产气荚膜芽孢梭菌

产气荚膜梭菌

形态：

本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌体中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞，无鞭毛，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。

特征：

为梭状芽胞梭菌类属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的革兰氏阳性粗大梭菌，单独或成双排列，两段钝圆，芽孢大，卵圆形，位于次端，在机体内可形成荚膜。无鞭毛不能运动。产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。

产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻，并可引起厌氧性蜂窝织炎、泌尿系感染和食物中毒。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1至2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。

产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。

存在于人粪及温血动物的粪便内，可作为粪便污染水体和土壤的指示菌。此菌具有芽胞，污染水体后存活时间较长，对氯等消毒剂有较强的抵抗力。如水体内未检出粪大肠菌群和粪链球菌而仅检出此菌，说明该水体以往曾有过粪便污染。产气荚膜梭菌作为判断土壤是否被粪便污染及污染程度的指示菌。通常用产气荚膜梭菌值表示。

当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当做好的食品量又是很大时，适当的热处理（60℃以上）充分的再加热，冷却食品（最低中心温度为24℃）也是必要的控制措施，培训食品加工人员，仍是控制措施的一个关键方面。

培养特性：不严格的厌氧，普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。适宜生长温度为37℃-47℃，生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。

生化特性：发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物。

毒素与分型

毒素：产气荚膜酸菌能产生外毒素和肠毒素。外毒素：致死毒素。坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。还有透明质酸酶等酶类。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏。不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。

产气荚膜梭菌检验(食品微生物学检验)

食品安全国家标准 食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验 1范围 本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。 本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。 2设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a）恒温培养箱：36℃±1℃； b）冰箱：2℃～5℃； c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃； d）天平：感量0.1g； e）均质器； f）显微镜：10×～100×； g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头； h）无菌试管：18mm×180mm； i）无菌培养皿：直径90mm； j）pH计或pH比色管或精密pH试纸； k）厌氧培养装置。 3培养基和试剂 3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。 3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。 3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。 3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。 3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。 3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。 3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。 3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。 3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。 4检验程序

产气荚膜梭菌检验程序见图1。 图1产气荚膜梭菌检验程序 5 操作步骤5.1样品制备 5.1.1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h 内不能进行检验，应以 无菌操作称取25g （mL ）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2 以无菌操作称取25g （mL ）样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品， 室温解冻后，加入200mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min ～2min ；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min ，作为1:10稀释液。5.1.3 以上述1:10稀释液按1mL 加0.1%蛋白胨水9mL 制备10-2～10-6 的系列稀释液。

产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌是厌氧芽孢梭菌属中能引起人类严重疾病的重要致病菌。 1．生物学和病原学特点 产气荚膜梭菌为厌氧革兰阳性粗大芽孢杆菌，无鞭毛，不运动，孢子卵圆，次端生，在一般培养基上稀少。无外孢子壁，无附属丝：表面菌落直径2～5mm，圆形，有时边缘扩展、突起，呈淡灰黄色，半透明，表面有光泽，可在20～50℃生长，最适生长温度45℃，所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；多数菌株能还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。产气荚膜梭菌见图3～11。 该菌能分泌强烈的外毒素和侵袭性酶，具有强烈致病性和侵袭力，在人和动物体内可形成荚膜。产气荚膜梭菌在自然界的土壤、水和空气中广泛存在，人和动物的肠道是其重要的寄居场所，一般各类粪便每克含量可达10

