肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４３８－

０５［收稿日期］　２０１１－０４－

１６［基金项目］　国家自然科学基金面上项目资助课题（ＮＳＦＣ　

３０９７２９１４）；广东省科技计划项目资助课题（２００９Ｂ０６０７０００２４）；广东省自然科学基金面上项目资助课题（１０１５１００８９０１０００２０８

）；中山大学高校基本科研业务费重大项目培育基金资助课题（１０ｙｋｊ

ｃ０３）［作者简介］　汪田甜（１９８３－）

，女，安徽省明光市人，医师，医学硕士，主要从事肝脏恶性肿瘤方面的研究。［通信作者］　吴祥元（Ｔｅｌ：０２０－８５２５２２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｙ３０７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响

汪田甜１，贾昌昌２，张　琪２，董　敏１，李　星１，陈冠中２，吴祥元１

（１．中山大学附属第三医院肿瘤内科，广东广州５１０６３０；２．中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州５１０６３０）［摘　要］　目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞（

ｈＣＡＦ），阐明其在肝癌发生发展中的作用。方法：采用酶消化法分离、纯化人ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法鉴定其相关蛋白标记物的表达，流式细胞术检测肝癌细胞Ｈｅｐ

３Ｂ经ｈＣＡＦ上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化，建立裸鼠移植瘤模型，观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞生长的影响。结果：在肝癌组织标本中成功分离出ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示ｈ

ＣＡＦ特异性地高表达α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）。ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒检测证实，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ

３Ｂ细胞增殖量为完全培养基处理４８ｈ细胞增殖量的１２６．０％、１２５．０％及１２０．５％，细胞增殖量差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）

。流式细胞术结果显示，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ

３Ｂ细胞增殖速度及细胞周期中处于Ｓ期的细胞数目均高于完全培养基处理的Ｈｅｐ３Ｂ细胞（Ｐ＜０．０５）。ｈＣＡＦ与Ｈｅｐ

３Ｂ共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（１．３４±０．５２）ｃｍ３］明显大于单独接种Ｈｅｐ

３Ｂ组［（０．５１±０．０９）ｃｍ３］，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论：ｈＣＡＦ可以明显促进肝癌细胞系Ｈｅｐ

３Ｂ的生长，其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。［关键词］　癌相关成纤维细胞；肝细胞肿瘤；增殖；肿瘤微环境

［中图分类号］　Ｒ３２２．４７ ［文献标志码］　Ａ

Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐ

ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｐ

ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ　ｈｅｐ

ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓＷＡＮＧ　Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ１，ＪＩＡ　Ｃｈａｎｇ－ｃｈａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ　Ｑｉ　２，ＤＯＮＧ　Ｍｉｎ１，ＬＩ　Ｘｉｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｇｕａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＵ　Ｘｉａｎｇ

－ｙｕａｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇ

ｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

，Ｇｕａｎｇ

ｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　

ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｈＣＡＦ）ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅｉｒ　ｐ

ｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　

ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　

ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒｈＣＡＦ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　

ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈＣＡＦ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈｏｕｇｈ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　

ａ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｔｕｍｏｒ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙ　

ｅｘｐｒｅｓｓｅｄα－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　

ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈＣＡＦ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｗｅｒｅ　１２６．０％，１２５．０％ａｎｄ　１２０．５％ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐ

ｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ　４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇ

ｈｅｒ８３４第３８卷　第３期２０１２年５月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３　Ｍａｙ

　２０１２

HuH-7 人肝癌细胞

HuH-7 人肝癌细胞 Catalogue No.: C165 Product Format: a T25 flask Culture Properties：贴壁 Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗 Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Application:Cells and cancer research NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY. Components Operation steps for cell culture 1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞； 2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶 浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化； （细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。） 3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀； 4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基 重悬37度培养箱继续培养； 传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。 Cell cryopreservation 1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择） 2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。

原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型

World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html,/journal/wjcr https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。

肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４３８－ ０５［收稿日期］　２０１１－０４－ １６［基金项目］　国家自然科学基金面上项目资助课题（ＮＳＦＣ　 ３０９７２９１４）；广东省科技计划项目资助课题（２００９Ｂ０６０７０００２４）；广东省自然科学基金面上项目资助课题（１０１５１００８９０１０００２０８ ）；中山大学高校基本科研业务费重大项目培育基金资助课题（１０ｙｋｊ ｃ０３）［作者简介］　汪田甜（１９８３－） ，女，安徽省明光市人，医师，医学硕士，主要从事肝脏恶性肿瘤方面的研究。［通信作者］　吴祥元（Ｔｅｌ：０２０－８５２５２２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｙ３０７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响 汪田甜１，贾昌昌２，张　琪２，董　敏１，李　星１，陈冠中２，吴祥元１ （１．中山大学附属第三医院肿瘤内科，广东广州５１０６３０；２．中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州５１０６３０）［摘　要］　目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞（ ｈＣＡＦ），阐明其在肝癌发生发展中的作用。方法：采用酶消化法分离、纯化人ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法鉴定其相关蛋白标记物的表达，流式细胞术检测肝癌细胞Ｈｅｐ ３Ｂ经ｈＣＡＦ上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化，建立裸鼠移植瘤模型，观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞生长的影响。结果：在肝癌组织标本中成功分离出ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示ｈ ＣＡＦ特异性地高表达α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）。ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒检测证实，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ ３Ｂ细胞增殖量为完全培养基处理４８ｈ细胞增殖量的１２６．０％、１２５．０％及１２０．５％，细胞增殖量差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５） 。流式细胞术结果显示，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ ３Ｂ细胞增殖速度及细胞周期中处于Ｓ期的细胞数目均高于完全培养基处理的Ｈｅｐ３Ｂ细胞（Ｐ＜０．０５）。ｈＣＡＦ与Ｈｅｐ ３Ｂ共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（１．３４±０．５２）ｃｍ３］明显大于单独接种Ｈｅｐ ３Ｂ组［（０．５１±０．０９）ｃｍ３］，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论：ｈＣＡＦ可以明显促进肝癌细胞系Ｈｅｐ ３Ｂ的生长，其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。［关键词］　癌相关成纤维细胞；肝细胞肿瘤；增殖；肿瘤微环境 ［中图分类号］　Ｒ３２２．４７ ［文献标志码］　Ａ Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐ ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｐ ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ　ｈｅｐ ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓＷＡＮＧ　Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ１，ＪＩＡ　Ｃｈａｎｇ－ｃｈａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ　Ｑｉ　２，ＤＯＮＧ　Ｍｉｎ１，ＬＩ　Ｘｉｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｇｕａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＵ　Ｘｉａｎｇ －ｙｕａｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇ ｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ，Ｇｕａｎｇ ｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　 ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｈＣＡＦ）ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅｉｒ　ｐ ｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　 ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　 ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒｈＣＡＦ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　 ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈＣＡＦ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈｏｕｇｈ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　 ａ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｔｕｍｏｒ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｈＣＡＦ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙ　 ｅｘｐｒｅｓｓｅｄα－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　 ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈＣＡＦ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂｗｅｒｅ　１２６．０％，１２５．０％ａｎｄ　１２０．５％ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｐ ｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ　４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇ ｈｅｒ８３４第３８卷　第３期２０１２年５月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３　Ｍａｙ 　２０１２

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养

肝癌小鼠造模实验方法

肝癌小鼠造模实验方法 (1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是 取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c （昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。) (2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用 枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。 (3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*107mL ，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝 皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL ／只(含2*106个瘤细胞)（5*106）？。全程严格无菌操作， 40min 内完成。 (4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随 机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg ／kg 、300mg ／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组 (1000mg ／kg 、4000mg ／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO 只小鼠。造模24h 后，阳性对照组(CTX)20mg ／kg 和青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)，腹腔注射0．2mL ／只，每天1次，连续lOd ：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL ／只，每天1次，连续lOd 。模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd 。平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。记录各小鼠死亡的时间。 其他问题： 检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？ 1、 造模后第二天给药 2、 肿瘤长出一定体积后在给药

