单克隆抗体制备过程中的两次筛选

单克隆抗体制备过程中的两次筛选

动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。

第一次筛选：

细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。

其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

第二次筛选：

在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。

人用单克隆抗体质量控制技术指导原则

人用单克隆抗体质量控制技术指导原则 本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体 （一）杂交瘤细胞 1．亲本细胞 （1）骨髓瘤细胞 SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。 （2）免疫亲代细胞 经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。 应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。 2．细胞融合与克隆化 采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。 3．杂交瘤细胞检定 （1）抗体分泌稳定性 连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。 （2）细胞核学特征

检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。 4．鼠源病毒检查 按附录要求检测鼠源病毒。 5．支原体检查 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 6．无菌试验 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 （二）单克隆抗体的检定 1．免疫球蛋白类及亚类 用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。 2．亲和力 用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。 3．特异性 测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。 4．交叉反应 按附录要求。 免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

常用的单克隆抗体检测方法

常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而 成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2

0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。 b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。 c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。 d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。 e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。 f、每孔加50-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。 g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。 h、加底物

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

fda人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点

人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点 前言 生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。 此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括： 1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。 2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于1990年11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。 3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。 4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。 单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时，则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。 某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。 主档案 在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案

动物细胞融合与单克隆抗体(教案)

授课人：曾屏珊 班级：高二（3）班 时间：20XX年5月3日（星期四）上午第2节 【教学目标】 1．知识目标： 举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。 (1) 能简述动物细胞融合的概念。 (2) 能简述动物细胞融合的基本过程。 (3) 能列出动物细胞融合与植物细胞融合的异同。 (4) 能列举细胞融合技术的优点及实际应用。 (5) 能描述单克隆抗体的含义。 (6) 能简述单克隆抗体的制备过程。 (7) 能列举单克隆抗体的优点及实际应用。 2．能力目标： 偿试设计单克隆抗体的制备过程。 3.情感态度价值观 体验科学研究过程是科学、技术、社会三者之间的关系。 【教学重点】单克隆抗体的制备和应用 【教学难点】单克隆抗体的制备过程 【课时安排】1课时 【学情分析】 学生已经学习了植物体细胞杂交的知识，动物细胞融合与植物原生质体融合的原理及方法基本相同，对这部分知识学生学起来应该较轻松。单克隆抗体的制备过程是本节的重点和难点，学生在学习过程中会产生疑问：“为什么要进行两次筛选”、“怎样进行筛选”、“为什么这种抗体叫单克隆抗体”，所以在教学中应把更多的精力放在“单克隆抗体的制备”上。【教学策略】 以问题和任务驱动教学，组织学生进行自学学习，在问题的解决中、习题的反馈中完成本节教学任务。 【教学程序】

【教学反思】 通过学案引导学生自学，在课堂上根据教学目的创设教学情境，敢于放手，给学生充足 的学习时间，调动学生的主动性，让学生充分地交流；在学生的交流的同时，能适时地引导 学生彼此沟通和相互理解；有效地促进了学生学习方式的转变，锻炼了学生敏捷的思维能力 和准确的语言表达能力，拓展延伸了学生的视野，提高了学生的生物科学素养。 课堂上学生交流的时间没把握好，导致未完成本节课全部内容。以后课堂上应注意这方 面的问题，将课堂还给学生的同时，还要做好引导者的工作。 提出问题：该方案能达到预期效果吗?为什么？

单克隆抗体制备过程中的两次筛选

单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。

人用单克隆抗体质量控制技术指导原则(2003)

人用单克隆抗体质量控制技术指导原则 2003年03月20日发布 本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体。 一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体 （一）杂交瘤细胞 1．亲本细胞 （1）骨髓瘤细胞 SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。 （2）免疫亲代细胞 经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。 应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。 适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。 2．细胞融合与克隆化 采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。 3．杂交瘤细胞检定 （1）抗体分泌稳定性 连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，

细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。 （2）细胞核学特征 检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。 4．鼠源病毒检查 按附录要求检测鼠源病毒。 5．支原体检查 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 6．无菌试验 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 （二）单克隆抗体的检定 1．免疫球蛋白类及亚类 用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。 2．亲和力 用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。 3．特异性 测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。

