黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western_blot分析
收稿日期:2008-12-25
基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802)
作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。
黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及
其蛋白产物的Western 2blot 分析
安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3
(1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命
科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019)
摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(G OD )在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株
3.758的葡萄糖氧化酶(G OD )基因定向克隆于原核表达载体pET 211a 上,构建了融合表达的重组质粒pET/G O ,转化E.coli BL21(DE3)plysS ,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,S DS 2PAGE 电泳检测,G OD 基因获得了表达,表达的融合
蛋白相对分子质量为66.5kDa 。用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(E LIS A )测定其效价为106,West 2
ern 2blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗G OD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(G OD )抗体的制备
奠定了基础。
关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;E LIS A ;Western 2blot 中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04
Prokaryotic Expression and Western 2blot Analysis of G lucose Oxidase
G ene from Aspergillus niger
AN Y u 2lin 1,S UN Rui 2fen 1,ZHANG He 2ling 2,G UO Shu 2chun 1,Y AN Su 2li 3
(1.Biotechnology Research Center ,Inner M ong olia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences ,Huhhot 010031,China ;2.C ollege of Life Science ,Inner M ong olia University ,Huhhot 010021,China ;3.Agricultural C ollege of Inner M ong olia Agricultural University ,Huhhot 010019,China )Abstract :In order to further study expressed level and condition of G lucose oxidase (G OD )from Aspergillus niger 31758in E.coli ,the coding region of G OD from A.niger 3.758was inserted into the prokary otic expression vector pET 2
11a ,and the recombinant plasmid was trans formed into E.coli BL21(DE3)plysS.The result of S DS 2PAGE showed that the G OD gene was expressed by IPTG induction ,and the m olecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An 2tiserum was produced in rabbit immunized with commercial G OD ,and E LIS A analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western 2blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the expressed fusion protein.The study established basis for preparation of G OD antibody from Aspergillus niger 3.758.
K ey w ords :Aspergillus niger 3.758;G lucose oxidase gene ;Fusion expression ;Antiserum ;E LIS A ;Western 2blot
葡萄糖氧化酶(β2D 2glucose :oxygen 12oxidoreduc 2tase EC1.1.3.4,简称G OD ),催化β2D 葡萄糖氧化生
成δ2葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2(β2D 2glu 2cose +O 2→glucose 2δ2lactone +H 2O 2)[1]。G OD 的活性最早是1928年由Muller 在黑曲霉的抽提物中发现
的,后来在黑曲霉[2,3]和青霉[4]中都纯化到了G OD 。现已从几种微生物中得到了G OD ,但从黑曲霉中得到的G OD 活性最强。目前G OD 已在临床检测、食
品工业、生物传感器、有机酸生产及抗真菌病转基因研究等方面得到广泛应用[5],而且编码G OD 的基因
已从不同的真菌菌株中分离、克隆。Frederick 等[1]和Whittington 等[6]将来自黑曲霉的G OD 基因成功地重组到酵母中,获得了具有生物活性的酿酒酵母G OD 。Witt 等[7]等在大肠杆菌中表达了青霉G OD 。国内周亚凤等[8]也在酵母中高效表达了黑曲霉G OD 。母敬郁等[9]
利用高表达分泌纤维素酶的真菌
华北农学报?2009,24(4):84287
瑞氏木酶表达了重组的黑曲霉G OD。本试验将押辉远[10]从黑曲酶中国株3.758中克隆的G OD基因连接到原核表达载体中并实现了在大肠杆菌中的表达,为进一步研究黑曲酶中国株31758G OD在大肠杆菌中的表达水平和条件及抗血清的制备奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 表达载体pET211a购自德国N ovagen公司,E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞购自清华大学北京天为时代科技有限公司,克隆有G OD基因的重组质粒pMD/G O由内蒙古大学张鹤龄教授惠赠。
