人参皂甙Rg3诱导细胞凋亡作用的研究

收稿日期:2005209226

作者简介:付　静(19712),女,辽宁大连人,大连市肿瘤医院主治医师,硕士,从事肿瘤内科诊治研究.

人参皂甙Rg 3诱导细胞凋亡作用的研究

付　静,赵　翌

(大连市肿瘤医院,辽宁大连116031)

摘要:目的　观察人参皂甙R g 3对小鼠肝癌淋巴结转移模型中肿瘤细胞凋亡的诱导作用,探讨人参皂甙R g 3

抗肿瘤淋巴结转移的机制。方法　建立小鼠肝癌淋巴结转移模型;利用免疫组化方法观察原发瘤及转移瘤各组

(R g 3预防组,R g 3治疗组,R g 3与顺铂联合治疗组,顺铂治疗组及对照组)中肿瘤细胞的凋亡。结果　在原发和转

移瘤中,对照组Bcl 22高表达,Bax 低表达,Bcl 22在人参皂甙R g 3预防组、R g 3治疗组、R g 3与顺铂联合治疗组,顺铂治疗组中是低表达,明显低于对照组(P <0.05),Bax 明显高于对照组(P <0.05)。结论　人参皂甙R g 3抗肿瘤细胞淋巴结转移的作用与诱导细胞凋亡有关。

关键词:肝肿瘤,实验性;淋巴转移;脱噬作用;抗肿瘤药,植物;人参皂甙 药理学

中图分类号:R 735.7 文献标识码:A 文章编号:100121692(2006)022*******

人参皂甙R g 3是从人参根浸出液中分离出的一种有效活性成分。研究证实,R g 3具有抑制肿瘤细胞增殖与浸润、抗肿瘤细胞转移、抑制血管内皮细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡及提高机体免疫功能等多种功效[1,2]。淋巴道转移是肿瘤转移的一个重要途径,许多肿瘤早期转移方式以淋巴道转移为主[3]。本实验采用具有高淋巴道转移特性的小鼠肝癌瘤株H ca 2F 25∥6A 32F (F ),建立了特异性高、稳定性好的小鼠淋巴结转移模型,利用免疫组化方法探讨人参皂甙R g 3抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡的相关性。

1　材料及方法

1.1　实验材料　615近交系小鼠,普通级,6～8周

龄,体重22～24g ,雌雄兼有。小鼠肝癌瘤株H ea 2F 25∥6A 32F (F ),由大连医科大学病理教研室提供。人参皂甙R g 3(纯品由大连富生天然药物研究所提供),顺铂(锦州九泰药业产品),兔抗鼠B cl 22、B ax 单克隆抗体及S 2P 免疫组化试剂盒(U SA Stan ta C ruz 产品)。

1.2　动物模型建立　将H ea 2F 25∥6A 32F (F )小鼠

肝癌细胞接种于小鼠腹腔,4～5天腹水生成后,抽取腹水再传小鼠。取第二代腹水(细胞存活率>95%),以癌细胞2×106个 m l 浓度,接种于小鼠的右足垫,0.2m l 只。

1.3　实验分组及给药情况　实验分五组,除R g 3预

防组接种瘤株前后均给药外,余各组在接种瘤株后

第2天给药。各分组及给药情况详见表1。取材于接瘤第25天,取原发瘤及右蝈窝,腹股沟淋巴结。

表1　实验分组及给药情况

分　组

给药情况

接瘤前(只,天)

接瘤后(天)

R g 3预防组15(R g 3×7)R g 3×20R g 3治疗组

13R g 3×20两药合用组15(R g 3+DD P )×20

阳性对照组14DD P ×20阴性对照组

14

N S ×20

给药方法:R g 33m g

(kg ?d ),qd ,p .o .;DD P 1m g (kg ?d );N S 016～018m l d ,qd ,p .o .