白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制

现代生物医学进展https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.12NO.1JAN.2012 白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制* 戴维奇徐凌王锋卫巍沈杰黄银实杨丽娟何姗姗郭传勇△ （同济大学附属第十人民医院消化内科上海200072） 摘要目的：研究白藜芦醇（resveratrol ，Res ）对肝癌细胞LM3周期及凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法：分别用50、 100、150、200μmol/L 浓度的Res 作用LM3肝癌细胞24、48和72h ，CCK-8测定Res 对细胞的增殖作用；分别以相同剂量的DMSO 及 无处理的LM3细胞为随机和空白对照，观察150μmol/L Res 作用72小时后对肿瘤细胞周期及凋亡的影响； Real time-PCR 及Western blot 分析Res 对LM3细胞中Bak 和Bcl-2mRNA 及蛋白表达的影响。结果： Res 体外能明显抑制肝癌细胞LM3的生长增殖，在一定范围内呈现作用浓度（F=101.183，P ＜0.001）和时间依赖性（F=192.371，P ＜0.001）； 150μmol/L Res 作用72小时后能显著减缓肝癌细胞LM3的周期转换（P ＜0.001），并诱导明显的细胞凋亡效应（P ＜0.001）；进一步的检测发现Res 作用LM3细胞后，Bak mRNA （P=0.002，0.007）及蛋白（P =0.004，0.01）表达增强，而Bcl-2mRNA （P=0.027，0.007）及蛋白（P =0.001，0.001）表达 出现显著下降。结论：Res 可能通过对Bak 及Bcl-2表达的调节来抑制肝癌细胞LM3的增殖，并诱导其细胞凋亡。 关键词：肿瘤；周期； Bcl-2；Bak 中图分类号：R735.7，R285.6文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2012） 01-16-04Effects of Resveratrol on Cell Cycle and Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells and its Possible Mechanism* DAI Wei-qi,XU Ling,WANG Feng,WEI Wei,SHEN Jie,HUANG Yin-shi,YANG Li-juan,HE Shan-shan,GUO Chuan-yong △ （Tong Ji University,Department of Gastroenterology,Tenth People's Hospital,Shanghai,200072） ABSTRACT Objective:To investigate the effect of resveratrol (Res)on cell cycle and apoptosis of hepatocellular carcinoma LM3cells and the possible molecular mechanisms.Methods:Cell counting kit-8(CCK-8)assay was used to examine the effect on cell prolifer-ation of hepatocellular carcinoma LM3cells treated by Res with the concentration of 50μmol/L for 24and 72hours;LM3cells were treated by DMSO or no treatment as randomized and blank control,and then were detected.The expression of Bak and Bcl-2mRNA and protein in LM3cells treated by Res were evaluated by Real-time PCR and western blot,respectively.Results:Res inhibited the prolifera-tion of LM3cells in time-dependent manner （F=101.183，P ＜0.001）and concentration-dependent manner （F=192.371，P ＜0.001）in vit-ro.It was found that Res could accelerate cells cycle transition and induce apoptosis after treatment by Res at 150μmol/L for 72hours.The expression of Bak mRNA (P=0.002，0.007)and protein （P =0.004，0.01） were obviously up-regulated on treated LM3cells,while the expression of Bcl-2mRNA （P=0.027，0.007）and protein （P =0.001，0.001） decreased remarkably.Conclusion:Res can not only in-hibit proliferation of LM3cells but also induce cellular apoptosis through accommodating the expression of Bak and Bcl-2. Key words:Carcinoma;cycle;Bcl-2;Bak Chinese Library Classification(CLC):R735.7,R285.6Document code:A Article ID:1673-6273(2012)01-16-04 *基金项目：国家自然科学基金(81072005)。上海市科委基金(0941*******) 作者简介：戴维奇(1985-)，男，硕士生； E-mail ：dai_yue@https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html, △通讯作者：郭传勇， E-mail ：guochuanyong@https://www.wendangku.net/doc/0c13446418.html, （收稿日期：2011-07-12接受日期：2011-08-06）前言 原发性肝癌（primary liver cancer,PLC ）包括肝细胞癌（hep- atocellular carcinoma,HCC ）、肝胆管细胞癌（cholangiocarcino- ma ）、肝细胞及胆管混合癌等几种类型， PLC 是我国高发肿瘤，位于恶性肿瘤病死率第二位，这其中又以乙型肝炎病毒感染后 的肝细胞癌为主[1]。因此， 针对能够明显抑制原发性肝细胞肿瘤的药物研究就显得十分重要。 白藜芦醇（Resveratrol,Res ）是1940年首次从毛叶黎芦的 根部分离得到的非黄酮类多酚化合物。Res 在新鲜葡萄皮中含 量较高，在中药植物虎杖中含量最为丰富。因Res 具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护心血管、鳌合自由基等作用，长期以来一直广泛用于心血管病的防治中。最近研究表明Res 可显著抑制多种人类肿瘤细胞的生长增殖[2-6]，本研究主要通过白藜芦醇处理肝癌细胞株LM3，观察白藜芦醇对肝癌细胞增殖及凋亡的影响，检测相关基因及蛋白的变化情况，以期阐明白藜芦醇抗肿瘤的可能机制。1材料与方法1.1细胞和主要试剂人肝细胞癌细胞株LM3(购自美国ATCC 公司)；Res(纯度>99.9％)(Sigma)用二甲基亚(DMSO)溶解后配成100mmol ／L 16··