1.1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶Hin dⅢ(Promega产品)、Bam H I(Fermentas产品);T4DNA Ligase、Mini plasmid DNA kit、DNA MakerⅢ(清华大学北京天为时代科技有限公司产品);E.Z.N.A(R)G el Extraction K it(美国Omega Bio2tek产品);Am p、IPTG X2gal、LA Taq DNA Ploymerase、λDNA/Hin dⅢMaker、低分子量蛋白Maker(T aK aRa公司产品);超速高灵敏度蛋白质电泳快速染液(南京博尔迪生物科技有限公司产品);BAS、T ween20(购自上海生物工程技术服务有限公司);葡萄糖氧化酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品);山羊抗兔IgG2AP、NBT/BCIP染色kit、pNpp(华美公司),其他试剂均为进口或国内分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物 引物1,2按文献[11],由北京华大中生科技发展有限公司合成。
1.2.2 G OD基因与表达载体的连接 用Bam H I/ Hin dⅢ双酶切重组质粒pMD/G O和表达载体pET2 11a,得到目的基因小片段和载体大片段,分别回收纯化,回收试剂盒为E.Z.N.A(R)G el Extraction K it,方法按产品使用说明进行。用T4DNA Ligase将目的片段与载体片段连接。
1.2.3 E.coli感受态细胞的转化 用连接产物转化 E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞,转化方法按产品说明书进行。筛选培养基中添加Am p、IPTG、X2 gal,同时分别用pET211a空载体和水作对照,在Am p 的平板上筛选阳性重组子。
1.2.4 重组子的鉴定与序列测定 将转化所得白色单菌落,用K ieser法[12]筛选重组质粒,琼脂糖凝胶电泳检测,选取落后于空质粒的单菌落,用快速PCR的方法扩增目的片段。PCR扩增反应条件为94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火30s, 72℃延伸3min,30次循环,72℃保温10min;碱裂解法小量提取质粒,用Bam H I/Hin dⅢ双酶切鉴定重组质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。随机选取一个重组质粒送到大连宝生物公司测序,鉴定所插入的序列及其读码是否正确。
1.2.5 G OD基因的诱导与表达 挑取测序正确的阳性克隆,接种于10m L含Am p100mg/L的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。用含Am p100 mg/L的LB液体培养基,以1∶50稀释进行扩大培养,培养至OD600分别为0.6和1.0时,加入诱导剂IPTG使其终浓度分别为0.5mm ol/L和1mm ol/L, 37℃诱导培养2,4,6h,同时以未诱导的重组菌pET/G O培养物及诱导4h的pET211a空载体的诱导培养物作为阴性对照。
1.2.6 细胞内总蛋白质的制备及S DS2PAGE电泳检测表达蛋白 分别取以上未诱导、诱导及只含pET211a空载体的细菌培养物进行细胞内总蛋白质的制备。制备过程为:将1m L细菌培养物12000 r/min离心2min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。加100μL冰预冷的50mm ol/L T ris2HCl振荡悬浮菌体,0℃,12000r/min离心1min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。加50μL ddH2O,菌体分散后,立即加入50μL2×S DS上样缓冲液悬浮沉淀,振荡20s,沸水浴中煮5min,快速冰浴2min以上,超声波粉碎5min,12000r/min离心10min,取上清液5μL进行分离胶7.5%,浓缩胶5%的S DS2 PAGE电泳[13],电泳条件:浓缩胶18mA,分离胶25 mA,同时以黑曲霉葡萄糖氧化酶(G OD)为阳性对照(CK+)。用超速高灵敏度蛋白质电泳快速染色液轻摇染色1h至条带清晰,用ddH2O洗胶2～3次以终止反应,然后观察并照相。
1.2.7 葡萄糖氧化酶抗体的制备 称取20mg
G OD+10m L ddH2O溶解,过滤除菌,制得2mg/L 的G OD溶液。将1m L G OD溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合,用注射器吸打几次使其彻底乳化,获得家兔免疫用抗原。用该抗原免疫家兔,第一次用量为2m L(浓度1mg/L),共注射10个部位,每个部位注射0.2m L。免疫注射28d后,再用同一注射方法进行首次加强免疫,乳化抗原用量为1m L,1m L G OD溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合。首次加强免疫14d后,再用1m L的抗原进行第二次加强免疫。第49天,采用心脏采血的方法取兔的全血,兔血在室温静置使之凝固,将溢出的淡黄色血清转入离心管中,4000g离心10min,去除残留的红细
4期安玉麟等:黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的W estern2blot分析85
胞及其他碎片,收集上清液,-70℃保存备用。
1.2.8 抗血清的滴度测定及表达产物的Western 2blot 检测 采用E LIS A 法[14]检测免疫家兔抗血清的效价。按实验指导[15]将G OD 基因的诱导表达产物在7.5%的S DS 2PAGE 上分离后,转移至硝酸纤维素膜上,按戎芳[16]的方法进行抗体结合和酶显色反应。一抗为G OD 的抗血清,工作浓度为1∶1000;二抗为山羊抗兔IgG 2AP (碱性磷酸酯酶AP 偶联的山羊抗兔IgG ),工作浓度为1∶1000,最后用NBT/BCIP 显色。
2 结果与分析
2.1 GOD 基因和表达载体大片段的回收与纯化
用Bam H I/Hin d Ⅲ双酶切重组质粒pMD/G O ,0.8%琼脂糖凝胶电泳获得2.6kb 和1.8kb 2个预期大小的片段(图1,泳道3),用E.Z.N.A (R )G el Ex 2traction K it 回收得到1.8kb 的目的片段(图1,泳道4)。用同样的酶双酶切表达载体pET 211a ,获得一个超前对照质粒的大片段,(图1,泳道7),电泳回收该片段,纯化得到的片段与酶切产物大小相同(图1,泳道8)
。
1,5.λDNA/Hin d III M arker ;2.pM D/G O 质粒;3.Bam H I/Hin d III 双酶
切pM D/G O ;4.G OD 回收片段;6.pET 211a 质粒;7.Bam H I/Hin d III 双酶切pET 211a ;8.pET 211a 回收片段。1,5.λDNA/Hin d III M arker ;2.pM D/G O plasm id ;3.Bam H I/Hin d III di 2gested pM D/G O ;4.Extracted G OD fragment ;6.pET 211a plasm id ;7.Bam H I/Hin d III digested pET 211a ;8.Extracted pET 211a fragment.