1.4　免疫组化法　样品收集后,常规进行组织固

定、组织切片等免疫组化染色和分析。B cl 22和B ax 为石蜡切片,一抗的稀释倍数为1∶100。实验操作按免疫组化试剂盒说明书进行。

1.5　结果判断及统计学分析　B cl 22光镜下在细胞浆呈棕黄色着色,B ax 主要在细胞浆呈棕黄色着色。根据以下标准分为四级:阴性(-):标本中无阳性细胞反应;低度阳性(+):阳性细胞呈浅棕黄色,分布范围<25%;中度阳性(++):阳性细胞呈棕黄色,分布范围为25%～50%;高度阳性(+++):阳性细胞呈深棕黄色,分布范围>50%。输入SPSS 10.1软件中与阴性对照组进行方差分析检验。

2　结　果

2.1　Bcl -2免疫组化结果　B cl 22在R g 3用药各组的原发瘤和转移瘤中的表达均较阴性对照组降低,差异有显著性(P <0.05);以3预防组及两药合

?

521?实用肿瘤杂志2006年　第21卷　第2期

用组差异尤为明显(见表2,图1)。

2.2　Bax 免疫组化结果　B ax 在R g 3用药各组的

原发瘤和转移瘤中的表达均较阴性对照组增加,差异有显著性(P <0.05)(见表3,图2)。

表2　Bcl -2在各组中的表达

分　组

原发瘤

x

θ±s 阳性率(%)

P 值

转移瘤

x

θ±s 阳性率(%)

P 值

R g 3预防组0.1542±0.145341.70.0020.2625±0.166766.70.007R g 3治疗组

0.1667±0.158144.40.0060.2889±0.178277.80.024两药合用组0.0900±0.084320.00.0000.2000±0.182650.00.001阳性对照组

0.1818±0.145154.50.

0080.2818±0.160181.80.

015阴性对照组

0.3350±0.164

90.

-

0.

4800±0.

2021

90.

-

表3　Bax 在各组中的表达

分　组

原发瘤

x

θ±s 阳性率(%)

P 值

转移瘤

x

θ±s 阳性率(%)

P 值

R g 3预防组0.4167±0.1628100.00.0030.3375±0.153991.70.016R g 3治疗组

0.4278±0.229377.80.0040.3444±0.197677.80.019两药合用组0.4000±0.1291100.00.0090.3550±0.164190.00.011阳性对照组0.3682±0.161790.90.

0220.3273±0.180881.80.

025阴性对照组

0.

1950±0.

1462

60.

-

0.

1550±0.

1536

40.

-

图1　Bcl 22阳性表达,阳性

结果为细胞浆呈棕黄色染色(S 2P ×200)

　图2　Bax 阳性表达,阳性结

果为细胞浆呈棕黄色染色

(S 2P ×200)

3　讨　论

细胞凋亡是一种主动的,由遗传控制的程序性死

亡。正常情况下细胞增殖与细胞凋亡之间保持着一种动态平衡。这种平衡是维持多细胞生物自身稳定的重要因素。细胞增殖失控或细胞凋亡受阻都可导致肿瘤发生,通过诱导凋亡、人工启动肿瘤细胞死亡来治疗或消除肿瘤是目前许多抗肿瘤药物的主要机制之一[4]。日本学者[5～7]发现人参皂甙R g 3具有选择性地抑制肿瘤细胞浸润和转移的作用。人参皂甙R g 3从红参中微量提取的中药单体对H 22小鼠肝癌,M GC 胃癌的肝转移和W istar 大鼠肠癌腹膜转移等动物体内移植肿瘤有明显抑制作用。通过体外抗浸润试验证明表明:人参皂甙R g 3能明显抑制小鼠腹水肝癌细胞(MM I )、B 16FE 7黑素瘤、

人小细胞肺癌(O c 210)和人胰腺癌细胞(PSN 21)的单层浸润,其机制主要是通过剂量依赖性抑制油酰磷酯醇(L PA )导致细胞内Ca

2+

的上升,从而抑制了癌细胞的单层细胞浸润。随着研究的深入,发现人参皂甙R g 3的抗肿瘤作用及机制较为广泛。人参皂甙R g 3可直接作用于癌细胞,通过诱导其凋亡。抑制肿瘤的生长或诱导其分化使其逆

转。刘基巍等[8]通过对小鼠肝癌淋巴道转移的研究证实,在原发瘤及转移瘤中均观察到肿瘤细胞凋亡的形态学变化并检测细胞凋亡峰,提示人参皂甙R g 3对肿瘤发生不同阶段的细胞凋亡有促进作用。高船舟等[9]通过人参皂甙R g 3对K 562 ADM 细胞凋亡诱导的研究发现低毒剂量的R g 3具有较强的诱导细胞凋亡的能力。提示R g 3是一种有效地通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞的抗肿瘤药[10]。李肖等[11]通过对大鼠肝癌细胞的研究证实,R g 3能明显抑制肿瘤细胞增殖,有效诱导肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤组织坏死,并有剂量依赖性。