2～109个之多，但不经肠道感染宿主，只是污染外环境。由于产气荚膜梭菌是正常肠道菌群的一部分，人体肠道对其无天然特异免疫力，所有人群均为易感者，以婴儿和年老体弱者病情更重。经口食人是其主要传染途径，也可由伤口感染，夏秋季节多见。 2．致病性和临床表现 产气荚膜梭菌的致病物质为外毒素、肠毒素和荚膜。外毒素根据性质和致病性不同，分为A、B、c、D、E 5个类型，其中A型菌株是人类最重要的致病菌，外环境中的分离株80％以上属A型，此型可致气性坏疽、食物中毒和坏死性结肠炎；C、D型也是人类的病原菌，C型的部分菌株能引起人的坏死性肠炎；其他为兽类病原菌。 摄食被A型或某些C型菌株污染的食物，引起的食物中毒，潜伏期为8～24h，发病时下腹部剧烈疼痛、腹泻，但为自限性感染，一般1～2d内可自愈，老弱患者和营养不良儿童偶可致死。另一种食物中毒的表现是坏死性肠炎，由C型菌β毒素引起，潜伏期不到24h，起病急，有剧烈腹痛、腹泻，肠黏膜出血性坏死，粪便带血，可并发周围循环衰竭、肠梗阻、腹膜炎等，病死率高达40％。3．食品安全危害 产气荚膜梭菌在污水、土壤、垃圾、人和动物的粪便以及食品中均可检出，土壤中的检出率达100％。被污染的食物主要是肉类和鱼贝类等蛋白质性食品，由于存放较久或加热不足使细菌大量繁殖，形成芽孢时产生大量的肠毒素，引起食源性疾病。多食肉而卫生条件差的城市和集体食堂中易造成产气荚膜梭菌的扩散传

食品安全危害及其控制措施

第2章食品安全危害及其控制措施 食品安全危害是指食品中所含有的对健康有潜在不良影响的生物、化学或物理因素或食品存在状况。 食品安全危害可以分为三类，即生物的、化学的和物理的危害。 生物性危害：指对食品原料、加工过程和食品造成危害的微生物及其代谢产物。包括致病性微生物（主要指有害细菌）、病毒、寄生虫等。 化学性危害：指食用后引起急性中毒或慢性积累性伤害的化学物质。包括天然毒素类（天然存在的化学物质）、食品添加剂和其他污染物（如农药残留等）。 物理性危害：指食用后可能导致物理性伤害的异物，如玻璃、金属碎片、石块等。 需注意的是，危害仅仅指食品中能够引起人类致病或伤害的因素。食品中出现昆虫、头发、污物或发生腐败，存在经济欺诈行为或违反食品标准等情况，虽然不符合要求，但是只要这些缺陷没有直接影响到食品的安全，一般不将其纳入HACCP计划。 2.1食品中的生物性危害及其控制措施 食品中的生物性危害是指对食品原料、加工过程和食品造成危害的微生物及其代谢产物。包括致病性微生物（主要指有害细菌）、病毒、寄生虫等。 食物中的生物性危害有可能来源于原料，也有可能来自于食品的加工过程。 食品中的生物性危害（主要指微生物危害）按生物的种类，主要分为以下几大类： （1）细菌性危害:包括引起食物中毒的细菌及其毒素造成的危害。 （2）病毒性危害:包括甲型肝炎病毒、诺瓦克病毒等病毒引起的危害。 （3）寄生虫危害:包括原生动物(如鞭毛虫等)和绦虫（如牛猪绦虫和某些吸虫、线虫等）造成的危害。 （4）真菌性(霉菌、酵母)危害:包括真菌及其毒素和有毒蘑菇造成的危害。 一般而言,霉菌和酵母不会引起食品中的生物危害（某些霉菌、藻类能产生有害毒素，但通常将这类毒素纳入化学危害的范畴），所以本节只讨论细菌、病毒、寄生虫引起的食品生物危害以及其导致的食源性疾病。 按引起疾病的严重性，将生物性危害分为三类: （1）严重危害: 肉毒杆菌A、B、E、F； 痢疾志贺氏菌； 伤寒沙门氏菌：甲型、乙型； 副伤寒沙门氏菌； 流产布鲁氏菌； 猪布氏杆菌； 创伤弧菌； 猪绦虫； 旋毛虫。 （2）中等危害，但是具有广泛传播性，且对某些敏感性体质的人或患并发症的病人具有严重危害: 沙氏门菌； 单胞增生李斯特氏菌；