图1 Bam H I/Hin d III 酶切pMD/G O 和pET 211a
Fig.1 pMD G O and pET 211a digested by Bam H I /Hin d III
2.2 目的小片段与载体大片段的连接与转化
在T 4DNA Ligase 的作用下,目的片段与载体大片段于16℃保温过夜进行连接反应,连接产物转化E.coli BL21(DE3)plysS 培养16h 后,在涂有Am p 的平板上有白色菌落生长,空载体pET 211a 转化的平板上只有蓝色菌落生长,而用水作对照的平板上无菌落生长,初步断定白色菌落中含有重组质粒。2.3 重组质粒的鉴定与序列测定
随机挑取3个白色单菌落和1个蓝色单菌落,用K ieser 法提取质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳表明,从3个白色单菌落中均获得滞后空载体pET 211a
(516kb )的质粒带,大小为7.4kb ,与预期结果一致
(图2)。以3个质粒DNA 为模板,进一步对其进行PCR 检测和双酶切鉴定,结果从3个质粒DNA 中均扩增出1.8kb 的G OD 基因片段(图3),双酶切产物
中也有1.8kb 的目的带(图4,泳道5～7),表明3个质粒均为重组质粒,由此证明,G OD 基因原核表达载体构建成功。随机选取一个重组质粒(3号)命名为pET/G O ,测序结果证明G OD 基因序列存在,而且
阅读框架正确。
1.λDNA/Hin d III M arker ;
2.pET 211a 质粒;3～5.重组质粒。1.λDNA/H in d III M arker ;2.pET 211a plasm id ;3-5.Recom binant plasm ids.
图2 重组质粒的鉴定
Fig.2 I ndentification
of recombinant plasmid
1.λDNA/Hin d III M arker ;2～4.重组质粒的PCR 扩增。1.λDNA/Hin d III M arker ;2-4.PCR products from recombinant plasm id.
图3 PCR 扩增鉴定重组质粒
Fig.3 I ndentification of recombinant
plasmid by PCR amplification
1.λDNA/Hin d III M arker 1;2～4.重组质粒;
5～7.Bam H I/Hin d III 双酶切重组质粒。1.λDNA/Hin d III M arker 1;2-4.Recombinant plasm ids ;5-7.Bam H I/Hin d III digested recombinant plasm ids.
图4 重组质粒的酶切鉴定
Fig.4 R estriction enzyme digestion analysis
of recombinant plasmid
2.4 融合蛋白T72G OD 的诱导表达
取经IPTG 诱导含重组质粒pET/G O 的菌株裂解物进行S DS 2PAGE 分析,同时以未诱导的pET/G O 菌株裂解物和诱导4h 的空质粒pET 211a 的菌株裂解物作为对照,结果表明,G OD 的表达量明显高于其他杂蛋白,表达产物为含有T 7
gene 10的融合蛋
86 华 北 农 学 报24卷
白,相对分子量约66.5kDa (G OD 基因编码蛋白
651451kDa +T 7标签蛋白1.097kDa ),Sigma 公司的天然G OD 分子量大小为80kDa [9],而未诱导的重组菌和诱导4h 的pET 211a 的菌体裂解物没有预期蛋白带出现,进一步分析发现诱导的重组菌OD 600为0.6时表达的预期蛋白量多于OD 600为1.0时的蛋
白,而诱导时间和IPTG 的浓度对目的蛋白的诱导表达量影响不大,图5为IPTG 终浓度为0.5mm ol/L 时的G OD 表达的S DS 2PAGE 电泳检测
。
1.低分子量蛋白M arker ;
2.葡萄糖氧化酶;
3.未诱导的pET/G O ;
4.IPTG 诱导4h 的pET 211a ;5,6,7.OD 600=0.6时,IPTG 分别诱导2,4,6h 的pET/G O ;8,9.OD 600=1.0时,IPTG 分别诱导2,6的pET/G O 。1.LMW protein M arker ;2.C ommercial G OD ;3.pET/G O without induced by IPTG;4.pET 211a induced by IPTG for 4h ;5,6,7.pET/G O induced by IPTG 2,4,6h respectively at OD 600=0.6;8,9.pET/G O induced by IPTG 2,6h respectively at OD 600=1.0.
图5 GOD 基因表达的SDS 2PAGE 检测
Fig.5 SDS 2PAGE analysis expression of GOD gene
2.5 抗体的效价测定及表达产物的特异性检测
经过二次加强免疫获得抗血清,用E LIS A 方法测定抗血清效价为106。W estern 2blot 检测表明,制备的抗血清与未诱导的pET/G O 细菌总蛋白及诱导4h 的空载体pET 211a 没有出现特异性反应,而与诱导的pET/G O 细菌总蛋白及天然黑曲霉G OD 产生较强的特异性反应,证明G OD 基因在大肠杆菌中获得了表达,而且W estern 2blot
带的大小与预期结果相符。
1,2.OD 600=0.6时0.5m m ol/L IPTG 分别诱导4,6h 的pET /G O ;3.未诱导的pET /G O ;4.0.5m m ol/L IPTG 诱导4h 的pET 211a ;5.葡萄糖氧化酶。1,2.pET/G O induced by 0.5mm ol/L IPTG for 4h ,6h respectively at OD600=0.6;3.pET/G O without induced by IPTG;4.pET 211a induced by 0.5mm ol/L IPTGfor 4h ;5.C ommercial G OD.