大量资料显示,细胞凋亡是多种基因共同调控的。其中抑凋亡基因B cl 22过表达和促凋亡基因B ax 低表达可使细胞凋亡抑制,细胞存活期延长并扩增,导致细胞的恶性转化。B cl 22是一种癌基因,

T su ji m o to 等[12]研究滤泡性非霍奇金B 细胞淋巴瘤

时,发现在染色体转位时可激活B cl 22基因,易使转位的B cl 22基因发生失调节效应,过表达大量该基因的m RNA 并编码过量的蛋白质分子,这是细胞潜在恶性化的重要原因之一。B cl 22基因是通过其表达产物阻断内源性核酸内切酶的DNA 切割活性控制细胞凋亡的。B cl 22还能促进谷胱甘肽进入细胞核,从而改变核内的氧化还原反应,阻止Casp as 蛋白酶的活力,从而抑制细胞凋亡。B cl 22几乎无促进细胞增殖的能力;反之,如B cl 22过表达,则可特异性阻止细胞受多种刺激后发生的凋亡。抑制B cl 22可使许多肿瘤如乳腺癌等发生细胞凋亡。B ax 为促凋亡基因,其表达产物B cl 22相关X 蛋白可与抗凋亡蛋白B cl 22形成异源二聚体,抑制B cl 22,诱导细胞色素C 释放,激

?

621?Journal of Practical Oncology Vol .21　No .22006

活Casp as 蛋白酶,引导膜泡形成、核碎裂和细胞死

亡。B ax 低表达有利于癌细胞存活,B cl 22高表达有利癌细胞扩增。本实验的瘤株为肝癌H ca 2F 25 6A 32F (F ),已证实对淋巴管有极强的黏附能力[13],无论腋窝下、足垫、还是血管接种,均可特异地向淋巴道转移,而向血管转移的可能性小,且出现较晚。本实验建立的动物模型是研究肿瘤淋巴道转移较为理想的模型[13～15],并采用足垫接种方法。本研究结果显示,阴性对照组中B cl 22高表达,B ax 低表达,

B cl 22在人参皂甙R g 3预防组、

人参皂甙R g 3治疗组、两药合用组、阳性对照组中呈低表达,明显低于

阴性对照组(P <0.05)。B ax 在人参皂甙R g 3预防组、人参皂甙R g 3治疗组、两药合用组、阳性对照组中呈高表达,明显高于阴性对照组(P <0.05)。在有转移的淋巴结中,各用药组中B cl 22阳性表达低于阴性对照组(P <0.05);B ax 表达高于阴性对照组(P <0.05)。而人参皂甙R g 3预防组及与顺铂合用组B cl 22低表达和B ax 高表达最明显。提示人参皂甙R g 3有促进细胞凋亡作用,从而抑制肿瘤生长与转

移。人参皂甙R g 3抗肿瘤生长及淋巴道转移作用可能是通过促进细胞凋亡来实现。参考文献:

[1]　Zhang Y W ,Dou DQ ,Zhang L ,et al .Effects of

gin seno sides from

panax

gin seng on

cell 2to 2cell

comm un icati on functi on m ediated by gap juncti on s

[J ].P lan ta M ed ,2001,67(5):417-420.

[2]　Yun T K ,L ee YS ,L ee YH ,et al .A n ticarcinogen ic

effete of panax gin seng C .A .M eyer andiden tificati on of active compounds [J ].Ko rean M ed Sei ,2001,16

(Supp l ):86-88.

[3]　L i o tal LA .Cancer cell invasi on and m etastasis [J ].

Scien tific Am erican ,1992,2(4):34-38.

[4]　杨玉琪,李玛琳.人参皂甙的抗肿瘤作用及其机制[J ].

药学进展,2003,27(5):287-230.[5]　K itagaw a I ,Yo sh ikaw a M ,Yo sh ihaw a M ,et al .

Chem ical study on crude drugs [J ].Yakugaku

Zassh i ,1983,103(6):612-622.