综述：肝细胞性肝癌

综述：肝细胞性肝癌 原发性肝癌以肝细胞性肝癌（HCC）为主。在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在发病率方面排名第六。根据世界卫生组织的年度预测，估计2030年将有100多万患者死于肝癌。 在美国，从2000年到2016年，肝癌的死亡率增加了43%（从7.2人/10万人上升到10.3人/10万人），而5年生存率为18%，肝癌已成为仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤。大部分的HCC发生在有基础肝脏疾病的患者当中，主要是HBV或HCV感染或酒精滥用。 普遍接种HBV疫苗和广泛应用针对HCV的直接作用抗病毒药物可能将改变HCC的病因谱。而非酒精性脂肪肝（NAFLD）、代谢综合征和肥胖患者的增加放大了肝癌的发生风险，在西方国家，NAFLD将很快成为肝癌的主要病因。 针对晚期肝癌患者的系统疗法发展迅速，在过去2年，有4种新药在3期临床试验中显示出了临床疗效。本文将主要论述HCC的主要遗传学改变、风险因素、监测和诊断，以及循证治疗方法。 一、发病机制 慢性肝病患者存在持续性肝脏炎症、肝纤维化和肝细胞异常再生。这些异常的生理过程可导致肝硬化，并导致一系列遗传学和表观遗传学事件，最终导致异常增生结节（真正的肿瘤癌前病变）的形成。额外的分子改变能使异常增生细胞获得增殖、侵袭性和生存优势，并完成到成熟HCC的转变（图1）。HCC也可发生于不存在肝硬化或明显炎症的慢性肝病患者（如HBV感染患者）。 图1HCC的主要遗传学改变及分子分型 图中描述了人HCC发生过程中关键的分子和组织学改变，以及HCC两个分子亚型的主要遗