图6 Western 2blot 检测
Fig.6 Western 2blot analysis
3 讨论
本试验中的G OD 基因为押辉远[10]从黑曲霉中国株3.758中通过PCR 扩增获得,通过测序表明,所克隆的G OD 基因在761bp 处发生了琥珀无义突变,致使该基因不能编码连续的酶蛋白亚基,但由于琥珀终止密码是一个弱终止密码,很容易通过一些
校正途径通读阅读框,因此将含有琥珀无义突变的位点,通过PCR 定点突变的方法将761bp 处的A 置换为G (即T AG →TGG ),这样在克隆的G OD 基因中就没有终止密码子,因而使G OD 基因成为编码完整酶蛋白亚基的功能基因。本研究的S DS 2PAGE 和Western 2blot 也表明,插入到表达载体中的G OD 基因
在IPTG 的诱导下表达了完整的蛋白。参考文献:
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黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western_blot分析
收稿日期:2008-12-25 基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802) 作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及 其蛋白产物的Western 2blot 分析 安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3 (1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命 科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019) 摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(G OD )在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株 3.758的葡萄糖氧化酶(G OD )基因定向克隆于原核表达载体pET 211a 上,构建了融合表达的重组质粒pET/G O ,转化E.coli BL21(DE3)plysS ,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,S DS 2PAGE 电泳检测,G OD 基因获得了表达,表达的融合 蛋白相对分子质量为66.5kDa 。用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(E LIS A )测定其效价为106,West 2 ern 2blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗G OD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(G OD )抗体的制备 奠定了基础。 关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;E LIS A ;Western 2blot 中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04 Prokaryotic Expression and Western 2blot Analysis of G lucose Oxidase G ene from Aspergillus niger AN Y u 2lin 1,S UN Rui 2fen 1,ZHANG He 2ling 2,G UO Shu 2chun 1,Y AN Su 2li 3 (1.Biotechnology Research Center ,Inner M ong olia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences ,Huhhot 010031,China ;2.C ollege of Life Science ,Inner M ong olia University ,Huhhot 010021,China ;3.Agricultural C ollege of Inner M ong olia Agricultural University ,Huhhot 010019,China )Abstract :In order to further study expressed level and condition of G lucose oxidase (G OD )from Aspergillus niger 31758in E.coli ,the coding region of G OD from A.niger 3.758was inserted into the prokary otic expression vector pET 2 11a ,and the recombinant plasmid was trans formed into E.coli BL21(DE3)plysS.The result of S DS 2PAGE showed that the G OD gene was expressed by IPTG induction ,and the m olecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An 2tiserum was produced in rabbit immunized with commercial G OD ,and E LIS A analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western 2blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the expressed fusion protein.The study established basis for preparation of G OD antibody from Aspergillus niger 3.758. K ey w ords :Aspergillus niger 3.758;G lucose oxidase gene ;Fusion expression ;Antiserum ;E LIS A ;Western 2blot 葡萄糖氧化酶(β2D 2glucose :oxygen 12oxidoreduc 2tase EC1.1.3.4,简称G OD ),催化β2D 葡萄糖氧化生 成δ2葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2(β2D 2glu 2cose +O 2→glucose 2δ2lactone +H 2O 2)[1]。G OD 的活性最早是1928年由Muller 在黑曲霉的抽提物中发现 的,后来在黑曲霉[2,3]和青霉[4]中都纯化到了G OD 。现已从几种微生物中得到了G OD ,但从黑曲霉中得到的G OD 活性最强。目前G OD 已在临床检测、食 品工业、生物传感器、有机酸生产及抗真菌病转基因研究等方面得到广泛应用[5],而且编码G OD 的基因 已从不同的真菌菌株中分离、克隆。Frederick 等[1]和Whittington 等[6]将来自黑曲霉的G OD 基因成功地重组到酵母中,获得了具有生物活性的酿酒酵母G OD 。Witt 等[7]等在大肠杆菌中表达了青霉G OD 。国内周亚凤等[8]也在酵母中高效表达了黑曲霉G OD 。母敬郁等[9] 利用高表达分泌纤维素酶的真菌 华北农学报?2009,24(4):84287