单克隆抗体制备简要流程

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图: 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6 月） 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ￥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合（融合剂：PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * （三天内做完流式）“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性！ 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫： 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠，间隔一般2?3周，末次免疫后3?4天，分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HA T培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。

“单克隆抗体”学习中的几个问题分析

“单克隆抗体”学习中的几个问题分析 “单克隆抗体”是动物细胞工程的重要内容，动物细胞融合技术的重要应用就是制备单克隆抗体，学生对这项现代生物技术既充满兴趣又深感抽象，教材仅以“单克隆抗体制备过程示意图”和简单的文字描述来介绍，因而要达到课标要求的理解、综合应用水平，还需有一定的背景知识，如：免疫学基础，细胞融合过程及其对性状表达的影响等知识。基于此，本文围绕这些问题进行分析解答，以便于师生教与学。 1.一种抗原能使机体产生几种抗体 免疫学告诉我们抗原是指能引起机体发生特异性免疫反应的任何物质或病原体，包括自身的衰老、损伤细胞和癌变细胞。抗原具有异物性、大分子性和特异性的特点。其特异性与抗原分子表面和分子内部的特定的化学基团——抗原决定簇有关。一般，一个抗原分子具有多个抗原决定簇，如：流感病毒有40多个，白喉类病毒有8个。抗原决定簇是免疫细胞识别抗原的重要依据，也是诱导淋巴细胞分化的刺激因素，又是同相应抗体结合的部位。抗原注射到人和哺乳动物体内，一个B淋巴细胞只能接受一种抗原决定簇的刺激，分化为效应B 淋巴细胞和记忆细胞，并能产生与该抗原决定簇特异性结合的特异抗体。即一种抗原决定簇指引起一种特异抗体，因而一种复杂的抗原进入机体后，可刺激机体不同的B细胞分化产生多种抗体。这些抗体各不相同，只能与相应的抗原决定簇结合，因而都可以和该抗原结合，但结合部位不同，即一种抗原引起机体产生多种特异的抗体，但每一个效应B淋巴细胞只能产生其中一种特异的抗体。这样血清抗体就是由多个不同的B淋巴细胞应答一个抗原的结果，即不同淋巴细胞产生的特异抗体能与该抗原的不同抗原决定簇结合，因此，血清抗体纯度低、灵敏度低、特异性差。单克隆抗体是由同一种B淋巴细胞群体（克隆化）合成并分泌的，这些抗体均一，只识别同一种抗原决定簇，因而特异性强、灵敏度高。 2.为什么在得到杂交瘤细胞后，还要进行抗体检测和筛选 经过选择培养基筛选，得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需的特异抗体。原因有三：①经抗原处理过的机体脾脏中提取的细胞不一定都是效应B细胞，因而杂交瘤细胞不一定产生抗体；②即使相应的效应B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，也由于细胞融合时，有部分染色体的随机丢失，若与抗体合成有关的基因所在的染色体丢失了，不能产生抗体，或者即使融合细胞没有丢失，也会由于杂种细胞中遗传物质的表达受到相互干扰而无法正常表达，因而只有极少数杂交瘤细胞能产生特异的抗体；③由于一种抗原刺激机体可使机体中存在多种浆细胞，所以杂交瘤细胞产生的抗体不一定是所需的抗体，也不是单一的抗体。因此需要利用多孔细胞培养板培养，检测各孔的上清液中细胞分泌的抗体，将阳性孔进行有限稀释法选择，保证毎孔中的细胞为单克隆细胞，这样的细胞群进行大量的体内或体外培养，可得到特异强性灵敏度高的单克隆抗体。 3.单克隆抗体的制备过程为什么只需两个阶段的筛选 单克隆抗体的制备，其实质是将能产生所需特异抗体的效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选得到既能产生所需特异抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞，对其进行动物细胞培养，从培养液中分离提纯单克隆抗体即可。因而有学生认为在细胞融合前，先从脾脏提取的制敏细胞中，筛选得到特异的效应B淋巴细胞，要筛选三次。这种想法是存在偏差的，也是没有必要的，基于前面的讨论可知，首先效应细胞在体外不能增殖，因而很难筛选，其次即使能筛选到目标细胞，经融合后，也不一定能产生抗体，根据实验简约原则，不需要这次筛选，所以单克隆抗体制备过程只进行两次筛选：第一次选择得到多种杂交瘤细胞，第二次选择得到既能产生所需特异抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞。

