α-半乳糖苷酶活力测定

A.1 α-半乳糖苷酶活力测定

A.1.1 原理

α-半乳糖苷酶能将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。通过400nm比色测定释放的对硝基酚的量，可以计算反应液中α-半乳糖苷酶的活力

A.1.2 试剂与溶液

除特殊说明，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T 6682中规定的二级水。

A.1.2.1 乙酸钠缓冲液，浓度为0.05 mol/L，pH值为5.5

A液：称取无水乙酸钠4.2g定容至1000mL；B液：冰乙酸3.0 mL定容至1000 mL。用B液调节A液至pH5.5。

A.1.2.2 碳酸钠溶液，浓度为0.2mol/L

准确称取无水碳酸钠21.198g，定容至1000mL。

A.1.2.3 对硝基酚标准溶液，浓度为10 mmol/ L

称取0. 1391 g 对硝基苯酚，精确到0. 001 g ,用碳酸钠溶液定容至100 mL，低温保存。

依次移取对硝基苯酚标准贮备液1 mL 、2 mL 、3 mL 、4 mL 、5 mL 、7 mL 、9 mL ,用碳酸钠溶液定容至100 mL ,配成浓度为0.1 mmol/ L 、0.2 mmol/ L 、0.3mmol/ L 、0.4mmol/ L 、0.5mmol/ L 、

0.7mmol/ L 、0.9mmol/ L 的对硝基苯酚标准工作液。

A.1.2.4 对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液，浓度为10mmol/L

称取3.031g对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，用醋酸钠缓冲液定容至1000mL，置棕色试剂瓶于4 ℃以下保存。

A.1.3 仪器与设备

A.1.3.1 分析天平：感量0.001 g。

A.1.3.2 pH计：精确至0.01。

A.1.3.3 磁力搅拌器：附加热功能。

A.1.3.4 电磁振荡器。

A.1.3.5 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45 m。

A.1.3.6 离心机：4000 r/min。

A.1.3.7 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。

A.1.3.8 秒表：每小时误差不超过5s。

A.1.3.9 可见分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。

A.1.3.10 移液器：精度为1uL。

A.1.4 绘制标准曲线

吸取1mL对硝基酚标准溶液（A.3.2.3）于试管中，加入1mL乙酸钠缓冲液(A.3.2.1)；对照的空白试管中加入2mL乙酸钠缓冲液（A.3.2.1）；在所有的试管中加入8mL碳酸钠溶液(A.3.2.2)，振荡，在400nm 处测定吸光值。

以对硝基酚浓度为Y轴、吸光值为X轴，绘制标准曲线。

A.1.5 反应用酶液的制备

A.1.5.1 固体样品的反应用酶液制备

称取固体样品1g左右（精确至0.0002g），用80mL乙酸钠缓冲液(A.3.2.1)浸泡，磁力搅拌30分钟，用乙酸钠缓冲液(A.3.2.1)定容至100mL，4000r/min离心机离心10min，取上清用缓冲液做适当稀释。

A.1.5.2 液体样品的反应用酶液制备

液体试样可以直接用乙酸钠缓冲液(A.3.2.1)进行稀释和定容。

酶液的酶活在0.02U/mL 以内时，测试结果较准确。

A.1.6 测定步骤

将上述稀释酶液和底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液（A.3.2.4）于37℃下水浴10分钟预热。然后再吸取各溶液0.4mL ，充分混合，于37℃恒温水浴10分钟，加入3.2mL 碳酸钠溶液(A.3.2.2)，振荡混匀，终止酶反应，以蒸馏水调零，在400nm 处测定吸光值A 。

酶液空白用经过预热的酶液0.4mL ，然后加入3.2mL 碳酸钠溶液(A.3.2.2)，振荡混匀，再各加入0.4mL 预热的底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液（A.3.2.4）于37℃振荡10分钟，在400nm 处测定吸光值A 0。

A.1.7 试样酶活力的计算

试样中α-半乳糖苷酶的活力以X 表示，单位为U/g 或U/mL ，按式（A.3）计算：

()[]N m t b K A A X ??+?-=

0 ……………………………………………（A.3）

式中：

A ——酶反应液的吸光值；

A 0——酶空白液的吸光值；

K ——标准曲线的斜率；

b ——标准曲线的截距；

N ——试样的稀释倍数；

t ——待测液与底物反应时间，单位为分钟（min ）；

m ——试样的质量或体积，单位为克（g ）或毫升（mL ）。

A.1.8 结果表示

两个平行试样的测定结果用算术平均值表示，酶制剂样品保留整数，加酶饲料样品保留三位有效数字。

A.1.9 重复性

同一个试样两个平行测定值的相对偏差，α-半乳糖苷酶样品不大于8%，添加α-半乳糖苷酶的各种饲料样品不大于15%。

α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒说明书

货号：QS2614 规格：50管/24样α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-GAL）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 测定原理： α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页