黑曲霉菌株发酵生产糖化酶发酵罐设计
目录 第一章绪论 (1) 第二章罐体几何尺寸的确定 (2) 2.1夹套反应釜的总体结构 (2) 2.2 几何尺寸的确定 (2) 第三章罐体主要部件尺寸的设计计算 (5) 3.1 罐体 (5) 3.2 罐体壁厚 (5) 3.5人孔和视镜 (6) 3.6接口管 (6) 3.6.1 管道接口（采用法兰接口） (6) 3.6.2 仪表接口 (7) 第四章冷却装置设计 (8) 4.1 冷却方式 (8) 4.2 装液量 (8) 4.3 冷却水耗量 (9) 4.4 冷却面积 (9) 第五章搅拌器轴功率的计算 (10) 5.1不通气条件下的轴功率P0 (10) 5.2通气搅拌功率Pg的计算 (11) 5.3电机及变速装置选用 (11) 第六章结论 (13) 参考文献 (13)
第一章绪论 我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。 糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉A.S.3.4309是国内糖化酶活性最高的菌株之一。 糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。 综合温度、PH等因素选择黑曲霉A.S.3.4309菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为4.5，培养基为玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。 主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉2.5%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。 发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。 发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。 这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本視图，和各种表达方式，
黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究
第14卷第3期武汉科技学院学报Vo1.14No.3 2001年9月JOURNAL OF WUHAN INS TITUTE OF SCIE NCE AND TECHNOLOGY Sep.2001 黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究 王亚林严建芳 (武汉工业学院生物与化学工程系武汉430022) 摘要研究了黑曲霉液体培养生产植酸酶的发酵工艺,研究了培养基碳源、诱导物、表面活性剂等因素对产酶的影响,对发酵时间、p H变化规律等进行了研究和分析。 关键词植酸酶黑曲霉发酵X 中图分类号Q815;Q814.9 植酸酶作为一种饲料和食品添加剂,在国内外已开始得到广泛应用,特别是由于其在改善环境方面的作用,更是受到人们的极大关注。植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量较高而具有较大的开发价值。目前,美国、荷兰和丹麦等国已先后运用发酵法生产植酸酶,我国也已在进行这方面的研究开发。可以预计,植酸酶制剂将有良好的市场前景。 1材料与方法 1.1菌种 黑曲霉(Aspergillus niger)W S201,武汉工业学院微生物室保存。 1.2培养基 1.2.1种子培养基:豆芽汁蔗糖培养基。 1.2.2摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO4# 7H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。 1.3培养方法 配制培养基时适当加热、摇动或搅拌,使淀粉溶解成液态或胶状,121e灭菌20min。在30?1e下摇床培养3~5d(转速220~250r/min)。 1.4植酸酶的测定 植酸酶活力的定义:37e,pH5.5条件下每分钟从植酸钠中释放出1L mol无机磷所需的酶为1u。 酶活测定方法:取0.1ml含酶液加至一洁净试管中;加入0.9ml反应液,反应液为含0.5%植酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5),在37e恒温反应30min;加入1ml10%三氯醋酸终止反应;加入2ml显色液,摇匀后静置15~30min显色,显色液由1%钼酸铵50ml与3.66 X收稿日期:2001-06-26 作者简介:王亚林,男,副教授,在读博士生;研究方向:发酵工程、生化工程
酸性蛋白酶生产工艺
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
两种曲霉糖化性质的比较
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液
酸性蛋白酶的作用机理
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性
大麦_淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在 酿酒酵母中的表达和分泌 3罗进贤 李政海 李文清 (中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275) 摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精. 关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌 酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌. 1 材料和方法 111 材料 11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒. 11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目 中国科学 (C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C ) 1998年2月
果胶酶的制备与应用
