黑曲霉酸性_甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究
文章编号:1000-1573(2007)01-0055-05
黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶的
纯化及部分性质研究
朱 1, 李剑芳2, 邬敏辰1
(1.江南大学医学系,江苏无锡214064;2.江南大学食品学院,江苏无锡214064)
摘 要:黑曲霉(Aspergillus niger )WM20-11固态发酵成熟曲,经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分步盐析、DEAE -Sepharose fast flow 阴离子交换层析、Sephadex G -100凝胶过滤层析等分离纯化手段,最终获得了Native -PA GE 、SDS -PA GE 纯的酸性β2甘露聚糖酶组分,其纯化倍数为25108,收率为511%。Sephadex G -100凝胶过
滤层析和SDS -PA GE 测得纯酶的相对分子质量分别为39kD 和40kD ,表明该酶以单体形式存在;IEF -PA GE 测得该酶的等电点为4.0;含糖量测定为1916%;酶蛋白氨基酸组成中(Asp +G lu )/(Lys +Arg )为3174。关 键 词:酸性β-甘露聚糖酶;黑曲霉;纯化;性质中图分类号:Q 556.2 文献标识码:A
Studies on purif ication and some properties of the acidic
β2m annanase from Aspergillus niger
ZH U Jie 1,LI Jian 2fang 2,WU Min 2chen 1
(1.Department of Medicine ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China ;2.School of Food Science ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China )
Abstract :The acidic β2mannanase from Aspergill us niger WM20211was purified by buffer extrac 2tion ,ammonium sulfate precipitation ,DEAE 2Sepharose fast flow and Sephadex G 2100column chromatographies.The purified enzyme was homogeneous on Native 2PA GE and SDS 2PA GE.After these steps the enzyme was purified by 251082fold with a recovery of 511%.Molecular weight of the β2mannanase was determined as 39kD on Sephadex G 2100gel filtration and 40kD on SDS 2PA GE ,which indicated that the β2mannanase was a monomer.The isoelectric point was estimated to be 410by IEF 2PA GE.Its carbohydrate content was 1916%.The ratio of (Asp +G lu )/(L ys +Arg )was 3174.
K ey w ords :acidic β2mannanase ;Aspergill us niger ;purification ;properties
β2甘露聚糖酶(β2mannanases )通常指β2D 21,42内切甘露聚糖酶(EC 31211178),能特异性水解均一甘露聚糖和非均一甘露聚糖主链内部的β21,42D 2甘露糖苷键,广泛存在于微生物和动植物中[1]。β2甘露聚糖酶可降解魔芋粉、角豆胶和瓜儿豆胶等可食性植物胶为甘露低聚糖,后者能显著促进人体肠道内以双歧杆菌和乳酸菌为代表的有益菌群的增殖,提高机体抗氧化能力[2],降低血糖和改善血液成分[3],以及降低血清总胆固醇和甘油三酯水平等[4]。在饲料工业中,β2甘露聚糖酶可用作饲料添加剂,提高饲料的消化利用率及促进动物的生产性能。在造纸、纺织、洗涤、石油开采和生物技术研究
收稿日期:2006-06-20
基金项目:江南大学校级科研项目(210000-52212052)
作者简介:朱 (1969-),女,江苏无锡人,硕士,讲师,主要从事生物化学与分子生物学研究.
通讯作者:邬敏辰(1962-),男,江苏无锡人,博士,副教授,硕士生导师,主要从事发酵工程与分子生物学研究.
E 2mail :bioch @https://www.wendangku.net/doc/7214036384.html,
第30卷第1期2007年1月
河北农业大学学报
JOURNAL OF AGRICUL TURAL UNIVERSITY OF HEBEI
Vol.30No.1Jan .2007
等诸多领域,β2甘露聚糖酶也有广泛的应用[5]。
本课题组从众多丝状真菌中选育了1株宇佐美曲霉和1株黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶高产菌株,对其固态发酵条件进行了探索[1,6]。本研究进一步分离纯化了黑曲霉WM20211固态发酵曲中的β2甘露聚糖酶组分,拟测定该纯酶的某些基本性质和化学组成,为该酶蛋白N末端氨基酸残基的测定、酶基因的克隆和高效表达奠定基础。
1 材料和方法
1.1 菌株
黑曲霉(Aspergill us niger)WM20-11酸性β2甘露聚糖酶高产菌株,由江南大学医学系分子生物学研究室选育和保存。
1.2 主要试剂
DEAE2Sepharose fast flow,Sephadex G2100购自Pharmacia公司;SDS2PA GE低分子量标准蛋白,丙烯酰胺,N,N′2甲叉双丙烯酰胺,N,N,N′,N′2四甲基乙二胺,十二烷基磺酸钠,过硫酸铵均购自上海华美公司(进口分装);牛血清白蛋白,鸡卵白蛋白,胰蛋白酶购自上海伯奥公司;Ampholine(p H315～1010)为Amersham Bio2Sciences公司产品;角豆胶,甘露糖和细胞色素C购自Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器
冷冻离心机(IEC MUL TI2RF);层析系统;分光光度计(WFZ8002D3B);垂直蛋白电泳系统(Mini2 PRO TEAN II);等电聚焦电泳仪(D YY212C);凝胶成像系统(Touching995);氨基酸自动分析仪(A GI2 L EN T1100)。
1.4 分离纯化步骤
除特别注明外,分离纯化过程均在10℃以下进行;所用缓冲液均为pH710、0102m ol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(以下简称磷酸缓冲液)。