传和临床特征。*表示高水平的DNA扩增。在非增生型中，CTNNB1突变增强了免疫排斥。 二、风险因素 没有基础肝病的患者很少罹患HCC，男性的HCC发病率是女性的两倍。任何原因的肝硬化都会增加HCC的发生风险。 这种风险因病因、地理区域、性别、年龄和肝损伤程度而异。 在世界范围内，HBV感染是HCC的主要病因。尽管乙肝疫苗的广泛接种降低了HCC的发病率，但仍有许多未接种疫苗的人感染HBV（2015年为2.57亿人），有罹患HCC的风险。饮食中接触黄曲霉毒素B1可导致249位TP53的特异性突变（R→S），增加HBV感染患者发生HCC的风险。在西方国家和日本，HCC的主要病因是HCV感染。无论潜在的肝纤维化程度如何，HBV感染都有直接的致癌作用，但在HCV感染者中，若不伴有重度肝纤维化，则HCC很少发生。 全世界范围内，NAFLD相关HCC的发病率呈上升趋势。在美国，从2016年到2030年，该发病率预计将增加122%（从5510例增加到12240例）。 酒精性肝硬化是HCC的另一常见病因。 吸烟合并HIV感染也可能导致HCC的发生。抗病毒治疗在降低HCC的发生率方面是有效的，但不能根除这种风险。 与无应答的患者相比，在对干扰素治疗方案有持续病毒学应答的HCV感染患者中，HCC 的风险从6.2%降低到了1.5%。据报道，使用直接作用抗病毒药物治疗的HCV感染患者发生HCC的风险也会降低。 除了肝病的病因治疗外，尚无任何药物可以降低HCC的发生率。 三、HCC的监测 癌症监测旨在早期发现肿瘤，增加治疗机会，提高生存率。然而，尚无高质量的随机对照试验评估HCC监测对肝硬化患者的临床价值。不过，数学模型、低质量的临床试验（在方法学上有局限性）以及meta分析都显示了监测对患者的生存益处。 HCC监测的目标人群是肝硬化患者，且不考虑肝硬化的病因。 由于重度肝功能不全的肝硬化患者不适合接受根治性治疗，所以没有癌症监测的必要。但因肝功能障碍而等待肝移植的患者则需要进行监测，目的是确保肿瘤不会发展到按照既定标准无法进行移植的程度。 一些没有肝硬化的肝病患者也应该被纳为癌症监测目标。慢乙肝患者发生HCC的风险存在地区差异（非洲和亚洲地区的发生风险高于其他地区），且老年、男性、肝纤维化、病毒复制水平高、基因C型以及HCC家族史都提示着更高的HCC发生风险。 虽然无肝硬化的非酒精性肝病患者可能会发生HCC，但实际风险是未知的，且可能非常低。除非有方法可以识别出风险较高的患者，否则不建议对无肝硬化的NAFLD患者进行癌症监测。 HCC的推荐监测方法为：每6个月进行一次腹部超声检查，联合/不联合血清甲胎蛋白水平检测。结果对操作者的依赖性较高，敏感度为47%-84%，特异度＞90%。对肥胖患者，超声检测的实用性会降低。 四、HCC的诊断 在肝硬化患者中，利用影像学技术就可以诊断HCC（图2）。由于肝细胞在恶性转变期间会发生血管转变：良性病灶（如增生性结节）由门静脉系统分支供血，而恶性病灶由肝动脉分支供血。这种转变转化为一种独特的模式：对比增强CT或MRI可显示动脉后期明显强

细胞培养技术个人总结

总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

大连医科大学 博士学位论文 shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为 的景程 姓名：李荣宽 申请学位级别：博士 专业：病理与病理生理学 指导教师：唐建武 201006