[6]　K itagaw a I ,A kedo H ,Sh inkai K ,et al .Inh ib iti on of

tumo r cell invasi on and m etastasis by gin seno sis R g 3

[J ].Gin seng R ev ,1995,16(1):16-20.

[7]　Sh inkai K ,A kedo H ,M ukai M ,et al .Inh ib iti on of in

v itro tumo r cell invasi on by gin seno side R g 3[J ].Jpn J

Cancer R es ,1996,87(2):357-362.

[8]　刘基巍,赵　翌,富　力,等.人参皂甙R g 3在小鼠肝癌

淋巴结转移模型中诱导细胞凋亡的作用[J ].中国肿瘤临床,2004,31(19):1120-1122.

[9]　高船舟,曲淑贤,吕广艳,等.20(R )2人参皂甙R g 3对

K 562 ADM 细胞凋亡诱导的研究[J ].大连医科大学学报,2001,23(3):171-173.

[10]　何　芳.人参皂甙R g 3抗肿瘤作用的实验研究进展

[J ].河南科技大学学报(医学版),2005,23(2):155-156.

[11]　李　肖,官泳松,周翔平,等.20(R )2人参皂甙R g 3对

大鼠肝癌细胞的作用[J ].四川大学学报(医学版),

2005,36(2):217-220.

[12]　T su ji m o to Y ,Co ss m an J ,Jaffe E ,et al

.Invo lvem en t of the Bcl 22gene in hum an fo llicu lar lymphom a [J ].

Science ,1985,228(4706):1440-1443.

[13]　凌茂英,刘希冈,关素琴,等.小鼠肝癌为同转移力克

隆的分离及特性的研究[J ].中华医学杂志,1990,70(6):315-318.

[14]　李　莹,凌茂英,吕　申,等.两株肝癌细胞对淋巴结

成分粘附与转移力关系的探讨[J ].大连医科大学学报,1998,20(2):13-15.

[15]　侯　力,凌茂英,吕　申,等.两株不同转移能力小鼠

肝癌细胞对宿主淋巴系统的影响[J ].实用肿瘤杂志,2000,15(2):90-92.

M echan is m s of g i n senoside Rg 3i n i nduc i ng apoptosis of tu m or cells

FU J ing ,ZHAO Y i

(D alian Cancer Ho si p ital ,D alian ,116031,Ch ina )

Abstract :Objective To investigate the m echan is m of gin seno side R g 3in inducing apo to sis in a lymphatic m etastasis

model of mou se hepatom a .M ethods T he tran sp lan ted mou se hepatom a models w ith lymphatic m etastasis w ere estab lished ,and the apop to sis of the p ri m ary and m etastatic tumo rs w as analyzed by i m m unoh istochem ical m ethod in five group s :Gin seno side R g 3p retreatm en t ,Gin seno side R g 3treatm en t ,com b inati on treatm en t of Gin seno side R g 3and cisp latin ,cisp latin treatm en t ,and con tro l (saline ).Result In p ri m ary and m etastatic tumo rs ,the exp ressi on of Bcl 22w as sign ifican tly decreased ,w hereas Bax increased in 4treatm en t group s compared w ith that of con tro l group (P <0.05).Conclusion A pop to sis m igh t be one of the an ti 2lymphatic m etastasis m echan is m s of Gin seno side R g 3.

Key words :liver neop las m s ,experi m en tal ;lymphatic m etastasis ;apop to sis ;an tineop lastic agen ts ,phytogen ic ;

gin sono side pharm aco logy

?

721?实用肿瘤杂志2006年　第21卷　第2期

细胞凋亡及相关因素的研究进展

细胞凋亡及相关因素的研究进展 论文摘要：细胞凋亡(Apoptosis)是一种生理性死亡Physiogicalcell death，PCD)，是细胞对内外信息刺激的 应答反应，[1]它与细胞的生长、分化一样．属于最基本的 细胞学事件或过程．它决定着生物体的基本特征和转归．是胚胎发生和个体发育中清除细胞以维持细胞数目正常的调 节机制。 [2]当组织细胞发生异常调亡时，即可引起疾病的发生。一般来讲．凋亡过多会引起退行性变或早衰，调亡过少．易诱发肿瘤。[3] 因此，细胞凋亡近年来引起生命科学研究领域的广泛关注。本文仅就细胞调亡的概念及相关因素作一简要的概述。 【Summary】 Apoptosis is a kind of Physiogicalcell death and a reaction of cells to around informations stimulate .[1] It is same as cells’ growth and differentiation which belong to the basic cell subject’s incident or process.it decide living things’essential character- Istics ,and used to clear away cells to keep it rgular number’s regulation mechanism in the procees of embryo occur and individual growth.[2]there will couse ill- Ness when the organization cells come into being particularly apoptosis .Generally speaking ,more cell