1104110116 1041101班 食品学院 陈家晟 2013/6/25
摘要：果胶酶是分解果胶质酶类的总称。通常包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)、果胶裂解酶(PL)等主要组分。本文主要叙述了果胶酶的制备方法和主要的应用。 关键词：果胶；果胶酶；黑曲霉；制备；应用； 前言：50年前国外就将果胶酶应用于果汁的加工，现有商品果胶酶制剂生产。近年来，为了满足国内市场对果胶酶的需求，一些研究单位对果胶酶的生产菌种及研制[1]展开了积极的研究。 此外，随着中国三大产业的发展，特别是第一和第二产业的高速发展，果胶酶的应用也越来越广泛。现在果胶酶主要应用于果汁加工和果酒酿造。除此之外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。 1.果胶酶及其简述 1.1果胶酶的定义 果胶酶，英文别名:Pectase; Polygalacturonase，是个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。外观呈浅黄色粉末状。主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。 1.2果胶酶的特性 特性：作用pH:3.0-6.0，最适作用pH:3.0 温度特性：作用温度为15-55℃左右。最适作用温度为 50℃。 1.3果胶酶的作用原理 果胶酶是从根霉中提取的,可以分解细胞间的果胶物质，可以澄清果汁和分离细胞。2.果胶酶的制备 2.1高产酶菌株的选育 激光诱变育种:由成熟的黑曲霉斜面孢子制成一定浓度的孢子悬液，在搅拌条件下，采用810nm多模连续输出的半导体激光进行辐照.将辐照过的抱子悬液进行分离培养，挑单菌落接种于装有含1%果胶的麦芽汁试管中，置30℃恒温培养5-6d，观测并选出透明层较对照为最长的试管，将其孢子接种于斜面培养，在发酵培养基进行复筛，选出产酶最高者[2]. 2.2果胶酶的生产工艺 固体发酵生产果胶酶工艺流程: 培养料拌料 ↓ 灭菌 ↓ 斜面菌种→麸皮菌种→接种曲盘发酵培养 ↓ 出曲浸提 ↓ 离心甩滤→去渣 ↓ 填充剂脱色 ↓↓ 成品包装←喷雾干燥←超滤浓缩
酶制剂——植酸酶
酶制剂——植酸酶 早在1915年，Anderson提出天然植酸磷利用率不同于化学分离纯化产品的一个可能原因是饲料成分中存在水解植酸磷为无机磷的酶——植酸酶，并对植酸酶的来源、理化特性及作用机理进行了研究，从而引起了许多学者的广泛关注。近年来，随着发酵工程和生物技术的迅速发展以及人们环境保护意识的提高，采用DNA重组技术使微生物产生植酸酶活性大幅度提高，大大降低了植酸酶生产成本，从而使之得到广泛应用。植酸酶现已成为饲料酶制剂研究的一个热点，尤其在一些畜禽饲养密度大、环境污染严重的国家如美国、加拿大、芬兰、荷兰、法国、瑞士等。许多科学家对这一课题的研究很感兴趣，欧洲、北美和其它地区对此的兴趣也与日俱增。1994年欧共体、美国、芬兰、丹麦、德国等国的生产企业均前后推出各种植酸酶制剂,并利用DNA重组技术获得生产植酸酶的工程菌,为广泛应用植酸酶提供了可能。 一、植酸酶结构及性质 植酸酶，又称为肌醇六磷酸水解酶，是一种可使植酸磷复合物中的磷变成可利用磷的酸性磷酸酯酶。植酸酶广泛存在于动植物组织中，也存在于微生物（细菌、真菌和酵母）。目前分离出的植酸酶主要有两种：3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和6-植酸酶（EC 3.1.3.26），前者最先水解的是肌醇3号碳原子位置的磷酸根，主要存在于动物和微生物；后者最先水解的是6号碳原子的磷酸根，主要存在于植物组织。因此，动物胃肠道可能有三种来源的植酸酶，但主要来源于饲料本身以及来源于微生物合成。 大量高浓度的植酸酶主要存在于无花果曲霉和黑曲霉与小麦麸的培养物中。因此饲料植酸酶的生产目前主要使用微生物曲霉菌株。霉菌植酸酶分子量一般在60 ~ 100KDal之间，曲霉植酸酶分子量较大。如土曲霉为214Kdal，无花果曲霉为85 ~ 100KDal，黑曲霉为200KDal。细菌植酸酶分子量一般较小，如大肠杆菌为42Kdal，枯草杆菌为38KDal。霉菌植酸酶通常有一个最适pH，在4.2 ~ 5.5范围内。细菌植酸酶最适pH稍高一些。据报道,某些霉菌植酸酶，特别是曲霉植酸酶具有多个最适pH值。酶的最适温度因酶来源不同而有差异。霉菌植酸酶适宜温度通常在45 ~ 57℃范围内，黑曲霉为53℃，无花果曲霉为55℃。
酸性蛋白酶提交
酸性蛋白酶的研究进展 姓名：石宏志班级学号：090432215 中文摘要：提起酶不了解的人都会觉得很神奇，为什么人类、动物、植物体内都会有酶，酶究竟是什么东西。此文就对酸性蛋白酶从菌种培养、工艺流程、在生产生活中的应用、产过程中的注意事项及最后酶的提纯做了简单的陈述。酸性蛋白酶，酶的一种，它的研究进展从这里我们就可以窥一斑而见全身了。 Abstract:Mentions enzyme don't understand people would think very magical, why do humans, animals, plants body will have enzymes, enzyme what exactly. The article from strains of acid protease training, processes and the application in production and life, and production process the matters needing attention and finally enzyme makes simple the purification of statement. Acid protease, one of the enzymes, the research progress of it from here we can peep one spot and see whole body. 中文关键字：酸性蛋白酶，扩培，发酵，盐析，结晶 Key words：Acid protease, enlarge cultivates, fermentation, salting-out, crystallization 前言 21世纪科技领头羊可以说是非生物工程莫数，从DNA双螺旋结构的推出，到多利克隆羊的出世；从原来对污染海洋的石油用燃烧方法，到现在的微生物处理；从原始的青草喂牲畜，到现在的蛋白饲料等等，这诸多变化之中无一脱离了生物催化剂——酶。高效、绿色环保、投入小收获大众多优秀辞藻被冠在酶身上。 蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。 酸性蛋白酶(acidic protease)是指在酸性(pH 2~5)环境下催化蛋白质肽键水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。其在食品、酿造、饲料、毛皮与皮革、胶原纤维和医药等工业领域中的应用很广。近年来，酸性蛋白酶作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂的应用得到人们的重视。下面就对酸性蛋白酶的生产做简单的介绍。 1．酸性蛋白酶的概述 酸性蛋白酶(acidic protease)在1954年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量30000~40000，等电点（pH3~5）。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在