shRNA抑制CLIC 1基因表达对小鼠肝癌 细胞株Hca．F生物学行为的影响 博士研究生：李荣宽指导教师： 唐建武教授专业 名称：病理学与病理生理学 摘要 背景：转移潜能是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是肿瘤患者死亡率高、预后差的主要原因。对于上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转 移是其早期转移的主要方式，但确切机制目前仍不清楚。原发性肝癌 (primary carcinoma of the liver)是最常见恶性肿瘤之一，包括肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管上皮癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC)、肝细胞及胆管上皮细胞混合癌三种细胞类 型，其中90％以上为肝细胞癌。全世界每年新发约62．6万例HCC患者， 其中的半数以上病例发生在我国。同时，它也是恶性程度最高、致死率 最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第 二位。即便是经过根治性切除手术治疗，5年的复发转移率仍高达60％， 因此，揭示肝癌转移的分子机制及其关键调控环节，进而采取相应的干 预措施，将有助于减少、甚至避免病人术后发生复发转移，从而达到降 低死亡率的目的。 Hca．F和Hca．P是将小鼠肝癌细胞株H22在61 5小鼠体内反复接种和筛选后得到的一对来源于同一亲本细胞、但是淋巴道转移潜能显著 不同的小鼠肝癌腹水型细胞株。其中Hca．F具有高淋巴道转移潜能，接 种到6l 5小鼠体内后其淋巴结转移率超过70％，Hca．P是低转移潜能 的细胞株，其淋巴结转移率低于30％。通过对比研究二者的差异，可以 为我们揭示小鼠肝癌的淋巴道转移机制提供有益的参考。本课题组在前 期工作中已经应用不同的方法，对Hca．F和Hca．P这一对具有高低不通 淋巴道转移潜能的细胞株进行了一系列系统的研究。首先，利用抑制性 消减杂交技术(suppression substractive hybridization，SSH)及基因 芯片 (Genechip)高通量筛选(high throughput screen，HTS)技术得出了Hca．F 细胞和Hca．P细胞之间一系列差异表达基因，继而采用定量蛋白质组学技术建立了高低淋巴道 转移潜能小鼠肝癌细胞的荧光差异蛋白表达图

GDF11抑制肝癌细胞增殖作用的研究

目录 中文摘要 (Ⅰ) Abstract (Ⅲ) 缩略语 (Ⅶ) 前言 (1) 研究现状、成果 (1) 研究目的、方法 (4) 一、对象和方法 (5) 1.1材料和仪器 (5) 1.2试剂配制 (6) 1.3实验方法步骤 (7) 1.3.1细胞培养 (7) 1.3.2Western blot检测GDF11蛋白表达 (10) 1.3.3CCK-8法检测SMMC-7721细胞体外增殖能力 (14) 1.3.4平板克隆形成实验 (14) 1.3.5CCK-8检测SMMC-7721细胞顺铂敏感性 (15) 1.3.6流式细胞术检测细胞周期分布 (15) 1.3.7裸鼠皮下移植瘤增殖实验 (16) 1.3.8免疫组化法检测GDF11、Ki-67蛋白表达及肿瘤微血管密度 (17) 1.3.9免疫组化结果判定 (18) 1.3.10统计学方法 (18) 二、结果 (20) 2.1GDF11在肝细胞癌SMMC-7721细胞中表达水平检测 (20) 2.2 GDF11过表达明显降低肝细胞癌SMMC-7721细胞体外增殖能力 (20) V

2.3 GDF11过表达明显降低SMMC-7721细胞的克隆形成能力 (21) 2.4 GDF11过表达增加肝细胞癌SMMC-7721细胞对顺铂的敏感性 (22) 2.5 GDF11过表达将肝细胞癌SMMC-7721细胞阻滞在G1期 (23) 2.6 GDF11过表达抑制SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤的增殖能力 (24) 2.7 GDF11、Ki-67、及CD34蛋白在裸鼠皮下移植瘤组织中的表达 (25) 2.8 GDF11蛋白、Ki-67蛋白、MVD的相关性分析 (27) 讨论 (28) 结论 (33) 参考文献 (34) 发表论文和参加科研情况说明 (40) 综述 (41) GDF11蛋白研究进展 (41) 综述参考文献 (46) 致谢 (49) 个人简历 (50) VI