细胞凋亡实验报告

实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：

细胞凋亡综述

Mitochondrial Roads to Ruin Two related ways in which mitochondria contribute to cell death are pictured. In the first, mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) occurs when the proapoptotic Bcl-2 fami ly proteins Bax and/or Bak are activated by BH3-only proteins in response to apoptosis-induc ing signals. This results in the release of proteins of the mitochodrial intermembrane space, including cytochrome c, Smac/DIABLO, and Omi/HtrA2. Cytochrome c activates APAF-1, which ol igomerizes to form an apoptosome, that in turn recruits and activates caspase-9. The activat ed caspase-9 cleaves and activates executioner caspases. Inhibitor of apoptosis proteins (IA Ps) block caspase-9 function, and this is disinhibited by Smac and Omi. A second pathway to cell death is triggered by conditions that engage the mitochondrial permeability transition in the mitochondrial inner membrane, leading to matrix swelling and rupture of the outer mem brane. This death pathway appears to engage a necrotic form of death. While evidence suggest s that these two mitochondrial pathways are distinct, it is suspected that there is signific ant overlap between them. 综述：细胞凋亡 https://www.wendangku.net/doc/1113231022.html, 2005-8-12 18:29:15 来源：生命经纬 人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式， 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。 凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase 家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。 细胞凋亡的研究历史 1．凋亡概念的形成 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞这些的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞

细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

细胞凋亡蛋白的研究进展

【摘要】细胞凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列蛋白调控的细胞主动死亡过程，在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育具有重要作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要意义。其中bcl-2家族、caspase 家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡．本文探讨了bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白对细胞凋亡的调控机制。 【关键词】细胞凋亡、 bcl一2家族、caspase家族、p53 蛋白、survivin 蛋白 引言 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是多蛋白严格控制的过程，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了较为深入的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列蛋白的激活、表达以及调控等的作用。其中caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白和p53蛋白、survivin等在凋亡的信号转导中扮演着重要角色。 一、caspase家族蛋白 1.1 caspase家族蛋白介绍 caspase是半胱氨酸基天冬氨酸一特异性蛋白酶(cystei-nyl aspartate specific proteinase)即半胱氨酸天冬氨酸酶的缩写。Caspase半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族，也称为ICE/CED-3家族，是美丽线虫(Caenorhabditis elegans)死亡基因CED-3的同源物。这类蛋白酶与细胞凋亡形态学特征变化(如细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等)以及一些生化改变关系密切。它们是一组存在于胞浆中的半胱氨酸蛋白酶，其共同特点是特异性断开天冬氨酸残基后的肽键。到目前为止，在小鼠和人类中，已经发现caspase家族至少有14个成员。细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在，经活化后方能执行其功能。 1.2 Caspase分类 Caspase分为三大类：凋亡启动因子(apoptotic initiators)、凋亡执行因子(apoptotic executioners)和炎症介导因子(inflammatory mediators)，构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游，包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的Caspase。如Caspase-8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡。凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。如Caspase-3，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。炎症介导因子包括

病毒感染与靶细胞凋亡

病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。

越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有

中药诱导肿瘤细胞凋亡研究进展

中药诱导肿瘤细胞凋亡研究进展 (作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ ) 【关键词】中药肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性死亡，是由基因控制的细胞自我消亡过程。其特征是质膜保持完整性，而核染色质固缩，内源性内切酶激活，将染色质DNA降解成寡聚小体，电泳带谱表现为特征性梯状带，无整个组织的破坏和炎性反应。1992年英国科学家Hickman 等首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段，诱导肿瘤细胞凋亡治疗逐渐成为国际肿瘤研究的一个热点。近年研究表明，许多中药的有效成分或其提取液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，中药诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制主要有以下几个方面。 1阻滞肿瘤细胞增殖周期 一般而言，每一代肿瘤细胞的增殖周期都需要依次经历G1期、S期、G2期、M期四个阶段。许多中药的有效成份能够作用于细胞周期的某一环节，从而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡。用藤梨根氯仿提取液处理人肺腺癌A549细胞，可以对细胞周期产生影响，