1.4.1 粗酶液制备 固态发酵曲用6倍体积磷酸缓冲液40℃振荡浸提30min,过滤收集第1次滤液;再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣,过滤收集第2次滤液。将第1、2次滤液合并,即为β2甘露聚糖酶粗酶液。
1.4.2 硫酸铵盐析 采用分步盐析法。粗酶液中添加(N H4)2SO4至50%饱和度,4℃静置过夜,离心(4℃,8000r/min,20min),弃沉淀;上清液继续添加(N H4)2SO4至80%饱和度,4℃静置过夜,离心,沉淀备用。
1.4.3 第1次阴离子交换层析 将沉淀溶解、脱盐,对磷酸缓冲液透析,上样至已用磷酸缓冲液平衡的DEAE2Sepharose fast flow阴离子层析柱(116cm×
30cm)上,阶段洗脱。洗脱方式为:依次用含0115、0130和0145mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱,流速014mL/min,部分收集(4mL/管),测定各管的β2甘露聚糖酶活性。合并较高酶活性的收集液,透析,聚乙二醇20000浓缩。
1.4.4 第2次阴离子交换层析 将第1次阴离子分离的浓缩酶液再次上样至同一层析柱上。洗脱方式为:依次用含0117、0125和0133mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱,流速012mL/min,部分收集(2 mL/管),测定各管的β2甘露聚糖酶活性。合并较高酶活性的收集液,透析,浓缩。
1.4.5 凝胶过滤层析 将第2次阴离子分离的浓缩酶上样至已用磷酸缓冲液平衡的Sephadex G2100凝胶层析柱(116cm×100cm)上,同一缓冲液洗脱,流速012mL/min,部分收集(2mL/管)。合并较高酶活性的收集液,脱盐,浓缩或冷冻干燥。获得的纯β2甘露聚糖酶样品,用于酶学性质、化学组成及N末端氨基酸残基的测定。
1.5 测定方法
1.5.1 β2甘露聚糖酶活性测定 按文献[7]并略作改动。于210mL510g/L角豆胶底物溶液(p H 418、011mol/L醋酸缓冲液配制)中加入015mL适当稀释的酶液,60℃反应10min;3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS法)测定还原糖。在上述条件下,以每分钟水解底物产生1μmol还原糖(以甘露糖计)的酶量为1个β2甘露聚糖酶单位(IU);比酶活性定义为每mL样品液或每mg蛋白中含有的酶活性单位数(IU/mL或IU/mg)。
1.5.2 蛋白质量浓度测定 参照Lowry等[8]的方法进行,以牛血清白蛋白为标准蛋白;在酶的分离纯化过程中,蛋白质量浓度以OD280值表示。
1.5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Native2PAGE采用不连续垂直板电泳系统[8],分离胶和浓缩胶浓度分别为75g/L和30g/L;SDS2PAGE也采用不连续垂直板电泳系统[10],分离胶和浓缩胶浓度分别为120g/L和30g/L。
1.5.4 等电聚焦电泳 参照文献[11]的方法进行,等电聚焦电泳(IEF-PAGE)采用进口Ampholine(pH 315～1010)为两性电解质载体,胶浓度为54g/L。电泳结束后,顺电场方向切下1～2道空白泳道,再按泳道垂直方向切成510mm等距离的小块,捣碎,用2mL三蒸水浸泡20min后测定p H值,绘制p H-距离(mm,离正极)标准曲线。
1.5.5 相对分子质量测定 分别采用Sephadex G2 100凝胶过滤和SDS-PA GE两种不同的相对分子质量测定体系。前者测定的是全酶蛋白的相对分子质量,后者是酶蛋白亚基的相对分子质量。
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河北农业大学学报第30卷
1.5.6 糖含量测定 采用苯酚-硫酸法。取1mL
酶液置于具塞试管中,加入015mL 、体积分数6%的重蒸酚溶液,混匀后再加入316mL 浓硫酸,迅速混匀,室温放置20min ,于490nm 处测定吸光度,利用葡萄糖标准曲线查出相对应的糖量(以葡萄糖计),并折算成纯酶蛋白的糖含量(mg/mg )。
2 结果与分析
2.1 分离纯化过程
2.1.1 阴离子交换层析 2次阴离子交换层析的
洗脱和酶活性分布曲线分别见图1和图2。由图1可见,该步分离纯化过程出现较多蛋白质洗脱峰,而β-甘露聚糖酶活性主要分布在0130mol/L NaCl 的蛋白洗脱峰内,合并该洗脱峰内的酶液,透析,浓缩,用于下一步的纯化。由图2可见,第2次DEAE -Sepharose fast flow 阴离子交换层析出现3个蛋白质洗脱峰,酶活性主要分布在0125mol/L NaCl 的蛋白洗脱峰内。经Native -PA GE 检测为非单一蛋白条带(图4第、3泳道),需进一步纯化
。
图1 1次DEAE 2Sepharose fast flow 洗脱图谱
Fig.1 E lution curve of the f irst DEAE 2Sepharose fast
flow
图2 第2次DEAE 2Sepharose fast flow 洗脱图谱
Fig.2 E lution curve of the second
DEAE 2Sepharose fast flow
2.1.2 凝胶过滤层析 Sephadex G 2100凝胶过滤
层析的洗脱曲线和酶活性分布曲线见图3。由图3可见,该步分离纯化过程出现2个蛋白质洗脱峰,其中在第1个洗脱峰中得到一个对称性较好的酶活性
峰。合并该洗脱峰的酶液,经Native 2PA GE 检测为单一蛋白条带(图4第4泳道)
。
图3 Sephadex G 2100凝胶过滤层析洗脱图谱
Fig.3 E lution curve of the Sephadex
G 2100chrom atography
2.2 分离纯化结果
将各步分离纯化的酶样品进行Native 2PA GE (图4),图4电泳结果表明,纯化过程逐步去除了杂蛋白,最终得到了Native 2PA GE 纯的酶。再将最后经Sephadex G 2100纯化的酶样品进行SDS 2PA GE (图5),结果也显示单一条带,说明该β2甘露聚糖酶的纯度已达到电泳纯
。
1.粗酶;
2.第1次阴离子层析;
3.第2次阴离子层析;
4.Sephadex G 2100
图4
β2甘露聚糖酶的N ative 2PAGE 图谱Fig.4 N ative 2PAGE pattern of β2m
annanase
1.Sephadex G 2100;
2.低分子量标准蛋白
图5 β2甘露聚糖酶的SDS 2PAGE 图谱Fig.5 SDS 2PAGE pattern of β2m annanase
7
5 第1期 朱 等:黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究
黑曲霉WM20211β2甘露聚糖酶的纯化步骤、相应的酶活性、蛋白质量浓度、比酶活性、纯化倍数
以及回收率列于表1。最终纯化倍数为25108,收率为511%。
表1 黑曲霉WM20211β2甘露聚糖酶的分离纯化总结
