使其意思表示趋于一致的过程，这一过程在合同法上称为要约和承诺。 （一）什么是要约 1、要约是指一方当事人向他人作出的以一定条件订立合同的意思表示。前者是要约人，后者称为受要约人。 要约取得法律效力，应具备以下条件： 第一、要约必须是特定人的真实意思表示。 第二、要约必须是向相对人发出的意思表示。要约的相对人可以是特定的人，也可以是不特定的人。向特定人发出要约，通常是指某一具体的法人或自然人。向不特定的人发出要约，一般是指向社会公众发出的要约。 三：要约必须是能够反映所要订立合同主要内容的意思表示。要约的目的在于取得相对人的承诺，建立合同关系。要约能否为另一方所接受，关键是看发出的要约对对方是否亦有利。即使对方表示了愿意订立合同的意思，双方还必须要订立合同的主要条款，如标的、数量、质量、价款或报酬、履行期限、地点和方式、违约责任、争议的处理 方法以及要求对方答复的期限等，以供被要约人考虑是否承诺。 2、要约的形式要约作为一种意思表示，可以以书面形式、也可以以对话形式作出。 3、要约的法律效力和要约的撤回、撤销要约的生效时间因要约形式的不同而不同。对话形式要约，自受要约人了解时，要约发生效力。书面形式的要约于到达受要约人时生效。要约生效前是可以撤回的。