果胶酶预设方案
产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种 1.实验材料 1.1菌种 由中科院提供 1.2.1斜面培养基 察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，七水合硫酸锰0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000mL。（121度灭菌20min） 1.2.2平板分离培养基（察氏培养基） 1.2.3果胶平板培养基（％） 磷酸氢二钾0.1，硝酸钠0.3，硫酸镁0.05，硫酸铁0.001，琼脂2.0，果胶0.2，pH5.5 1.2.4固体发酵复筛培养基 1.麸皮10g，豆粕0.25g，硝酸钠0.35g，硫酸铵0.1g，装入250mL三角瓶，按料水比（w/v）1：1.5加入pH5.0~5.5的水。（0.1Mpa/cm2灭菌30min） 2试验方法 2.1出发菌种的筛选 2.1.1菌种的活化 取斜面培养基的黑曲霉菌种一支，接种于察氏斜面培养基，36℃恒温培养5~7天。 2.1.2制备孢子悬液 取活化的斜面一支，加入无菌水洗下孢子，制成均匀的孢子悬液，调整孢子浓度为1.0×106个/mL。（参考一定浓度菌悬液的制备，比较几种方法的准确度） 2.1.3平板分离 将菌悬液进行系列稀释，使之成为十万、一万、一千、一百个孢子每毫升，并分别涂布与果胶平板培养基，36℃恒温培养5~7天。 2.1.4菌种的筛选 1向平皿中加入5mL碘液，静止2min，即可见清晰的透明圈，将碘液倒出加入5mL生理盐水10min，将剩余碘液冲洗干净，选取透明圈与菌落直径比大的接种与斜面培养基，并分别进行固体发酵，选取酶活力高的作为出发菌株。 2黑曲霉的直径之比最大，说明它的产酶能力较高，所以采用黑曲霉作为出发菌株。实验采用刚果红平板培养基作为筛选培养基，培养基中果胶作为唯一碳源，又作为底物诱导物，诱导果胶酶的产生。刚果红作为透明圈指示剂，可能与果胶形成红色络合物，果胶酶分解果胶络合物消失，在平板上形成透明水解圈。透明圈与菌落直径之比越大，酶活力越高。 2.2紫外线照射剂量的选择 2.2.1取36℃恒温培养5天的出发菌种斜面，用生理盐水洗下孢子，将孢子悬浮液置于无菌的盛有玻璃 珠的三角瓶中，震荡使孢子分散，再以双层无菌擦镜纸过滤，使形成分散程度达到90~95％的单孢子悬液。然后用生理盐水将孢子悬浮液调整到一百万个每毫升。 2.2.2吸取10mL上述悬浮液，加入直径9cm的底部平整的平皿中。将15W紫外灯打开，预热30min， 使光波稳定。 2.2.3将盛有悬浮液的平皿置于诱变箱内的磁力搅拌器上，平皿距紫外灯管垂直距离30cm，调节搅拌 子的转速，待搅拌子转速稳定后，打开平皿盖子照射，开始计时，加盖止。（照射时间可以预设值为210s） 2.3突变株的筛选 2.3.1突变株的初筛 方法同2.1 2.3.2突变株的复筛
黑曲霉生产糖化酶及酶活测定_单海艳
第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 2010 92 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03 黑曲霉生产糖化酶及酶活测定 单 海 艳 （牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000） 摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。 关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言 （一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位 黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。 2．黑曲霉形态、生理、生态特性 孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。 3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。 （二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位 糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。 2．糖化酶的性质 糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α-1.4-键。一般淀粉水解程度达80％。 （1）糖化酶中糖和蛋白组成 糖化酶是一种糖蛋白，通常碳水化合物占4%-18％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖，糖化酶残基的排列在其热和酸碱稳定性上有特殊意义。 （2）糖化酶组分多型性 真菌产生的糖化酶组分多型性是常见的，市售的糖化酶中可分离出葡萄糖酶?和葡萄糖酶И两种组分。而市售黑曲霉生产的糖化酶曾分离出六种活性组分，每种均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖。这六种组分的分子量，沉淀系数，化学组分，等电点，酶的动力学及其它性质各异。培养基成分和的生产条件对糖化酶组分多型性也有影响，天然糖化酶在微生物培养或酶的制备过程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而成多型性的酶类。 （3）糖化酶的热稳性 工业用的糖化酶都是利用它的热稳性，α-环状糊精可提高糖化酶的热稳性，最适温度范围一般为50℃～60℃。 （4）从酶PH 稳定性上看： 糖化酶具较宽的PH 值适应范围，但最适PH 为4-5。 （5）Ca 离子与酶结合后可使结构变得松散些，更有利于催化反应。 （6）糖化酶与底物亲和性 收稿日期：2009-11-26 作者简介：单海艳（1977—），女，牡丹江大学化工系讲师，研究方向：生物教学。 DOI:10.15907/https://www.wendangku.net/doc/0d17648460.html,ki.23-1450.2010.07.036
植酸酶
X X 大学题目：植酸酶 姓名 XX 学号XXXXXXXXX 学院生命科学学院 年级专业 2012级微生物 课程名称发酵工程调控 任课教师 XX