T able 1 A summ ary of the purif ication of β2m annanase from Aspergillus niger WM20211
纯化步骤Purification steps 总酶活/IU Total activity
总蛋白/mg Total protein
比酶活/(IU ?mg -1)Specific activity
回收率/%Recovery
纯化倍数Purification fold
粗酶液180001800.010.0100.0 1.00硫酸铵盐析
11864451.026.365.9 2.63
第1次阴离子交换层析604981.074.733.67.47第2次阴离子交换层析
219614.0156.912.215.69凝胶过滤层析
918
3.7
250.8
5.1
25.08
2.3 酶的部分理化性质
2.3.1 相对分子质量 蓝葡聚糖2000上G 2100柱测得V 0,标准蛋白牛血清白蛋白(67kD )、鸡卵白蛋白(45kD )、胰蛋白酶(29kD )和细胞色素C (12.3kD )上
柱测得各自的Ve ,可得回归方程lg M r =-018949(V e/V 0)+611702(R 2=019986);再根据纯酶在相同条件下的相对保留体积(Ve/V 0=11765)求出全酶的M r 为39kD 。另外,在同一块聚丙烯酰胺凝胶上将低分子量标准蛋白与纯酶同时进行SDS -PAGE (图5),获得lg M r =-019703R f +510778(R 2=019849);并根据酶蛋白的R f 值(01490)从标准方程中求得M r 为40kD 。2种系统测得的M r 相近,表明该β2甘露聚糖酶为单体酶。2.3.2 等电点pH -距离标准曲线为y =010933x +310268,R 2=019913(图6)。根据纯酶所在的位置1014mm (离正极),求得该酶等电点为410。
图6 等电聚焦pH 梯度曲线
Fig.6 pH gradient curve of IEF 2PAGE
2.3.3 含糖量 采用苯酚-硫酸法,测得含糖量为1916%,此β2甘露聚糖酶为糖蛋白。
2.3.4 氨基酸组成及含量 纯酶样品经酸彻底水解后,在氨基酸自动分析仪上测定水解液中各种氨基酸的组成和含量(表2)。由表2可见,在氨基酸组成中,(Asp +G lu )/(Lys +Arg )为3174,说明黑曲
霉WM20211所产的β2甘露聚糖酶为酸性蛋白,而等电点的测定结果也证实了这一点。
表2
β2甘露聚糖酶的氨基酸组成T able 2 Amino acid content of β2m annanase
氨基酸
Amino acid
含量/%
Content 氨基酸
Amino acid 含量/%
Content 氨基酸
Amino acid
含量/%
Content Asp 14.4Ala 5.9Phe 5.5G lu 10.3Arg 2.8Ile 5.3Ser 8.1Tyr 8.1Leu 7.8His 1.9Cys -s 0.8Lys 3.8G ly 6.1Val 5.7Pro
3.5
Thr
9.5
Met
0.7
注:在上述测定条件下,色氨酸全部被破坏,丝氨酸和苏氨酸均被破坏10%～15%.
3 结论与讨论
国内外对来源于不同菌种的β2甘露聚糖酶生产、纯化和应用的研究报道,主要集中于碱性酶[12-13]和中性酶[14-15]方面,而酸性β2甘露聚糖酶的报道较少。本文则从黑曲霉WM20211菌株固态发酵成熟曲中,经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分步盐析、2次DEAE 2Sepharose fast flow 阴离子交换层析和1次Sephadex G 2100凝胶过滤层析的分离纯化,最终获得在Native 2PA GE 和SDS 2PA GE 图谱上呈现单一蛋白条带的纯酸性β2甘露聚糖酶组分,纯化倍数为25108,收率为511%。
不同来源的β2甘露聚糖酶的M r 有较大差异,小的只有22kD ,而大的可达到162kD ,且多数为单体酶[16]。本研究采用Sephadex G 2100凝胶过滤层析和SDS 2PA GE 分别测得纯β2甘露聚糖酶的相对分子质量为39kD 和40kD ,表明该酶以单体形式存在。许多研究表明,真菌及某些放线菌的β2甘露聚糖酶有不同程度的糖基化,而细菌和植物的则很
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河北农业大学学报第30卷
少发现[17]。由该黑曲霉WM20211菌株所产的β2甘露聚糖酶为一种含糖量1916%的糖蛋白,推测其所含糖基与该酶的热稳定性有一定关系。氨基酸组成中2种酸性氨基酸Asp和G lu含量之和明显高于3种碱性氨基酸Lys、Arg和His之和,故该酶属于酸性蛋白,等电点测定(p I=4.0)也证实了该结论。Lind等[18]提出高的Lys和低的Arg含量是耐热蛋白的氨基酸组成特征。本研究所获纯酶的Lys/Arg 比值为1136,且实际测定该酶的热稳定性较好,与Lind等提出的结论相符合。
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(编辑:李 川)
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第1期 朱 等:黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究
饲用酶制剂
动物对饲料的利用，是在消化道内各种消化酶的作用下将各种养分降解为小分子而被消化道吸收利用的。动物对饲料养分的消化能力决定于消化道内消化酶的种类和活力。近20多年的实践和研究证明，适合动物消化道内环境的外源酶能起到内源酶同样的消化作用。饲用酶制剂是将一种或多种用生物工程技术生产的酶与载体和稀释剂采用一定的加工工艺生产的一种饲料添加剂。饲用酶制剂可以提高动物，特别是年幼或有疾病动物的消化能力，提高饲料的消化率和养分利用率，改善畜禽生产性能，减少排泄物的污染，转化和消除饲料中的抗营养因子，并使一些新的饲料资源能被充分利用。饲用酶制剂大多属于助消化的酶类，其关键是要有较好的稳定性，能够承受加工过程的高温、消化道内酸性环境及内源蛋白酶的破坏作用。近十几年饲用酶制剂的研制、开发与应用发展很快，据调查统计，1998年世界工业酶制剂市场销售额15.6亿美元，其中饲料用酶占9%，为1.4亿美元。饲料用酶销售额1994-1998年五年的年平均增长率为11%，高于同期工业酶制剂总体增长率5%。 一、饲用酶制剂的主要种类 目前，饲料工业上使用的酶制剂主要是消化碳水化合物和植酸磷的酶，也有些产品包含有蛋白酶和脂酶。 （一）消化碳水化合物的酶 植物性能量饲料中的碳水化合物含量通常在60％以上。饲料中的碳水化合物是一组化学组成、物理特性和生理活性差异特别大的化合物，有易消化的淀粉，也有难消化的非淀粉多糖(NSP)(图4-2)。 （引自《饲料添加剂学》陈代文，2003） 因此，这类酶包括淀粉酶和非淀粉多糖(NSP)酶。非淀粉多糖酶又包括半纤维素酶、纤维素酶和果胶酶。半纤维素酶主要包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和半乳聚糖酶；纤维素酶包括C1酶、Cx酶和β-葡聚糖酶。 1、淀粉酶包括α和β—淀粉酶、糖化酶以及支链淀粉酶和异淀粉酶。α-淀粉酶作用于α-1，4—糖苷键，将淀粉水解为双糖、寡糖和糊精，只能分解直链淀粉和支链淀粉的直链部分。淀粉酶作用于淀粉的β—1，6—糖苷键(支链淀粉分支处)，将淀粉也水解为双糖、寡糖和糊精。糖化酶水解底物为双糖、寡糖和糊精，生成葡萄糖和果糖，并从淀粉的非还原末端，依次水解α—1，4—糖苷键生成葡萄糖。饲料中添加多用β—淀粉酶，使用时应加少量的碳酸氢钠或碳酸钠以中和胃酸，以利于淀粉酶的活化，防止该酶在胃肠道失活。 2、半纤维素酶包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和半乳聚糖酶等b：主要作用是将植物细胞中的半纤维素水解为多种五碳糖，且降低半纤维素溶于水后的黏度。 小麦和黑麦等谷物中含有阿拉伯糖基木聚糖，这种糖可以与细胞壁的其他成分紧密结合，它含有1，4—糖苷键，而且可以吸收其自身重量