产气荚膜梭菌检验作业指导书

品有限公司生效日期：2014.01.01 页码：第1页，共2页 1 目的 规定矿泉水产气荚膜梭菌的检验方法，保证按标准化操作。 2 适用范围 适用于产气荚膜梭菌检测。 3 术语 产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。 4 职责 质检员负责按作业指导书进行检验。 5 流程图 无 6 作业内容 6.1 检验方法原理 微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为0.22μm、0.45μm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。6.2 实验器材、培养基及试剂 6.2.1 实验器材 不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径0.22μm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。 6.2.2培养基及试剂 庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液6.3操作步骤 6.3.1推测性检验 6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。 6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好

产气荚膜杆菌

产气荚膜杆菌 百科名片 产气荚膜杆菌 产气荚膜杆菌(Clostridiumperfringen)又名魏氏梭菌(ClostridiumWelchii),它广泛存在于自然环境中,并见于几乎所有温血动物的消化道内,属于人和动物肠道内正常菌群的成员。本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎,是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原。 特征 为梭状芽胞杆菌类属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的革兰氏阳性粗大杆菌，单独或成双排列，两段钝圆，芽孢大，卵圆形，位于次端，在机体内可形成荚膜。无鞭毛不能运动。是气性坏疽的主要病原菌，并可引起厌氧性蜂窝织炎、泌尿系感染和食物中毒。存在于人粪及温血动物的粪便内，可作为粪便污染水体和土壤的指示菌。此菌具有芽胞，污染水体后存活时间较长，对氯等消毒剂有较强的抵抗力。如水体内未检出粪大肠菌群和粪链球菌而仅检出此菌，说明该水体以往曾有过粪便污染。产气荚膜杆菌作为判断土壤是否被粪便污染及污染程度的指示菌。通常用产气荚膜杆菌值表示。 培养特性 非专性厌氧菌，对营养要求不高，在厌氧血琼脂平板上，经35℃，孵育6h即开始生长，24h菌落可达2~4mm，灰白色，光滑，圆形，扁平，半透明，边缘整齐，偶尔可见边缘呈锯齿状或放射条纹的粗造形菌落。大多数A型菌落有双层溶血环，内层是狭窄的β-溶血环，外层是较宽的半溶血环。在庖肉培养中，上部肉汤混浊，肉渣淡红色，不被消化，产气较多，可将覆盖在肉汤使凡士林上冲，汹涌发酵，卵磷脂酶阳性。 家禽感染 由产气荚膜杆菌(clostridium perfringens)在实验感染上得知，其不仅能单独使鸡并发症坏死性肠炎(Necrotricentertis)，且能与球虫混合感染，增强、恶化球虫症之病变或症状，使死亡率变高。又同样，在野外之养鸡场，产气荚膜杆菌与球虫病之合并症，会给与养鸡户很大之经济性蒙害.常表现为：急性或亚急性坏死性肠炎、菌群

饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进

饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进 潘宝怡，吴清平，彭飞艇，周锦祯，郭伟鹏 (广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省华南应用微生物重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地，广东省微生物研究所,广东广州 510070) 摘要：针对饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）检测国家标准方法中,滤膜上的菌落在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂经24 h厌氧环境培养后黑色产生不明显的问题，对检验方法进行改进。国标改进方法一：按GB/T 8538.4.55-2008进行过滤后增加一步骤,即用SPS培养基（约10 mL）倾注于培养皿的膜上,然后放置厌氧培养；国标改进方法二：按GB/T 8538.4.55-2008进行过滤后将滤膜反贴于SPS培养基上，然后放置厌氧培养。对方法进行改进后，国标改进方法一和国标改进方法二滤膜上的菌落经24 h厌氧环境培养后均有明显的黑色产生。国标方法黑色菌落不明显，国标改进方法一和国标改进方法二产生的黑色菌落数与国标方法相比，具有显著性差异（P<0.01）。国标改进方法一不但有利于产气荚膜梭菌黑色的产生，而且容易挑取菌落做进一步试验。 关键词：饮用矿泉水；产气荚膜梭菌；方法；改进 文章篇号：1673-9078(2012)9-1236-1238 Improvement of Detection Method for Clostridium Perfringens in Drinking Natural Mineral Water of the National Standards PAN Bao-Yi, WU Qing-Ping, PENG Fei-Ting,ZHOU Jin-Zhen, GUO Wei -Peng (Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base), South China, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China) Abstract: The target colonies on the filtration membrane could not turn black obviously on sulfite - polymyxin - sulfadiazine agar after 24 h incubation in anaerobic conditions based on national standard method for the detection of Clostridium perfringens in drinking mineral water. To solve the above problem, the detection method was improved according to the methods of GB/T 8538.4.55-2008. After filteration, the S PS medium (10 mL) was poured on the membrane in the petri dish, and then placed in anaerobic conditions. Another improvement method was also based on the methods of GB/T 8538.4.55-2008. After filtration, the membrane was placed on the SPS culture medium at the reverse side, and then placed in anaerobic conditions. Using the two improved methods, the colonies of C. perfringens on the filtration membrane could turn black obviously after 24 h incubation in anaerobic conditions. Obvious difference was found in the number of black colonies using the two improved methods. The first improved method would make C.perfringens colonies turn black easily and obviously, and it also makes easy to pick colonies for further studies. Key words: drinking mineral water; Clostridium perfringens; methods; improvement 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎常见的病原菌。在《饮用天然矿泉水》（GB 8537-2008）标准中要求为0 CFU/50 mL[1]。《饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538-2008）中规定，产气荚膜梭菌在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂(以下简称SPS)上经24 h厌氧环境收稿日期：2012-04-26 基金项目：广东省科技计划项目（2009B030500003）；粤港关键领域重点突破项目（2009Z52） 作者简介：潘宝怡（1983-），女，学士，主要从事微生物安全检测技术研究通讯作者：吴清平（1962-），男，博士，研究员，主要从事食品安全研究培养后应形成黑色菌落，然后取黑色菌落作为疑似菌落再做进一步的确证试验加以证实[2]，但在实际操作中发现，按照GB/T 8538.4.55-2008中产气荚膜梭菌的检测方法，滤膜上的产气荚膜梭菌在SPS培养基上经24 h厌氧环境培养后无明显黑色菌落产生，而如生长出来的为非黑色菌落，则为非疑似菌落，有可能导致漏检，不能真实反映样品中产气荚膜梭菌的存在情况。为解决这个问题，本文对标准中的检验方法进行了改进[3,4]。 1 材料和方法 1236

2020年产气荚膜梭菌

作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌是厌氧芽孢梭菌属中能引起人类严重疾病的重要致病菌。 1．生物学和病原学特点 产气荚膜梭菌为厌氧革兰阳性粗大芽孢杆菌，无鞭毛，不运动，孢子卵圆，次端生，在一般培养基上稀少。无外孢子壁，无附属丝：表面菌落直径2～5mm，圆形，有时边缘扩展、突起，呈淡灰黄色，半透明，表面有光泽，可在20～50℃生长，最适生长温度45℃，所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；多数菌株能还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。产气荚膜梭菌见图3～11。 该菌能分泌强烈的外毒素和侵袭性酶，具有强烈致病性和侵袭力，在人和动物体内可形成荚膜。产气荚膜梭菌在自然界的土壤、水和空气中广泛存在，人和动物的肠道是其重要的寄居场所，一般各类粪便每克含量可达102～109个之多，但不经肠道感染宿主，只是污染外环境。由于产气荚膜梭菌是正常肠道菌群的一部分，人体肠道对其无天然特异免疫力，所有人群均为易感者，以婴儿和年老体弱者病情更重。经口食人是其主要传染途径，也可由伤口感染，夏秋季节多见。