细胞衰老 β-半乳糖苷酶-1

Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal?broblast by p66Shc down-regulation Yi Na Wang a,1,Wei Wu b,1,Hong Chao Chen a,Hong Fang a,* a Department of Dermatology,1st Af?liated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,79#Qing Chun Road,Hangzhou310003,China b State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Af?liated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China 1.Introduction It has been noticed that the appearance of facial wrinkling in the Asian population is delayed for about10years when compared to the Caucasian population.The pattern and degree of facial wrinkling is different as well.There are many factors contributing to this difference,such as lifestyle,genetic background,and nutrition.The Asian diet is well known for being rich in soy or soy- containing products and the estrogen-like compounds in soy protein,along with their antioxidant activities,are regarded as potential weapons against the aging process. Iso?avones,a group of polyphenolic compounds found in and isolated from a number of plants,with soybeans and soy products like tofu and textured vegetable protein being the primary food source,have attracted a great deal of interest,especially for possible properties in the prevention and treatment of cancer and chronic disease including cardiovascular diseases and diabetes mellitus[1,2].Recent studies further suggested that iso?avones might act as a photoprotection and inhibit the initiation and promotion of skin carcinomas[3]. One of the main iso?avones is genistein.Genistein has been reported to modulate molecular functions mainly by acting as a tyrosine kinase inhibitor[4].Also genistein has anti-oxidation and anti-angiogenesis effects as well as estrogenic activities[5].Previous evidences have suggested that genistein down-regulates UVB- induced signal transduction cascades in carcinogenesis and confers photo-protective effect in SKH-1murine skin and in human reconstituted skin[6,7].Recent studies revealed that genistein prevent UV-induced photoaging and photodamage in human skin[8].However,although studies have been reported on the Journal of Dermatological Science58(2010)19–27 A R T I C L E I N F O Article history: Received4July2009 Received in revised form9February2010 Accepted10February2010 Keywords: Genistein Photoaging UVB p66Shc FKHRL1 A B S T R A C T Background:Genistein,as an active compound of dietary antioxidants,has shown considerable promise as an effective agent against aging process.However,the effect of genistein on skin photoaging and the associated mechanism remain unclear. Objective:To delineate the effect of genistein on UVB-induced senescence in human dermal?broblasts (HDFs)with emphasis on the mechanism of oxidative pathway regulated by p66Shc involved in the events. Methods:HDFs were induced to premature senescence by repetitive subcytotoxic doses of UVB irradiation.Cellular apoptosis and DNA cell cycle were analyzed using?ow cytometry.Intracellular levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were detected by ELISA.Mutation levels of two large deletions of mitochondrial DNA,4977bp and3895bp deletion,were determined by quantitative PCR.Western blot was applied to detect the expression and activation of p66Shc(the66- kilodalton isoform of the growth factor adapter Shc)and FKHRL1(a forkhead protein that is intimately linked with intracellular oxidation). Results:Strong activity of senescence-associated beta-galactosidase(SA-b-gal),high percent of cell apoptosis as well as cell cycle arrest in G0/G1phase,and increased intracellular oxidative stress were observed in HDFs irradiated by UVB.Genistein exerted dramatically protective effects on HDFs in a dose- dependent manner.Elevated copy numbers of large deletions in mitochondrial DNA were also inhibited by genistein.Down-regulation of total and phosphorylated p66Shc on Ser36,as well as FKHRL1and its phosphorylation on Thr32,were observed after genistein treatment. Conclusion:The results indicate that genistein protects UVB-induced senescence-like characteristics in HDFs via maintenance of antioxidant enzyme activities and modulation of mitochondrial oxidative stress through down-regulation of a p66Shc-dependent signaling pathway,which may provide potential prevention against skin aging and even photoaging. ?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. *Corresponding author.Tel.:+8657187236340;fax:+8657187236385. E-mail addresses:hongfangzy@https://www.wendangku.net/doc/f97464318.html,,tango654321@https://www.wendangku.net/doc/f97464318.html, (H.Fang). 1These authors contributed equally to this work. Contents lists available at ScienceDirect Journal of Dermatological Science j o u r n a l h o m e p a g e:w ww.e l s e v i e r.c o m/j d s 0923-1811/$36.00?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. doi:10.1016/j.jdermsci.2010.02.002

钠测定试剂盒(半乳糖苷酶法)产品技术要求zhongshengbeikong

钠测定试剂盒（半乳糖苷酶法） 适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中钠离子的浓度。 1.1包装规格 液体双剂型 试剂1（R1)：60mL×4 ,试剂2(R2)：30mL×4 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：60mL×2 ,试剂2(R2)：30mL×2 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：40mL×2 ,试剂2(R2)：20mL×2 ,校准品：1mL×2（2个浓度）。 1.2主要组成成分 1.2.1 试剂1（R1）（液体） β-半乳糖酶（pH9.0）≥0.8U/L 硫酸铵 5.4mmol/L 1.2.2 试剂2（R2）（液体） ο-硝基酚基β-D-吡喃糖苷半乳糖（ pH9.0) 5.5mmol/L 1.2.3 校准品（液体） 在水基质中添加氯化钠，目标浓度（2个水平）：水平1：120mmol/L；水平2：170mmol/L。（每批定值，值有批特异性，详见值单） 2.1 外观 试剂盒中各组件的外观应满足：