甘露聚糖酶作用原理
β-甘露聚糖酶（endo-1,4-β-mannanase）是一种新型的酶制剂，属于一种半纤维素酶类，它除具有一般非淀粉多糖（NSP）酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外；近来很多研究表明，β-甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，因为它可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率。实际使用中还可看出，添加了β-甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。 NSP的其中一种组分是β-甘露聚糖（半乳甘露聚糖），其在豆粕中的含量高于其它常用的饲料原料。β-甘露聚糖除了消化率低之外，还对家禽具有多方面负面的生理影响。研究表明，即使是低浓度的β-甘露聚糖也可通过干扰胰岛素分泌和胰岛素样生长因子（IGF）生成而降低从肠道中吸收葡萄糖的速率和碳水化合物的代谢过程（Nunes和Malmlof,1992）。其它负面影响包括降低氮存留量、脂肪吸收率和氨基酸摄入量以及减少水的吸收而导致排泄物水分过多（Kratzer等，1967）。 -甘露聚糖在畜禽肠道细胞发育不完全，或在应激环境下，会过度刺激免疫反应，造成对生长性能的的伤害，引起不良免疫反应，摄食量下降，生长更加迟缓，造成体重轻的数量增加，群体均匀度变差。 表1 常见原料的β-甘露聚糖含量 β-甘露聚糖酶作用特点： ◆β-甘露聚糖酶是一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。 ◆消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高豆粕的能量消化率，能给玉米豆粕型日粮提高100-150kcal/kg的代谢能。 甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染。减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。 ◆降低肠道粘度，促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。
酸性蛋白酶生产工艺
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
生物酶解技术
天然植物有效成分的提取新技术——生物酶解技术 酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2．1 用于天然植物细胞破壁的酶 2．1．1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。 2．1．2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2．1．3果胶酶 果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃，作用pH值3～6。
甘露聚糖酶的测定方法
甘露聚糖酶活性测定方法 一．原理 样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。 二．定义 一个甘露聚糖酶活性单位（MNU）被定义为：在测定条件下，1秒钟内从甘露聚糖中产生1 nmoL相应还原糖－甘露糖所需的酶量（1 MNU=1 nkat）。 三．适用范围与安全性 本方法适用于来源于木霉属（Trichoderma）的甘露聚糖酶样品的测定。当检测其它来源的酶活时，本测定方法的直线性需要校正。 本测定方法中的DNS试剂在吸入后，接触皮肤和眼睛，或被误服后，对人体有害。四．试剂与仪器 所有试剂溶液均用去离子水配制。 1. 柠檬酸缓冲液（0.05M,pH5.3） 溶解10.5 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于800mL水中，并用1M氢氧化钠调节pH至5.3（消耗约110mL），再用水定容至1000mL。 2. 底物－0.3% 称取0.6 g刺槐豆胶（Sigma G-0753），溶于约80℃的柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌，加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。将不溶的沉淀物离心（1000rpm离心10min），并用柠檬酸缓冲液定容至200mL。将此底物溶液在-20℃下冰冻保存。临用前，将底物溶液在沸水浴中缓慢溶解至80℃左右后使用。 3. DNS试剂 溶解50.0 g3,5-二硝基水杨酸（Sigma D-0550）于4000mL水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0 g氢氧化钠，使之完全溶解，再继续磁力搅拌，分数次少量加入1500 g四水合酒石酸钾钠，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000mL。如果溶液不澄清，用Wheatman 1号滤纸过滤，然后室温保存于棕色瓶中。 4．仪器 恒温水浴锅50℃ 恒温水浴锅100℃ 试管旋涡磁力搅拌器 分光光度计 五．测定条件 底物半乳甘露聚糖 pH 5.3 温度50℃ 0.5℃ 保温时间5min 六．样品处理 用柠檬酸缓冲液稀释被检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。
酸性蛋白酶的作用机理
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌 2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性
_甘露聚糖酶的研究及应用进展