2．致病性和临床表现 产气荚膜梭菌的致病物质为外毒素、肠毒素和荚膜。外毒素根据性质和致病性不同，分为A、B、c、D、E 5个类型，其中A型菌株是人类最重要的致病菌，外环境中的分离株80％以上属A型，此型可致气性坏疽、食物中毒和坏死性结肠炎；C、D型也是人类的病原菌，C型的部分菌株能引起人的坏死性肠炎；其他为兽类病原菌。 摄食被A型或某些C型菌株污染的食物，引起的食物中毒，潜伏期为8～24h，发病时下腹部剧烈疼痛、腹泻，但为自限性感染，一般1～2d内可自愈，老弱患者和营养不良儿童偶可致死。另一种食物中毒的表现是坏死性肠炎，由C型菌β毒素引起，潜伏期不到24h，起病急，有剧烈腹痛、腹泻，肠黏膜出血性坏死，粪便带血，可并发周围循环衰竭、肠梗阻、腹膜炎等，病死率高达40％。 3．食品安全危害 产气荚膜梭菌在污水、土壤、垃圾、人和动物的粪便以及食品中均可检出，土壤中的检出率达100％。被污染的食物主要是肉类和鱼贝类等蛋白质性食品，由于存放较久或加热不足使细菌大量繁殖，形成芽孢时产生大量的肠毒素，引起食源性疾病。多食肉而卫生条件差的城市和集体食堂中易造成产气荚膜梭菌的扩散传播，从而导致食物中毒的流行。2009年4月21日河南省安阳县某焦化厂职工食堂发生隔夜熟鸡腿被产气荚膜梭菌污染，造成32人食物中毒事件。 作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13

羊产气荚膜梭菌的分离鉴定

一株羊源产气荚膜梭菌的分离及鉴定 金铎*1,2，林家琪1,2，董真1,2，展天松1,2，顾敏1,2，焦库华1,2，王彦红*1,2，刘文博*，1,2 （1，扬州大学兽医学院, 扬州，江苏， 225009； 2，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州，江苏，225009；） 摘要：2013年4月，扬州大学动物医院畜禽门诊接诊一例山羊急性死亡的病例，对其进行剖检，无菌恒温厌氧分离培养，纯化鉴别，革兰氏染色，生化反应，结果表明为产气荚膜梭菌，并对此进行了一定的讨论 关键词：产气荚膜梭菌；分离；鉴定。 产气荚膜梭菌旧名魏氏梭菌，产气荚膜杆菌，根据致死性毒素与其抗毒素的中和实验，将此菌分为A、B、C、D、E 5个类型，以菌体抗原进行血清型分类意义不大，菌体抗原与毒素分型之间没有明显关系，毒素至少已经发现15种，其中α、β、ε、ι、δ、θ、κ、λ、μ、υ、CPE、其他毒素、神经氨酸酶等。A型、C型、D型的某些菌株可以产生肠毒素，A型产气荚膜梭菌主要引起动物的气性坏疽，牛、羔羊、新生羊驼、驯鹿、仔猪、家兔的肠毒血症，B型菌主要引起羔羊痢疾，还可以引起犊牛、羔羊、山羊的肠毒血症或坏死性肠炎，C型菌是绵羊猝狙的病原。D型、E型菌也是导致牛羊肠毒血症和猪的腹泻[1]。笔者结合相关知识，在此整理于扬州大学动物医院所见的一例羊源产气荚膜梭菌感染的疾病。 1材料与方法 1.1病料来源 2013年4月，江苏某养殖户饲养的240多只母山羊陆续产羔，羔羊在产后24-48小时开始出现剧烈腹泻，拉水样黑色稀粪，虚弱，随后死亡，羔羊的死亡率达60%。剖检后发现病死羊羔严重脱水，真胃和大肠内容物呈糊状，小肠壁变薄，或黄或黑，透明，充满空气，部分肠道黏膜充血出血，卡他性出血性炎症, *基金项目：江苏高校优势学科建设工程；江苏省大学生创新训练计划省级重点项目（201311117039Z） 作者简介：金铎（1992—），男，山东青岛人，扬州大学兽医学院本科生，主要从事羊临床菌株耐药性及质粒指纹图谱分析研究。 *通讯作者：王彦红，扬州大学兽医学院讲师，E-mail: wyh7405@https://www.wendangku.net/doc/fa18725967.html, *通讯作者：刘文博，扬州大学兽医学院副教授，E-mail: lwb@https://www.wendangku.net/doc/fa18725967.html,