植酸酶 生命科学学院20XX级研究生 摘要：文章介绍了植酸酶分类和来源，以及现阶段植酸酶在饲料、食品、酒精、环境保护方面的应用，其中在饲料中的广泛应用给植酸酶的发展带来了良好的前景。植酸酶的生产主要有两种方法：固体发酵和液体发酵，虽然固体培养设备比较简单、成本低、对环境危害小、易于推广，但放大比较困难、培养参数控制较复杂、容易污染杂菌，而且生产的植酸酶分离纯化较难因此目前工业生产主要用液体发酵的方法进行生产。 关键词:植酸酶固体发酵液体发酵培养参数 1前言 1.1植酸酶的简介 植酸的化学名称是肌醇六磷酸酯，是肌醇和磷酸根结合而成的化合物，其化学结构是由六个碳原子构成的正六边形，每个碳原子上连有一个带负电的磷酸根，具很强的螯合能力，与EDTA接近。植酸的分子式为C6H18O24P6，含磷量为281.6mg/g。其结构见下图： 植酸酶( phytase)属于磷酸水解酶，是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸( 或盐) 的一类酶的总称, 系统名称为肌醇六磷酸酶, 属于磷酸单脂水解酶, 是一类特殊的酸性磷酸酶,水解产物是肌醇、无机磷及其他可能与植酸结合的物质，如钙、锌、镁、锰等微量元素以及蛋白质、淀粉。
1.2植酸酶的分类 植酸酶的分类及来源植酸酶主要指 6-植酸酶和 3-植酸酶。 6-植酸酶( EC 3. 1. 3. 26) 首先催化磷酸从肌醇的第六位碳脱落, 3-植酸酶( EC 3. 1. 3. 8) 首先使肌醇第三位碳的磷酸解离, 最终产物都是单磷酸肌醇和正磷酸。植酸酶有三种来源:动物、植物和微生物, 因来源不同而具有显著不同的分子特征和催化 特性。 a 在动物消化道内作用的植酸酶可能来源于：a 小肠内分泌； b 肠道微生物产生； c 饲料中的内源性植酸酶； d 外源微生物产生的植酸酶等。其中，外源植酸酶在植酸水解过程中起主要作用。在自然界中，植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物中。 b植物植酸酶均属于肌醇六磷酸-6-磷酸酶，存在于大多数禾谷物中，其活性有很大的 差异。而小麦、大麦和经处理的玉米蒸馏物的活性很高。谷物植酸酶在干燥状态下没 有活性，在消化道被激活后才有活性。 C 微生物植酸酶属于肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，自然界中许多微生物都产植酸酶，目 前认为产量最高的是真菌，其主要来源于曲霉菌和黑曲霉菌。 1.3 植酸酶的理化性质 植酸酶是一种单体蛋白, 其分子量因来源不同差异很大, 一般在 35-700 kD 之间, 包括一个大分子和一个小肽片断。研究发现无花果曲霉植酸酶有594 个氨基酸残基, 其中包括 37% 的非极性氨基酸、42% 的极性中性氨基酸、11. 5% 的酸性氨基酸和9. 5% 的碱性氨基酸, 其二级结构由 17. 3% 的 A螺旋、29%B折叠、32.6% 的转角和 24. 7% 的无规卷曲所形成。植酸酶除含有蛋白质外, 还含有约 27. 3%的寡糖, 是一种糖蛋白。 纯化的酶晶体结构包含434 个氨基酸, 115 个水分子和一个硫化物结合位点的二价硫 离子。 1.4 植酸酶的市场前景 植酸酶的研究从 20世纪 60年代就已开始,但由于对其认识不足, 相对于其他工业用酶发展缓慢, 到 80年代时, 饲料中还几乎不添加任何植酸酶。随着人们对动物营养学、饲料学研究的深入和集约化养殖的形成, 植酸酶的良好前景得以体现, 同时分子生
黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验
2014级生物工程专业实验(II) 黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶 一、实验目的 掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。 二、实验材料 2.1菌株 黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。 2.2 实验试剂 糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。 2.3实验设备 DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。 三、角蛋白酶液态发酵实验 3.1工艺流程 3.2培养基及培养条件 3.2.1种子培养基及培养条件 （1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。
(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。 3.2.2发酵培养基及培养方法 发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。 3.3 检测方法 3.3.1菌体浓度的测定 干重法。 3.3.2还原糖的测定 采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。 (1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。向9支比色管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 (2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。 表1 葡萄糖标准曲线的制作 管号葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL 最终浓度/(mg/mL) 1 0 0.5 0 2 0.05 0.45 0.1 3 0.1 0. 4 0.2 4 0.1 5 0.35 0.3 5 0.2 0.3 0.4 6 0.25 0.25 0.5 7 0.3 0.2 0.6 8 0.35 0.15 0.7 9 0.4 0.1 0.8 3.3.3酸性蛋白酶活力的测定 Folin-酚法。
黑曲霉菌株发酵生产糖化酶发酵罐设计
目录
第一章绪论 我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。 糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉是国内糖化酶活性最高的菌株之一。 糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。 综合温度、PH等因素选择黑曲霉菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为，培养基为玉米粉%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。 主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。 发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。 发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。 这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本视图，和各种表达方式，有合理的选择比例，大小，和合理的安排幅面。说明书就是要写清楚设计的思路和步骤。