2.1.1试剂1（R1)应为无色或浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.2试剂2(R2)应为浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.3校准品应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。 2.2 试剂空白吸光度 在波长405nm～420nm处（光径1cm），试剂空白吸光度（A）应≤1.000；试剂空白吸光度变化率（△A/min）≤0.150。 2.3准确度 测定锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品（编号：360018），相对偏差应不超过±15%。 2.4分析灵敏度 对应于浓度为100mmol/L的Na所引起的吸光度变化率差值△A/min的绝对值应在0.200 ～0.600的范围内。 2.5重复性 重复测定高、中、低浓度样本，变异系数（CV）应≤3%。 2.6批间差 测定同一样本，批间差（R）应≤4%。 2.7线性范围 在[80,180]mmol/L检测范围内，线性相关系数（r）应≥0.9900，线性相对偏差应不超过±5%。 2.8试剂稳定性

β-半乳糖苷酶测定试剂盒使用说明

β-半乳糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，10μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）； 15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用试剂二将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase, β-GAL)试剂盒使用说明

β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase,β-GAL）试剂盒使用说 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组 织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 试剂三10001000 充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 三、β-GAL活性计算： 标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr

土壤蔗糖酶、纤维素酶的测定方法

土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及 土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生 成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度 与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠 （11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。 三、操作步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新 沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色， 以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定

β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用

β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用 摘要：β-半乳糖苷酶是一种可以把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的酶。低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，在食品及保健品中应用广泛。因此，研究β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用具有极强的现实意义。 关键词：β-半乳糖苷酶；低聚乳糖；生产方法；工艺过程控制；固定化反应器；酶分离提取方法 Abstract：β- galactose glucoside enzyme is a kind of enzyme that can put the lactose hydrolysis into galactose and glucose. Low poly galactose is a natural functional oligosaccharide which has been widely applied in food and health products. Hence, doing Research of β-galactose glucoside enzyme’ application in the low poly galactose production has strong practical significance. Key words：β- galactosidase； galacto-Oligosaccharides；method of production; process control; immobilized enzyme reactor; methods of Extraction and Isolation β-半乳糖苷酶,简称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。β-半乳糖苷酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。利用各种技术手段研究β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用具有一定现实意义[1]。 1.菌株选育 1.1低聚半乳糖生产法 低聚半乳糖(GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7 个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n 为0-6)。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS 成分。 1.2发酵法中发酵工艺过程控制 培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 培养基的选择： （1）根据微生物的特点选择培养基 （2）根据发酵方式选择培养基 发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。而固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。 1.3从生产实践和科学试验的不同要求选择 种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。常用葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。 发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。当然，如果产物是含氮物质，应相应的增加氮源的供应量。 1.4从经济效益方面考虑选择生产原料 以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。 培养基的配制原则： （1）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基

蔗糖酶测定方法

蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase, β-GAL)试剂盒说明书

货号：MS2615 规格：100管/48样β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase, β-GAL）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 测定原理： β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入2.5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体13mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、培养液等液体样本：直接检测 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页

糖化酶发酵、提取及活力测定

SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ 发酵工艺学实验报告 糖化酶发酵、提取及活力测定实验 学院：生命科学学院 专业班级：生物工程1602 项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻 指导教师：王丽娟 2018年6月

糖化酶发酵、提取及活力测定实验 何健雨王丽娟 生命科学学院生工1602班 1. 实验目的 (1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺； (2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。 (3)学习并掌握糖化酶活力测定方法 2. 实验原理 葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。 生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。 黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。 糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。 酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。 3. 实验材料 优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）； 0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。 4. 方法步骤

蔗糖酶的提取及活力

蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定 摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。 第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。 第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。 第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。 最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。 关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD 正文： 1，蔗糖酶的提取及提纯 1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体 内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要 破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系 将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界

糖化酶活力测定(精)

糖化酶活力测定 1. 定义 1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。 2. 原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。 3. 试剂和溶液 (1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。 称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。配好后用 pH 计校正。 (2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。 (3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。 (4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。 (5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。 (6硫酸溶液(2mol/L。 (7 20g/L可溶性淀粉溶液。 (8 10g/L淀粉指示液。 4. 仪器和设备

恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。 5. 步骤 (1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先 用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。沉 渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。 (2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅 速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。取出,加硫酸溶液 2ml ,立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定,直至蓝色刚好消失为其终点。 (3计算 X =(A -B c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×(A -B c×n 式中 X ——样品的酶活力(u/g或 u/ml A ——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml B ——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml c ——硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L 90.05——与 1ml 硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L相当的以克表示的葡萄糖的质 量

β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，5μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提 第1页，共3页

取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取 液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000 充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 三、β-GAL活性计算： 根据标准管的吸光度（x，减去浓度为0的标准管OD值）和浓度（y，nmol/ml）建立标准曲线，将△A带入标准曲线中，计算样品生成的产物量（nmol/ml）。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T =20×y÷Cpr 需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。 第2页，共3页

关于蔗糖酶活性的研究 生物化学实验

对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究 兰德新（同组：李建鑫） 浙江工业大学海洋学院食工1201 摘要： 目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。 关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE 文献综述: 蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。 而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性