原发性肝癌

一、原发性肝癌 【病理与临床】 原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在消化系统恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食管而居第三位，在部分地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。由于依靠血清甲胎蛋白（AFP）检测结合超声成像对高危人群的监测，使肝癌在亚临床阶段即可作出诊断，早期切除的远期效果尤为显著。加之积极综合治=治疗，使肝癌的五年生存率有了显著提高。原发性肝癌发病年龄多在中年以上，男多于女。原发性肝癌发病隐匿，早期无临床症状，有症状时多已属中晚期，表现为中上腹不适、腹胀、疼痛、食欲缺乏、乏力、消瘦等，其他可有发热、腹泻、黄疸、腹水、出血倾向以及转移至其他脏器而引起的相应症状。 原发性肝癌按组织学类型分为肝细胞、胆管细胞和肝细胞与胆管细胞混合型肝癌三类，其中肝细胞肝癌最多见，占90%以上。按病理形态来分肝癌分为三型： 1、块状型癌结节直径>5cm，其中>10cm者为巨块型，块状型肝癌有膨胀性生长的特点，邻近肝组织和较大的血管、胆管被推移或受压变窄形成假包膜，巨块型肝癌内部多伴出血、坏死。 2、结节型癌结节直径<5cm，可单发或多个，多伴有肝硬化。 3、弥漫型癌结节小，呈弥漫性分布，该型肝癌多伴有明显肝硬化，癌结节与周围肝组织境界不清，易与肝硬化混淆。 另外，将肝内出现单个癌结节且直径<3cm者，或肝内癌结节不超过2个且2个癌结节直径之和<3cm者称作小肝癌。近年来提出将单个肿瘤直径≤2cm肝癌定为微小肝癌。原发性肝癌极易侵犯门静脉分支，癌栓可经门静脉系统形成肝内播散，甚至阻塞门静脉主干引起门静脉高压的表现；经淋巴转移可出现肝门淋巴结肿大，其次为胰周、腹膜后、主动脉旁及锁骨上淋巴结。此外，还可出现膈肌及附近脏器直接蔓延和腹腔种植性转移。 【超声表现】 1、二维超声肝癌结节形态多呈圆形或类圆形，结节内部回声较复杂、大致可分为低回声型、等回声型、混合型，而以低回声型和混合回声型较多见。癌结节内部回声多不均匀，部分肝癌具有周围暗环，有较高的诊断特异性。癌结节后方回声常可呈轻度增强变化，尤其是小肝癌。此外，大部分肝癌具肝硬化背景。不同病理类型肝癌的超声表现也不尽相同，具有各自的特征。

EFTUD2维持肝癌细胞生存并促进其增殖、侵袭转移的相关研究

EFTUD2维持肝癌细胞生存并促进其增殖、侵袭转移的相关研究研究背景肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。最新的全球癌症数据显示,肝癌全球发病率位列第八,死亡率位列第四,其中男性中肝癌死亡率位居前三。 而全球每年一半以上的肝癌新发及死亡病例均发生在中国。在我国,肝癌患者能够早期诊断并接受手术治疗的比例仅有10%-20%,大多数患者在诊断为肝癌时己是晚期或终末期,治疗手段非常局限且预后较差。 多病灶的发展、肝内或远处转移是肝癌患者手术切除后,预后差和高复发率的主要原因。然而,目前关于肝癌术后复发和转移的机制以及有效的控制手段仍未明确。 因此,新的预测指标亟待发现以提高肝癌的早期诊断,进而降低肝癌致死率。延长因子结合蛋白(elongation factor Tu GTP binding domain-containing protein,EFTUD2)是U5小核核糖核蛋白(U5 snRNP)的核心组件,是一种高度保守的GTP酶,参与催化RNA的剪接以及剪接复合体剪接后的解离。 文献报道eftud2基因突变可引起的下颌骨发育不全、头小畸形、唇裂等头面部发育畸形,提示EFTUD2可能是生长发育所必需。此外,研究发现EFTUD2能够介导乳腺癌细胞及神经前体细胞的凋亡。 而EFTUD2在肝癌发生发展中的作用尚无相关报道。本研究通过检测EFTUD2在肝癌组织及其匹配的癌旁组织和正常肝组织中的表达及分布情况,分析EFTUD2对肝癌术后患者生存预后的影响,并进一步探索EFTUD2在肝癌发展过程中发挥的作用及其相关的分子机制。 研究结果1.通过TCGA数据库及疫组织化学染色(IHC)检测组织芯片及126例肝癌及其对应的癌旁组织中EFTUD2的表达情况,结果表明肝癌内EFTUD2高表