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体

说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody ，北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围

的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3?5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟， 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X 105/ml，备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:

解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选及考查例解

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/4f1146007.html, 解读单克隆抗体制备过程中的两次筛选及考查例解 作者：朱秀芹 来源：《新校园·学习（中旬刊）》2012年第08期 一、原理阐释 “单克隆抗体的制备”是选修三“动物细胞工程”这一章的重点内容，虽然高考对选修教材要求层次相对较低，但两次筛选过程仍时有考查。课本中对第一次筛选这样叙述：“根据这个设想，他们首先将抗原注射入小鼠体内，然后从小鼠脾脏中获得能产生抗体的B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合，再在特定的选择性培养基中，筛选出杂交瘤细胞。”学生在预习中多次会问及这是什么样的选择培养基，怎样选择。在诱导剂作用下，培养基中会出现三种细胞，B淋巴细胞与B淋巴细胞融合，骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合，以及B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞，以及细 胞的多聚体形式等。正常的B淋巴细胞在培养基中存活仅5～7天，不需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 在普通动物培养基中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺密啶脱氧核苷酸制成HAT培养基，这是根据细胞中的DNA合成途径有两条：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子合成提供原料。此过程中，叶酸作为重要辅酶参与此过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”，氨基蝶呤这种独特的拮抗叶酸作用，也广泛用于医学领域，如治疗一些顽固性疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣等，效果显著。DNA的另一条合成途径是应急途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶，催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个融合的效应B细胞融合的“D途径”被氨基蝶呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏体外培养液中增殖的能力，一般10d左右死亡。对于骨髓瘤细胞及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶缺陷型细胞，因此，自身无“S途径”，且“D途径”又被氨基蝶呤阻断，所以HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有瘤细胞与效应B细胞相互融合的细胞，既有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 课本中对第二次筛选是这样叙述的：“他们培养杂交瘤细胞，从中选出能够产生所需抗体的细胞群，继续培养，以获得足够数量的细胞，在体外条件下，做大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖。”其中“从中选出能够产生所需抗体的细胞群”这句话较为概括，学生会产生疑问：“已经是效应B细胞和瘤细胞的融合体，为什么还要筛选？难道产生的抗体还有区别吗？”

简介单克隆抗体技术及其人源化技术

简介单克隆抗体技术及其人源化技术 摘要：单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。鼠源性mAb由于可引起免疫反应而削弱其疗效，因而逐渐被人源化mAb所取代，甚至出现全人mAb取代人源化mAb的趋势。本文主要介绍了全人mAb的生产方法之一，转基因小鼠技术，并对该项技术的应用作了些展望。 关键词：单克隆抗体；人源化；转基因小鼠；Cre/LoxP Abstract:After its advent, monoclonal antibody has gone an uneven way to its present wide applications in clinical practices, during which the humanized antibody set an important milestone. Murine mAbs are trended to be replaced by humanized mAbs or even human mAbs as murine mAbs’ immuno-side effects may reduce therapeutic effects. The paper briefly introduces tansgenic mice technology as one of generating human mAbs methods as well as share some prospects. Key Words:Monoclonal Antibody(mAb); Humanization; Transgenic Mice; Cre/LoxP 一、单克隆抗体背景介绍 从1975年英国学者Milstein和德国学者Kohler利用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合[1]，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。 单克隆抗体不仅可用于分析抗原的结构及检验抗原抗体未知的机理关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第三代抗体-基因工程抗体技术的发展。 二、鼠源单克隆抗体的制备及其特性 鼠源性单抗的制备，一般程序为从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对已筛选出的单个细胞进行鉴定和克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前所生产的单抗大多数是鼠源性的，在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易使宿主引起过敏反应。这样，一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。 鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA）[2]，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合[3]。为了克服以上这些问题，鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。 三、单克隆抗体药物的发展进程（图1）

单克隆抗体制备的基本原理

精心整理单克隆抗体制备的基本原理 ?一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原 1975 交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（GeorgesKo1er）和英国科学家米尔斯坦（CesarMilstein）两人由此杰 抗 《自 （ 他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细

胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞 题，NSO/1 合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