第24卷第6期2010年12月 白城师范学院学报 Journal of Baicheng Normal College Vol．24，No．6Dec．，2010 β－甘露聚糖酶的研究及应用进展 王兆淼 （白城师范学院生物系，吉林白城137000） 摘要：β－甘露聚糖酶是重要的饲用酶制剂之一，是一种新型饲料添加剂．应用于猪、 鸡、鸭和水产动物日粮，可提高饲料的利用效率，促进动物生长，减少养殖业环境污染等作用．作者从β－甘露聚糖酶的来源、作用机理、在生产中的应用等方面阐述了饲用β－甘露聚糖酶的研究及应用情况． 关键词：β－甘露聚糖酶；作用机理；应用 中图分类号：O629文献标识码：A 文章编号：1673-3118（2010）06-0064-03收稿日期：2010－10－08 作者简介：王兆淼（1981———），男，白城师范学院生物系助教，在读硕士，研究方向：动物营养与饲料学． β－甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究 的热点之一，也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一．中国饲用甘露聚糖酶的研究始于2006年，是对玉米/豆粕型日粮最有效的饲用酶制剂，畜禽和鱼类的消化酶系不含β－甘露聚糖酶，添加β－甘露聚糖酶主要有促进动物生长，控制、预防动物疾病，提高动物的饲料转化效率；促进养分消化，改善动物肠道微生物生态，改善动物机体的健康状况；降低肠道内容物的黏稠度，减少粪便排泄，减轻环境污染；提高微量元素的生物利用率等作用．目前，β－甘露聚糖酶在北美和欧洲市场已得到广泛的应用． 1β－甘露聚糖酶的来源 β－甘露聚糖酶（endo －β－1， 4－mannanase ）属于半纤维素水解酶类，以内切方式降解β－1，4糖苷键，作用底物为甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳 甘露聚糖等，近来很多研究也表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂．β－甘露聚糖酶来源广 泛， 包括植物、真菌、放线菌甚至软体动物，其中，微生物是产生β－甘露聚糖酶的主要来源，但哺乳动物体内不含此酶． 2 β－甘露聚糖酶的作用机理 2．1 去除β－甘露聚糖的抗营养作用 甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚 糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在许多植物中大量积累，如玉米、小麦、菜籽粕及麦麸中含量占非淀粉多糖（NSP ）比例分别达12%、11%、20%和34%．特别是β－半乳甘露聚糖和β－葡甘露聚糖是所有豆科（如豆粕）植物细胞壁的组成成分，在豆粕中含量最高（15－18g /kg ）．它与其他非淀粉多糖围绕或缚住细胞中的养分（蛋白质、淀粉和脂肪等），动物的内源性消化酶难于消化这些细胞壁成分，从而降低了日粮的养分利用率．由于畜禽和鱼类的消化酶系中不含此酶，在饲料中添加β－甘露聚糖酶可水解β－甘露聚糖 高分子中的β－1，4糖苷键，释放出与之结合的养分、微量元素等，促进营养物质的消化和吸收，降低 肠道粘度，预防动物腹泻，同时促进畜禽生长，减少养殖污染． 2．2提高动物肠道粘膜的完整性 β－甘露聚糖酶可以直接作用于肠黏膜，切断肠上皮细胞与病原菌的结合点，即碳水化合物核心基座、 蛋白质和蛋白糖；又因－甘露聚糖酶的反应产物甘露寡糖，可以竞争性地与某些病原菌结合，从而减少了这些有害菌与肠粘膜上皮细胞的连接，进而减少了发病的几率，达到防病抗病和治病的目的． 4 6
低聚苷露糖
低聚甘露糖：新型高品质益生元 2013年10月30日，低聚甘露糖被国家卫生和计划生育委员会批为新食品原料，为保健食品的研发注入了新力量。它也被称为新一代高附加值功能性食品和21世纪食品的先导。 低聚甘露糖到底是什么？对人体健康有何种功效？下面，长力元将一一为大家解答： 低聚甘露糖是什么？ 低聚甘露糖是运用先进生物技术、从魔芋根茎中提取精制而来的功能性低聚糖，同时也是一种高品质益生元。 从分子结构上看，低聚甘露糖是由D-甘露糖通过β-1, 4糖苷键连接形成主链，在主链或支链上连接葡萄糖而成，聚合度在2～10之间的寡糖。 它不仅能大量增殖肠道有益菌，抑制有害菌繁殖，调节肠道菌群微平衡；同时还能帮助清除肠道内的腐败及有毒物质，促进营养的吸收和加速人体排毒。
低聚甘露糖的独特之处 病原菌入侵人体的第一步，就是通过身上一种称为甘露糖“凝集素”的特殊物质，黏附在肠道上皮细胞表面。低聚甘露糖能够特异性地优先与病原菌的凝集素结合，形成一种更加牢不可破的“结合关系”。让病原菌无法再黏附在肠道上皮细胞表面，从根源上阻碍了病原菌的入侵。同时低聚甘露糖不被小肠消化吸收，病原菌只得随之一起被排出体外。而低聚甘露糖的这一特点是其他功能性低聚糖所没有的。 低聚甘露糖的功效 缓解胃肠炎症 低聚甘露糖通过刺激双歧杆菌等有益菌的生长，增强其活性，调节人体肠道微生态平衡；发酵后产生丁酸等短链脂肪酸，酸化结肠环境，抑制拟杆菌等腐败菌生长；并防止需氧肠杆菌入侵、定植肠黏膜而产生炎性反应，从而改善肠道炎症与肠粘膜损伤，让肠道恢复正常状态。冯莉等通过研究发现，低聚甘露糖能明显改善炎症性肠病引起的溃疡。
酸性蛋白酶提交
酸性蛋白酶的研究进展 姓名：石宏志班级学号：090432215 中文摘要：提起酶不了解的人都会觉得很神奇，为什么人类、动物、植物体内都会有酶，酶究竟是什么东西。此文就对酸性蛋白酶从菌种培养、工艺流程、在生产生活中的应用、产过程中的注意事项及最后酶的提纯做了简单的陈述。酸性蛋白酶，酶的一种，它的研究进展从这里我们就可以窥一斑而见全身了。 Abstract:Mentions enzyme don't understand people would think very magical, why do humans, animals, plants body will have enzymes, enzyme what exactly. The article from strains of acid protease training, processes and the application in production and life, and production process the matters needing attention and finally enzyme makes simple the purification of statement. Acid protease, one of the enzymes, the research progress of it from here we can peep one spot and see whole body. 中文关键字：酸性蛋白酶，扩培，发酵，盐析，结晶 Key words：Acid protease, enlarge cultivates, fermentation, salting-out, crystallization 前言 21世纪科技领头羊可以说是非生物工程莫数，从DNA双螺旋结构的推出，到多利克隆羊的出世；从原来对污染海洋的石油用燃烧方法，到现在的微生物处理；从原始的青草喂牲畜，到现在的蛋白饲料等等，这诸多变化之中无一脱离了生物催化剂——酶。高效、绿色环保、投入小收获大众多优秀辞藻被冠在酶身上。 蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。 酸性蛋白酶(acidic protease)是指在酸性(pH 2~5)环境下催化蛋白质肽键水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。其在食品、酿造、饲料、毛皮与皮革、胶原纤维和医药等工业领域中的应用很广。近年来，酸性蛋白酶作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂的应用得到人们的重视。下面就对酸性蛋白酶的生产做简单的介绍。 1．酸性蛋白酶的概述 酸性蛋白酶(acidic protease)在1954年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量30000~40000，等电点（pH3~5）。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在