MMFSCNJ出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法

MM_FS_CNJ_0341出口食品产气荚膜梭状芽孢杆菌平板计数法 MM_FS_CNJ_0341 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法 1.适用范围 本方法适用于出口食品的检验。 2.主要试剂和仪器 2.1.主要试剂（包括培养基） 胰月示.－亚硫酸盐－环丝氨酸（TSC）琼脂； D－环丝氨酸溶液； 卵黄乳液； 缓冲动力－硝酸盐培养基； 乳糖－明胶培养基； 产芽孢肉汤； 多价蛋白胨－酵母膏（PY）培养基； 硫乙醇酸盐液体培养基； 蛋白胨水； 亚硝酸盐试剂； 缓冲甘油－氯化钠溶液。 2.2.仪器 吸管1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度； 菌落计数器； 均质器； 厌氧培养装置； 超低温冰箱； 恒温培养箱：36±1℃； 恒温水浴箱：46±1℃； 培养皿：90或100mm； 显微镜。 3.过程简述 3.1.样品制备 3.1.1.样品的贮存和运送 如不能立即进行检验时，应在样品中加等量缓冲甘油－氯化钠溶液（液体食品应加双料的）。将样品作低温保存，直到检验，运送样品时，应使样品保持冷冻状态，并要避免容器破损。 3.1.2.制样 将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL蛋白胨水，以13000r／min 均质2min，如为液体样品，则取样25mL，加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，摇匀，吸取此1∶10样品匀液10mL加于90mL蛋白胨水中，摇匀，制成1∶100样品稀释液，必要时，按此法将样品作进一步的倍递增稀释，如从10－3～10－4……。 3.2.检验 3.2.1.平板计数法

倾注不含卵黄的TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺平。当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释液样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心。再向平皿中倾注不含卵黄的TSC 琼脂15mL，缓慢地旋转平皿，使其与接种物混合均匀。 也可用灭菌L形玻璃棒，将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，将平板水平静置5～10min，使接种物被吸收。然后用不含卵黄的TSC琼脂10mL覆盖平板表层（含卵黄的TSC琼脂最适于同时含有其他还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的食品）。琼脂凝固后，将平板正置于厌氧罐内，于36±1℃培养。不含卵黄的TSC琼脂平板培养20h，含卵黄的TSC琼脂平板培养24h，取出平板，用肉眼观察生长情况和有无黑色菌落。挑选生长有20～200个黑色菌落的平板，用菌落计数器将黑色菌落计数并计算每克食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数。产气荚膜梭菌的菌落在含卵黄的培养基上呈黑色，并通常有2～4mm宽的白色沉淀环（卵磷脂酶作用的结果）。但有少数菌株的卵磷脂酶反应较弱，或呈阴性。应对所有怀疑为产气荚膜梭菌的黑色菌落数进行计数，并按3.2.2条加以证实。 3.2.2.证实 从可计数的平板（具20～200个菌落）中挑选10个典型菌落，分别接种到液体硫乙醇酸盐培养基试管中，36±1℃培养18～24h。取培养物涂片，作革兰氏染色，镜检，检查培养物的纯度和细菌形态。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性，粗短的梭状芽孢杆菌。对于被污染的培养物可划线接种在含的卵黄的TSC琼脂平板上，于厌氧条件下36±1℃培养24h，以获得纯培养物。 用3mm接种环，取液体硫乙醇酸钠纯培养物，或从TSC琼脂平板上分离到的单个菌落，穿刺接种缓冲动力－硝酸盐和乳糖－明胶培养基。以1mL液体硫乙醇酸盐培养物接种到产芽孢肉汤中，36±1℃培养24h。在透射光下检查缓冲动力－硝酸盐培养基试管中细菌沿穿刺线生长情况，有动力的菌株沿着穿刺线呈扩散生长。没有动力的菌株，仅沿着穿刺线生长。 加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙于缓冲动力－硝酸盐培养基中以检查亚硝酸盐的存在。于15min内出现橙色者，表明有亚硝酸盐存在。如果不出现颜色变化，则加少许金属锌粉，放置10min。如果加锌粉后，不出现颜色变化，表明硝酸盐已完全还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐又被分解成了氨和氮，如变为橙色，表明菌株不能还原硝酸盐。 检查乳糖－明胶培养基，如发现产气和培养基由红色变为黄色，表明乳糖发酵并产酸。将试管置5℃冷却1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，需36±1℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。用产芽孢肉汤涂片作革兰氏染色，在显微镜下检查有无芽孢。如需对分离物作进一步检查，应将芽孢培养物于4℃存放。 无动力、革兰氏阳性，在TSC琼脂平板上产生黑色菌落，还原硝酸盐为亚硝酸盐，乳糖发酵产酸产气，在48h内液化明胶的杆菌，可初步认为是产气荚膜梭菌。可疑为产气荚膜梭菌而又不符合上述特征的，必须做进一步证实试验。对不液化明胶或在其他方面不典型的分离物要接种液体硫乙醇酸盐培养基，36±1℃培养24h，进行涂片，作革兰氏染色，检查培养物的纯度，以0.1mL液体硫乙醇酸盐培养物，接种到含1％水杨甙和含1％棉子糖的PY培养基各1管，观察产酸和产气，取1.0mL培养物放于试管中，加1～2滴0.04％酚红溶液，检查是否产酸（大多数产气荚膜梭菌，不发酵水杨甙，但同它密切相关的梭状芽孢菌，能迅