原发性肝癌与炎症关系的研究进展

原发性肝癌与炎症关系的研究进展 摘要原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，与炎症密切相关。在我国，肝癌患者中约大多数有慢性乙型病毒性肝炎感染病史；在欧美及日本，肝癌与丙型病毒性肝炎有关。本文总结原发性肝癌与炎症关系的最新研究进展，探讨多种炎症介质对肝癌发生、转移的促进机制，通过阻断相关炎症介质作用，探索出抑制原发性肝癌的发生、发展，减少复发、转移的新治疗途径。 原发性肝癌（primary hepatic carcinoma PHC）是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一，全世界每年新发及死亡病例约占所有恶性肿瘤的5.4%。最新的流行病学调查结果显示，其发病率及死亡率均有上升趋势。原发性肝癌是一种与炎症密切相关的恶性肿瘤，炎症在肝癌的发生和转移过程中具有促进作用[1][2]。本文就原发性肝癌与炎症关系的研究作一综述。 概述 Rudolph Virchow[3]第一次提出炎症在恶性肿瘤进展中起一定的作用，认为慢性炎症可促进肿瘤的生长；随后Wiemann B[4]证明：通过给患者注射化脓性链球菌和粘质沙雷菌引起的急性炎症可使部分患者的恶性肿瘤退化。目前炎症与肿瘤关系的研究成为热点。 大量流行病学调查提示：炎症是导致肿瘤发生或促进肿瘤发展的最主要因素之一，约20%的恶性肿瘤由炎症诱发或促进[1] [2] [5]。炎症与肿瘤发展的多个环节相关，包括肿瘤细胞形成、进展、逃逸、增生、浸润、血管生成、转移。炎症引起恶性肿瘤的分子和细胞机制尚未完全明确，有研究认为：炎症发生后，炎性细胞在迁入炎症部位的过程中产生大量的活性氧、活性氮物质，而且在慢性炎症过程中，内生抗氧化机制的抑制作用也可以产生超负荷的活性物质，这些活性物质诱导DNA损伤，破坏增生细胞的基因稳定性，最终在炎症和活性物质的反复破坏下，细胞基因改变，包括点突变、基因缺失、基因重组[6]。 在我国，原发性肝癌患者中约1/3有明确的乙型病毒性肝炎病史，欧美及日本，肝癌主要与丙型肝炎病毒感染及酒精性肝病有关。肝癌与肝炎病毒、酒精性肝病的关系，国内外已有大量研究，部分机制已经阐明。研究证实：乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，它可以整合插入宿主基因组，改变宿主体细胞基因的表达，导致宿主细胞基因组的不稳定，易发生基因改变，从而转化为肝癌细胞[7]；丙型肝炎病毒（HCV）为单链RNA病毒，可以和多种细胞蛋白作用，促进肝细胞向肝癌细胞转化[8]；酒精性肝病诱导肝癌形成过程中，酒精产物乙醛可直接损伤肝细胞或乙醇代谢产生的反应性氧化剂和脂质过氧化物直接造成DNA损伤[9]。原发性肝癌通常发生在慢性肝损伤的基础上，包括慢性肝炎、肝硬化，这些被认为是癌前病变。慢性肝损伤引起的炎症反应促进肝硬化的发展，并且激活了肝细胞的再生能力[10]。肝脏的修复机制若被短暂的激活，肝脏的结构和功能可迅速恢复，修复机制的持续激活可促进肝癌的形成和发展，肝炎病毒感染和长期饮酒可激活先天性免疫功能，维持持久的炎症反应，从而促进肝癌的形成和发展[11]。 目前研究已证明，在炎症与癌症的关系中，许多炎症介质具有重要作用。炎症介质产生于炎症反应过程中，也可以由肿瘤细胞产生，其中起关键作用的炎症介质包括环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）、核转录因子—kappaB（NF-kB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、补体系统。. 原发性肝癌与Cox-2 环氧化酶（cyclooxygenase，Cox）是花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶，又称前列腺素内过氧化物合成酶，是一种完整的膜结合蛋白，至少有三种形式：Cox-1位于内质网，属于结构型基因，多种正常组织