黑曲霉酸性_甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究
文章编号:1000-1573(2007)01-0055-05 黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶的 纯化及部分性质研究 朱 1, 李剑芳2, 邬敏辰1 (1.江南大学医学系,江苏无锡214064;2.江南大学食品学院,江苏无锡214064) 摘 要:黑曲霉(Aspergillus niger )WM20-11固态发酵成熟曲,经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分步盐析、DEAE -Sepharose fast flow 阴离子交换层析、Sephadex G -100凝胶过滤层析等分离纯化手段,最终获得了Native -PA GE 、SDS -PA GE 纯的酸性β2甘露聚糖酶组分,其纯化倍数为25108,收率为511%。Sephadex G -100凝胶过 滤层析和SDS -PA GE 测得纯酶的相对分子质量分别为39kD 和40kD ,表明该酶以单体形式存在;IEF -PA GE 测得该酶的等电点为4.0;含糖量测定为1916%;酶蛋白氨基酸组成中(Asp +G lu )/(Lys +Arg )为3174。关 键 词:酸性β-甘露聚糖酶;黑曲霉;纯化;性质中图分类号:Q 556.2 文献标识码:A Studies on purif ication and some properties of the acidic β2m annanase from Aspergillus niger ZH U Jie 1,LI Jian 2fang 2,WU Min 2chen 1 (1.Department of Medicine ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China ;2.School of Food Science ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China ) Abstract :The acidic β2mannanase from Aspergill us niger WM20211was purified by buffer extrac 2tion ,ammonium sulfate precipitation ,DEAE 2Sepharose fast flow and Sephadex G 2100column chromatographies.The purified enzyme was homogeneous on Native 2PA GE and SDS 2PA GE.After these steps the enzyme was purified by 251082fold with a recovery of 511%.Molecular weight of the β2mannanase was determined as 39kD on Sephadex G 2100gel filtration and 40kD on SDS 2PA GE ,which indicated that the β2mannanase was a monomer.The isoelectric point was estimated to be 410by IEF 2PA GE.Its carbohydrate content was 1916%.The ratio of (Asp +G lu )/(L ys +Arg )was 3174. K ey w ords :acidic β2mannanase ;Aspergill us niger ;purification ;properties β2甘露聚糖酶(β2mannanases )通常指β2D 21,42内切甘露聚糖酶(EC 31211178),能特异性水解均一甘露聚糖和非均一甘露聚糖主链内部的β21,42D 2甘露糖苷键,广泛存在于微生物和动植物中[1]。β2甘露聚糖酶可降解魔芋粉、角豆胶和瓜儿豆胶等可食性植物胶为甘露低聚糖,后者能显著促进人体肠道内以双歧杆菌和乳酸菌为代表的有益菌群的增殖,提高机体抗氧化能力[2],降低血糖和改善血液成分[3],以及降低血清总胆固醇和甘油三酯水平等[4]。在饲料工业中,β2甘露聚糖酶可用作饲料添加剂,提高饲料的消化利用率及促进动物的生产性能。在造纸、纺织、洗涤、石油开采和生物技术研究 收稿日期:2006-06-20 基金项目:江南大学校级科研项目(210000-52212052) 作者简介:朱 (1969-),女,江苏无锡人,硕士,讲师,主要从事生物化学与分子生物学研究. 通讯作者:邬敏辰(1962-),男,江苏无锡人,博士,副教授,硕士生导师,主要从事发酵工程与分子生物学研究. E 2mail :bioch @https://www.wendangku.net/doc/7214036384.html, 第30卷第1期2007年1月 河北农业大学学报 JOURNAL OF AGRICUL TURAL UNIVERSITY OF HEBEI Vol.30No.1Jan .2007
黑曲霉酸性蛋白酶液态发酵实验
2014级生物工程专业实验(II) 黑曲霉液态发酵生产酸性蛋白酶 一、实验目的 掌握液态耗氧发酵的一般工艺，熟悉机械搅拌发酵罐及相关设备的原理和使用。 二、实验材料 2.1菌株 黑曲霉Aspergillus niger SZ-357，由发酵与酶工程研究室分离。 2.2 实验试剂 糊精、酵母膏、氯化铵、磷酸二氢钾、CaCl2、酪蛋白、酪氨酸、20%三氯乙酸，3,5-二硝基水杨酸(DNS)。 2.3实验设备 DHP-9082电热恒温培养箱；2112型恒温摇床；GL-20G-II高速冷冻离心机；BIOTECH-5BG发酵罐，静音无油空气压缩机、BILON-T-501低温冷却液循环系统；722S型分光光度仪；SW-CJ-2FD型净化工作台；HZS-H 超级恒温水浴锅；Sartorius分析天平。 三、角蛋白酶液态发酵实验 3.1工艺流程 3.2培养基及培养条件 3.2.1种子培养基及培养条件 （1）液体种子培养基及培养条件：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0，121o C灭菌15 min。将斜面菌种接种于含有100 mL 种子培养液的500 mL三角摇瓶中，在34o C，180r/min的恒温摇床中振荡培养24 h。