表现为G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，出现G0/G1 期阻滞，并呈现一定的剂量依赖关系，伴PI染色检测的细胞凋亡率 增加，提示藤梨根氯仿提取液可抑制A549细胞的有丝分裂，诱导肿瘤细胞凋亡［1］。Li等［2］报道黄连提取物及其主要成分小檗碱都可以在不影响CyclinB1 mRNA表达情况下，抑制CyclinB1蛋白活性，但不抑制Cyclin A ~ Cyclin E蛋白活性，使cdc2激酶活性降低，细胞进入有丝分裂受阻滞，被阻滞在G2期。某些药物可以阻滞肿瘤细胞由S期进入G2/M期而诱发其凋亡。左云飞等［3］研究发现，榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca2F25/CL216A3的G0/G1期细胞无明显作用，主要作用在S期，阻止细胞由S期进入G2/M期，从而抑制肿瘤生长。并观察到在G0/G1期前出现一个凋亡特异的AP峰。黄志煜等［4］报道小檗胺可抑制人白血病Jurkat细胞的增殖，使细胞阻滞在S期，G0/G1期细胞比例也有减少，同时并也观察到肿瘤细胞凋亡明显增加。 较多的中药通过阻滞肿瘤细胞于G2/M期而发挥诱导细胞凋亡的作用。马东礼等［5］在研究榄香烯对HeLa细胞的作用时发现，HeLa 细胞增殖受到明显的抑制，细胞的分裂能力降低，绝大多数细胞阻滞在 G2/M期。张曼颖等⑹研究发现，刺五加叶皂苷能诱导肺癌细胞SpcjA1凋亡，细胞周期分析发现，G0/G1和S期细胞比例明显降低，G2/M期细胞明显升高，提示刺五加叶皂苷作用也是使SPC A1细胞阻滞于 G2/M期。毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的，也可以阻滞人 早幼粒细胞白血病HL〕60细胞于G2/M期，并伴Bcl［2表达下调，Bax 表达上调，诱导肿瘤细胞凋亡［7］。

细胞凋亡实验技术总结

细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜观察法 未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。 2、荧光显微镜检测法-荧光染料 例如，碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm 激发光，细胞核呈红色荧光。 3、电子显微镜 收集细胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 4、激光扫描共焦显微镜技术 FITC-AnnexinV+PI双染，观察凋亡过程中细胞膜PS表面的变化，并区分正常细胞(An-PI-)，早期凋亡细胞(An+PI-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞(An+PI+)，细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。 二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测 1、DNA 断裂检测法 如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。 2、膜联蛋白V 法 磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD 的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与PS高亲和力。将Annexin-Ⅴ进行荧光素或生物素标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。 3、细胞凋亡的酶Caspase检测 检测Caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物检测酶活力，也可对活化的Caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段的抗体检测细胞是否发生凋亡。 4、线粒体膜势能变化的检测 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光显微镜观察，拍照正常细胞中, Rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。