产气荚膜梭菌及检验

产气荚膜梭菌及检验 一、流行病学 产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。摄食被本菌污染的食品后8�22小时开始发病。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1�2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。 据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒，在美国占细菌性食物中毒的30%左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报导1200例，暴发约20起，大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。 产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。 产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽胞能耐受 100℃,1�5小时的加热。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。 当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当做好的食品量又是很大时，适当的热处理（60℃以上）充分的再加热，冷却食品（最低中心温度为24℃）也是必要的控制措施，培训食品加工人员，仍是控制措施的一个关键方面。 二、生物学特性： 1、形态： 本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌体中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞，无鞭毛，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。 2、培养： 本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，甚至在EH=200-250mv的环境内也能生长。 在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。生长适宜温度为37-47℃，多认为43-47℃为最宜本菌生长和繁殖速度极快，在适宜条件下增代时间仅8min，可利用高温快速培养法，对本菌进行选择分离，如在45℃下，每培养3-4小时传种1次，即可较易获得纯培养，在深层葡萄

产气荚膜芽孢梭菌

产气荚膜梭菌 形态： 本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌体中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞，无鞭毛，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。 特征： 为梭状芽胞梭菌类属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的革兰氏阳性粗大梭菌，单独或成双排列，两段钝圆，芽孢大，卵圆形，位于次端，在机体内可形成荚膜。无鞭毛不能运动。产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。 产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻，并可引起厌氧性蜂窝织炎、泌尿系感染和食物中毒。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1至2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。 产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。 存在于人粪及温血动物的粪便内，可作为粪便污染水体和土壤的指示菌。此菌具有芽胞，污染水体后存活时间较长，对氯等消毒剂有较强的抵抗力。如水体内未检出粪大肠菌群和粪链球菌而仅检出此菌，说明该水体以往曾有过粪便污染。产气荚膜梭菌作为判断土壤是否被粪便污染及污染程度的指示菌。通常用产气荚膜梭菌值表示。 当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当做好的食品量又是很大时，适当的热处理（60℃以上）充分的再加热，冷却食品（最低中心温度为24℃）也是必要的控制措施，培训食品加工人员，仍是控制措施的一个关键方面。 培养特性：不严格的厌氧，普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。适宜生长温度为37℃-47℃，生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。 生化特性：发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物。 毒素与分型 毒素：产气荚膜酸菌能产生外毒素和肠毒素。外毒素：致死毒素。坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。还有透明质酸酶等酶类。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏。不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。