(2)麸皮固体种子培养基及培养条件：将斜面菌种接种于含水90%的麸皮固体培养基中，34o C，静置培养72 h，取出麸皮种子40 o C烘干备用。 3.2.2发酵培养基及培养方法 发酵培养基：糊精1%，酵母膏4%，氯化铵3%，KH2PO40.03%，CaCl2 0.5%，pH7.0。培养基121o C灭菌20 min，将种子液按5%（麸皮种子按3‰）的接种量接种于发酵罐中，在34o C，500 r/min的条件下发酵72 h。 3.3 检测方法 3.3.1菌体浓度的测定 干重法。 3.3.2还原糖的测定 采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定发酵液中还原糖含量。 (1) 标准曲线的绘制：配制1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，取9支洁净的25 mL比色管编号，按表1加入试剂。向9支比色管中加入0.5 mL DNS，摇匀，于沸水浴中加热5 min，取出置于自来水中冷却，加入4 mL蒸馏水，以管“1”为空白在540 nm波长处测定OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 (2)发酵液中还原糖含量的测定：取0.5 mL 待测样于比色管中，再加入0.5 mL DNS；在沸水浴中加热5 min，然后冷却；最后加入4 mL蒸馏水，540 nm下测定OD值。结合标准曲线计算发酵液中还原糖含量。 表1 葡萄糖标准曲线的制作 管号葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL 最终浓度/(mg/mL) 1 0 0.5 0 2 0.05 0.45 0.1 3 0.1 0. 4 0.2 4 0.1 5 0.35 0.3 5 0.2 0.3 0.4 6 0.25 0.25 0.5 7 0.3 0.2 0.6 8 0.35 0.15 0.7 9 0.4 0.1 0.8 3.3.3酸性蛋白酶活力的测定 Folin-酚法。
饲用酶制剂的分类及设计
饲用酶制剂的分类及设计 一、单酶制剂 单酶制剂又可分为消化酶(内源酶)和非消化酶(外源酶)两大类。 1、消化酶包括淀粉酶, 糖化酶，蛋白酶，脂肪酶" （1）淀粉酶：作用于a-1,4糖苷键,将淀粉水解为双糖, 寡糖和糊精,使之易于吸收,并能在胃中迅速液化淀粉,减轻胃部胀感,促进消化 （2）糖化酶：可水解线性的寡糖，双糖和糊精生成葡萄糖和果糖,也可作用于淀粉的非还原性末端,依次缓慢水解Α-1,4糖苷键生成葡萄糖，因此，可在淀粉酶的协同作用下,将淀粉完全分解成葡萄糖" （3）蛋白酶：有酸性，中性，碱性之分。在饲料中由于动物胃液多呈酸性,肠道多数为弱酸性至中性,所以大多数添加酸性和中性蛋白酶，其主要作用是将动物摄取的饲料蛋白质分解为氨基酸,并由动物体重新组合合成自身的蛋白质 （4）脂肪酶：分解脂肪为甘油，脂肪酸和磷脂酸 2、非消化酶包括纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，B-葡聚糖酶 （1）纤维素酶：包括C1酶，CX酶和B-葡萄糖苷酶(Cb)"其中C1酶将结晶纤维素分解为活性纤维素，降低结晶度，然后经CX酶的作用将活性纤维素分解为纤维二糖和纤维寡糖,再经Cb的作用生成动物机体可利用的葡萄糖 （2）半纤维素酶：包括木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯聚糖酶和聚半乳糖酶等,主要是将植物细胞中的半纤维素降解为各种五碳糖,并可降低半纤维素溶于水后的粘度，纤维素酶，半纤维素酶协同作用,破坏富含纤维素的细胞壁,将难于消化和粘性的多糖分解,从而大大提高低能饲料的饲用价值,提高饲料利用率" （3）果胶酶：果胶是一种多糖,果胶酶可裂解果胶单糖之间的糖苷键,并脱去水分子,分解物细胞壁间质成分果胶,促使植物组织崩解,使营养成分得到充分释放和利用" （4）B-葡聚糖酶：B-葡聚糖多存在于大麦，燕麦等谷物中,可溶于水形成粘性的凝胶,成为一种抗营养因子,阻碍动物(特别是幼畜)对营养物质的利用,影响生长。B-葡聚糖酶可水解B-葡聚糖,降低肠道内容物的粘度" （5）植酸酶：可提高饲料中磷的利用率,减少无机磷在饲料中的添加量,减少多余磷对环境的污染;还有将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖的乳糖酶,分解果实中丹宁改善味觉促进动物采量的丹宁酶等。 二、复合酶制剂 动物配合饲料中含有多种营养素，利用各种消化酶和非消化酶的协同作用,可最大限度地提高饲料中能量、蛋白质、纤维素等营养物质的利用率,从而达到增重，减少饲料消耗的目的。目前世界上生产的复合酶制剂,由于不同的功能特点,可分为以下几类:
―甘露聚糖酶简称β-甘露聚糖酶
β―1，4―甘露聚糖酶简称β－甘露聚糖酶，是一类能够水解含β－1，4－甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖）的内切水解酶，属于半纤维素酶类。 产品规格 型号酶活剂型包装规格 FE406A2000 IU/g粉状20 kg/袋或桶 FE406B5000 IU/g粉状20 kg/袋或桶 FE406C10000 IU/g粉状20 kg/袋或桶 FE406AL2000 IU/ml液体30 kg/桶或200 kg/桶FE406BL5000 IU/ml液体30 kg/桶或200 kg/桶FE406CL10000 IU/ml液体30 kg/桶或200 kg/桶 产品特点 ●采用新型国际专利菌种生产，发酵效率大幅度提高，产品性能优良，使用 效果得以保证； ●先进的全自动液体深层发酵技术，领先的后处理加工工艺，保障了产品的 高纯度、高稳定性和良好的均匀度； ●有良好的对高温高湿的耐受能力，在普通的饲料制粒条件下，制粒后的酶 活可以保持75％以上，保证了其在颗粒饲料中的使用效果； ●良好的耐胃酸性能，并能很好地耐受胃蛋白酶、胰蛋白酶、饲料中的高浓 度金属离子及抑制因子。 产品功能 ●有效降解植物中的抗营养因子——β－甘露聚糖，大大减少了β－甘露 聚糖与水分子的相互作用，从而降低肠道内容物的黏度，促进营养物质的高效吸收； ●降解β－甘露聚糖产生的甘露寡糖能有效减少病原菌在肠道的定植，显 著促进动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖，调节动物的免疫反应，保持肠粘膜的完整性，提高动物的健康水平和生产性能； ●与纤维素酶、木聚糖酶等一起作用，有效摧毁植物细胞壁结构，促进植物 细胞内其它营养物质释放，使营养物质与消化酶充分接触，提高饲料中营养物质的利用率；
酸性蛋白酶