关于细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精

确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小

常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂

表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。

1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。

细胞凋亡在医学上的应用

细胞凋亡在医学上的应用 （专业：动物遗传育种与繁殖） 摘要：细胞凋亡是细胞的自杀过程，通过自杀方式去除体内非必需细胞或即将发生变异的细胞，细胞凋亡不同于创伤性死亡，它可以帮助人类预防诸如癌症和自身免疫性疾病。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如早老性痴呆症、帕金森症、舞蹈症肿瘤，自身免疫性疾病等。研究表明，多种人类恶性肿瘤细胞具有较低响应生理刺激而经历凋亡的能力[1]。因此，诱导癌变细胞凋亡被看作是一种新的癌症治疗方法[2]。开发各种有效提高细胞凋亡能力的试剂——细胞凋亡诱导剂，可能是最有前途的治疗癌症的策略。许多抗癌药，如adrlamycin，vinblastin和紫杉醇等，都可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗癌症。细胞凋亡异常在肿瘤特别是肝癌发生中具有重要作用。 正文：细胞凋亡在免疫学和临床医学中的应用中受到广泛应用，在免疫学中研究胸腺细胞成熟过程中的凋亡及活化诱导的细胞死亡较为突出，细胞凋亡在临床医学中，发现HIV病毒感染造成CD4+细胞减少是通过细胞凋亡机制，同时，从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致，更为重要的细胞凋亡的研究将给自身免疫病带来真正的突破。 最新研究进展 蛋白尿促肾小管细胞凋亡机理：武汉大学中南医院肾病内科李晓宁博士经多年研究发现，蛋白激酶C－delta在蛋白尿中表达升高，会成为尿蛋白诱导肾小管细胞死亡的“元凶”，如成功抑制，有望避免致肾小管细胞死亡的现象。研究人员发现，肾病水平的蛋白尿可以在体内和体外诱导肾小管细胞凋亡，他们同时发现细胞凋亡的早期特征性事件以及晚期特征性事件等，从而分别从细胞水平，亚细胞水平、DNA水平和蛋白质水平证实了白蛋白对肾小管细胞的直接毒性作用。为找到治疗手段，研究人员分别用化学药物和基因转染的方法，成功抑制了蛋白尿诱导的肾小管损伤。李晓宁认为，这一结果在蛋白激酶C－delta基因敲除的蛋白尿小鼠模型中得到证实，这表明医学界有望在进一步研究中通过药物控制蛋白激酶C－delta水平，以彻底消灭蛋白尿引起的肾小管损伤[3]。 ( 发现细胞凋亡开关有助癌症治疗：美国科罗拉多大学博尔德分校的研究小组通过研究线虫，首次发现引起细胞凋亡的“开关”，此项研究结果可用于治疗人类由于“非正常细胞凋亡”引起的癌症等疾病。研究小组利用线虫的半胱天冬酶（ caspase ）进行试验。半胱天冬酶是细胞凋亡的“酶刽子手”，因为它的主要作用就是切断和破坏细胞的蛋白质。但是，研究小组在试验中发现半胱天冬酶对Dicer酶具有不同的作用，当半胱天冬酶分裂 Dicer酶后，它并没有杀死Dicer 酶，而只是改变了 Dicer酶的功能（ Dicer酶是一种RNA切割酶），Dicer酶开始分裂染色体，并杀死细胞。这个实验首次表明，利用半胱天冬酶分裂Dicer 酶（这是一种RNA切割酶），可以改变Dicer酶的功能，使其转变为DNA切割酶."

细胞凋亡诱导剂

细胞凋亡诱导剂 在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。 放线菌素D（Actinomycin D） 放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。Camptothecin 可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。可抑制Tat介导的HIV-1的转录。常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。Cycloheximide 是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白

质的合成，而多数原核生物则无效。在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。可诱导多种细胞的凋亡。 Dexamethasone 是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时） Etoposide 是拓普异构酶II的抑制剂。是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。Staurosporine Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激

细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡的研究进展 姓名：郝先行 学号：10000821 学院：通达学院

摘要：细胞凋亡(apoptosis)是机体正常细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程,是一个主动、高度有序、基因控制及一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生物健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育具有重要作用。机体在产生新生细胞的同时,衰老和突变的细胞通过凋亡机制而被清除,使器官和组织得以正常地发育和代谢。细胞凋亡发生异常会导致疾病的发生,如肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等。本文概述了细胞凋亡的特征、分子机理、2条主要信号途径、检测方法、生物学意义及与疾病的关系。 关键词：细胞凋亡；分子机理；信号通路；检测方法；疾病 参考文献： 1.潘耀谦高丰.细胞凋亡与细胞坏死比较的研究进展[J].动物医学进展，2000，21(4)：5-8. 2.唐兆新高洪.细胞凋亡的生化特征和生物学意义[J].动物医学进展，1998，19(4)：1- 3. 3.高利波高洪.细胞凋亡与疾病防治[J].动物医学进展，2001，22(2)：37-38. 4.宋建领王金萍等.细胞凋亡的研究近况[J].云南畜牧兽医，2003(1)：5-7. 5.Kerr J FR., Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis Its significance in cancer and cancer therapy[J]. Cancer ,1994 ,73 :2013～202 6. 6.Vaux DL. . Apoptosis timeline[J]. Cell Death Differ ,2002 ,9 :349～354. 7.杨宇泽师如意谷传慧.细胞凋亡的特征、检测方法及生物学意义[J].上海畜牧兽医通讯，2008(5)：67-67.