酸性蛋白酶 酸性蛋白酶cas|酸性蛋白酶价格|酸性蛋白酶厂家|酸性蛋白酶详细介绍 酸性蛋白酶选来选去，还是隆科特好！ 酸性蛋白酶是采用黑曲霉3.4310菌株，经液体深层发酵培养，再用其独特的生产工提取，精制而成的产品。 本产品是一种在酸性环境下（PH2.5-4.0）催化蛋白质酶解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动、植物蛋白质。例如毛发软化，啤酒果酒澄清，动、植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收；还可以进一步加工成医用级蛋白酶作为消炎和助消化剂，或试剂用蛋白酶；亦可以作为饲料添加剂等。 1、产品基本性质 项目指标 外观黄褐色粉末 酶活力u/g(ml) 20000-100000 pH适应范围 2.0-5.0 最适pH值为2.5-3.5 温度适应范围30-50℃，最适温度40℃，超过50℃失活严重 金属离子对酶活力的 被钙、镁离子激活，被铜、汞、铅离子所抑制影响 产品标准GB/T 23527-2009 1.1产品性状：浅棕色粉状制剂。 1.2作用方法：作用键内酶主要生成物质肽类和少量氨基酸。 1.3热稳定性：PH在 2.0-4.0条件以下比较稳定，超过50℃酶活不稳定，60℃以上很快失活。 1.4PH稳定性：PH 2.5-4.0之间稳定，低于2.5或高于4.0很快失活。 1.5最适作用温度：对0.5%酪蛋白在PH3.0左右，最适用温度范围30-50℃，最适用温度为40℃。 1.6酶的最适作用PH：在40℃条件下最适作用PH范围 2.5-4.0，最适作用PH 3.0。 1.7各种金属离子对酶活的影响：被Mn、Ca、Mg离子激活，被Cu、Hg、Al离子所抑制。酶活力：5万-20万单位/克 2、应用工艺（根据试验情况进行调整） 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。
酸性蛋白酶生产工艺
酸性蛋白酶生产工艺 1 蛋白酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3酸性蛋白酶的概述 酸性蛋白酶(acidic protease)在 1954 年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量 30000~40000，等电点（pH3~5）。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在其活动中心含有 2 个天冬氨酸残基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。 不同微生物的酸性蛋白酶其氨基酸组成虽有所差别，但性质基本相同，许多性质也与动物胃蛋白酶相似，其活动中心肽键也基本相似，它对 DFP、PCMP （对氯汞苯甲酸）EDTA不敏感，及但能为DNA（二重氮乙酰亮氨酸甲酯）EPNP及（1，
2 环-3-对硝基苯养基丙烷），SDS（十二烷基磺酸钠）等抑制。DNA，EPNP 之所以能引起酶失活是由于活性中心天冬氨酸残基被酯化。DNA 只同有活性的酸反应，而同失活的酶不能反应。P-BPB（对溴酚乙酰溴）虽然也可同酶的1个天冬氨酸残基反应，但同它反应的天冬氨酸的位置与以上两种抑制不一样，故不能引起青霉酸性蛋白酶失活。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。 1.5.2 pH对酶活及酶稳定性的影响 酸性蛋白酶稳定pH范围2.0～4.0之间，最适pH2.5，pH低于2．0、高于4．0将影响水解速度。 1.5.3 温度对酶活性及稳定性影响 酸性蛋白酶适宜温度范围30℃～50℃，最适作用温度为50℃，低于40℃酶活稳定，超过50℃，酶活性损失严重。 1.5.4 金属离子对酶活力的影响 酸性蛋白酶可被Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋离子激活，被Cu2＋、Hg2＋、Al3＋
低聚甘露糖每天吃多少
低聚甘露糖是唯一能结合肠道中外源性病菌的新型功能性低聚糖聚甘露糖不被消化酶分解，不被小肠利用，只选择性地为肠道有益菌提供能量，帮助调节肠道的菌群，因此对于人体的健康是十分有益处的。那么我们在日常食用时也需要适量来使用，对于每人每天的摄入量我们为您解答一下。 低聚甘露糖还能与病原菌凝集结合，起到增强机体免疫力，缓解腹痛腹泻等症状，另外对于辅助治疗高血压、糖尿病和高脂血症等疾病也有一些作用。根据相关的规定推荐使用量：建议低聚甘露糖每日最大摄入量≤1.5g。只要按照正常的使用量来用，是没有什么影响的。对于低聚甘露糖更多的特点和优势为您介绍如下。 低聚甘露糖是由D-甘露糖通过β-1, 4糖苷键连接形成主链，在主链或支链上连接葡萄糖而成，聚合度在2～10之间的寡糖。目前低聚甘露糖主要由葡甘露聚糖(从魔芋中提取)经嗜碱性芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及卡塞尔等细菌产生的甘露聚糖酶水解制得。分子量分布主要在: 342.3-1639.44之间。
低聚甘露糖以其优越的生理学特性，不仅可广泛适用于保健食品、饮料、乳制品、糖果、饼干和饮料等多种食品中，同时又可用作食品、化工、医药、饲料行业的原料，具有良好的市场前景，成为众多食品企业升级突困的利器。 低聚甘露糖可有效促进生物体内有益菌群增殖,并具有防止便秘、抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、保护肝脏、抗癌及增强机体免疫力等多种生理功能。此外,低聚甘露糖还具有不被人体降解、不增加血糖浓度等特点,是新一代的益生元。 低聚甘露糖的应用优点： 1、原料为食用植物，纯天然，安全有效。 2、口味纯正，微甜，不改变食品原风味。 3、低聚甘露糖有效剂量是其它低聚糖的1/3－1/10，性价比较高。 4、低聚甘露糖是低聚糖中唯一能直接结合外源菌的糖，可以抑制有害菌的
黑曲霉1
黑曲霉 一、黑曲霉的生物特性： 黑曲霉，半知菌亚门，半知菌纲，壳霉目，杯霉科，黑曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。 二、黑曲霉用来酿醋的菌种： 黑曲霉3.324是最传统的酿造食醋曲精型号，以黑曲霉AS3.324基础菌株为主，外增AS3.350、AS3.758、沪酿336-2等多种菌株，经特殊培养基质诱导，纯种大培养、混合复配精制而成。 1.用于糖化制曲，大大提高酒精转化率与原料的利用率，使产量倍增。 2.改善产品风味。制酒、醋风味更加醇厚清香。 3.产品产酸性蛋白酶可以解决食醋灭菌后产生瓶底沉淀及浑浊问题。 4.具有对杂醇油分解的能力，解决白酒杂醇油过高，喝后上头的问题。 5.使用后能明显提高酒、醋的感官澄清度,使白酒更加清澈剔透，醇厚清香，食醋更加清影红亮。 三、黑曲霉酿醋各个型号的不同用法: 黑曲霉3.324 黑曲霉3.758 黑曲霉3.4309 黑曲霉3.350 1.黑曲霉3.324 最传统的酿造食醋曲精型号，用途较为普遍。
2.黑曲霉 3.758 单宁酶产率较高，风味与3.324有较大区别，使用量呈上升趋势，针对不挥发酸要求高的醋用途较为广泛。 3.黑曲霉3.4309 糖化能力比其它型号的黑曲霉要高，尤其比黑曲霉 3.324的糖化能力高一倍，主要是在老陈醋的使用较为广泛。 4.黑曲霉3.350一般用于混合多菌种发酵，主要应用于产品后期风味要求较高产品，使产品更加醇厚清香。 服务热线：400-011-6890