斑点杂交实验

斑点杂交实验

探针的标记：

取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。

点膜：

样品DNA：50ng/dot 2ul/dot

阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释）

变性：1N NaOH 30分钟

中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1

漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。

预杂交：

预杂交液

去离子甲酰胺10ml

20xSSC 5ml

0.4M PB 1ml

50x denhardt’s 5ml

鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）

膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。

杂交：

杂交液的配制：

标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。

去离子甲酰胺10ml

20xSSC 5ml

0.4M PB 1ml

50x denhardt’s 0.4ml

鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）

双蒸水补4ml

探针DNA（变性）20ul

于42°C杂交过夜。

漂洗：62°C

2×SSC--0.1% SDS 15’

0.1×SSC--0.1%SDS 15’

0.1×SSC 15’

(以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温)

封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时

漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’

抗体：1ml 1-2小时（1：3000-1:10000）

漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 漂洗3(1ml)×10’显色：药片一片，30ml蒸馏水中，显色3－5分钟。用水终止反应

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法） 1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。 2.应用范围: PCR实验室。 3.职责: 3.1 文件编写：实验室技术员。 3.2 文件审核：实验室主管。 3.3 文件审批：实验室主任。 3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。 4. 参考文献: 4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》 4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书 5. 内容: 5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。 5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA. 5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。 5.3.1 标本类型：血清。 5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。 5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。 5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。 5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。 5.4 设备和试剂: 5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。 5.4.2 试剂： 5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒 5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100

斑点杂交实验

斑点杂交实验 探针的标记： 取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。 点膜： 样品DNA：50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释） 变性：1N NaOH 30分钟 中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。 预杂交： 预杂交液 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）

膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。 杂交： 杂交液的配制： 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml） 双蒸水补4ml 探针DNA（变性）20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗：62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’

免疫学实验整理

免疫学实验整理 一、凝集试验、吞噬试验 （一）凝集试验 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （二）吞噬试验（示教） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 名解： 1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。 2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。 3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。 4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。 5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。 6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer. 实验及注意点： 1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原） 检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。

检测试剂盒反向斑点杂交法

人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书 （PCR-反向斑点杂交法） 【产品名称】 通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB） 【包装规格】25人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。 【检测原理】反向斑点杂交法 本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。 本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、 68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、 69、70、72、81型。

【主要组成成分】 【自备试剂】 1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓 HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容 至200mL，高压灭菌，室温保存。 3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0， 定容至1000mL，室温保存。 4、A液：(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 5、B液：（0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 6、C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。 【储存条件及有效期】 核酸扩增组分（试剂盒I）于-20℃以下冷冻保存；杂交组分（试剂盒II）和核酸提取组分于2～8℃冷藏保存；TMB应避光保存。试剂有效期6个月。 【适用仪器】 核酸扩增仪：ABI-Veriti(USA)；Ependorf Gradient(German)；MJPTC-100(USA)；AB9700(USA)等。

结核斑点试验操作简要

结核斑点试验操作步骤-2 1.先分离淋巴细胞 一、每个病人标本准备15ml离心管2支，编号1#，2#。 二、在1#管加3ml Ficoll；2#加4ml血和3ml 1640 三、将2#管中液体7ml慢慢加入1#中（让血加在Ficoll上面）， -18 C 1000g离心22min。 四、将离心好的1#管中的淋巴细胞层由上向下慢慢吸取约 5ml（尽量将细胞吸取干净），加入到新的15ml离心管中，并 加1640至10ml，颠倒混匀后600g离心7min。18C 五、离心后尽快倒掉上清，先加1ml 1640培养液，吹打把细 胞打开。再加1640至10ml，混匀。 六、350g离心7min。倒掉上清，加入500μlAIM-V培养液， 震荡混匀。 2.细胞计数及稀释 七、计数细胞：取100μl台酚蓝于96孔板中，再加入25μl

步骤六液，吹打混匀，取出10μl加在细胞计数板上，显微镜下计数活细胞。 3.抗原A\B刺激特异性T淋巴细胞使之产生特定的细胞因子 八、根据标本数取本试剂盒中的微孔板，每份样本用4个检测孔，顺序标记各孔：○阴性对照、○抗原A、○抗原B、○阳性对照。（每条微孔板也标记好序号）。 九、按顺序加入阴对（ AIM-V）、抗原A、抗原B、阳对，各50μl，每孔加100ul配置好的细胞液。（A和阴对用一个枪头，B和阳对用一个枪头），全部加完后，标注时间，放入CO2培养箱培养16-20小时。 4酶联免疫检测☆☆☆ 十、次日准备1×PBS液，用200μl PBS洗板，重复洗4次.（洗去除因子外多余细胞及因子） 十一、根据标本量先计算好酶结合物工作液所需的量，以1:200的比例将酶结合物（酶标抗体）原液与PBS液混合，制成酶结合物工作液，每孔加50μl。4-8度孵育1小时。

医学检验免疫学检验归纳总结

三大免疫结合反应 直接凝集反应玻片凝集反应 试管凝集反应 间接凝集反应间接血凝试验 胶乳凝集试验 凝集反应 P47 明胶凝集试验 自身细胞凝集试验 抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原） 间接coombs试验（血清中的游离抗原） 液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法 抗体稀释法 免疫浊度测定 沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳 交叉免疫电泳 三大标记技术 一、放射免疫：放射免疫： 免疫放射：

二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法 光 免固相抗体竞争法 疫 分固相抗原竞争法 析 类 型 荧光偏振免疫测定测定 荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析 异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法 双位点一步法 Ag 间接法 双抗体夹心法 竞争法 捕获法 其他标记技术 化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术 固相膜免疫测定免疫试验IFA 免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA

免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱滤过法 磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法 免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法 淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：.......... 吞噬细胞...............

斑点杂交实验服务

斑点杂交实验服务 一、实验技术简介: 斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。【晶莱生物】 二、实验技术原理: 斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。 慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验， 蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、 核心期刊等服务。 三、实验操作流程： 1、DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 2、RNA斑点杂交 与上法类似、，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯0仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 3、完整细胞斑点杂交 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 四、实验注意事项： 客户提供： TotalRNA（DNA）≥20ug，浓度>1ug/ul，A260/A280>1.8；提供标记后的探针，需同时告知标记后探针的浓度及活性，待检测目的基因的Genbank 序列号。 交付标准： 1、图片

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法 点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybr i-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 （1）DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl（2-10μg DNA）。 ④将膜烘干，密封保存备用。 （2）RNA斑点杂交： 与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA 溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 （3）完整细胞斑点杂交： 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使

细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 DNA斑点杂交系列(二)-实验举例 一、实验原理 用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。 二、实验步骤 1. 处理： 将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作） 2. 变性： 【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。 将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。） 3. 点样： 【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。 将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

艾滋病的实验室诊断方法

科研方法学 班级：2008级研3班学号：2008128 姓名：段治华

艾滋病的实验室诊断方法 段治华 （山西医科大学，太原030001） 摘要:艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染引起的传染病，实验室检测是诊断艾滋病的主要手段，检测项目包括HIV抗原和抗体检测，病毒载量检测，CD4T 淋巴细胞检测，HIV耐药性检测，基因芯片技术的运用，病毒分离等。近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步，为艾滋病的准确诊断提供可靠的方法。 关键词:艾滋病 HIV 实验室诊断 艾滋病是获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS) 的英文音译，由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV) 感染引起的以免疫功能缺陷为主要特点的传染病[1]。目前在我国，艾滋病的流行已进入快速增长期，要有效地预防和控制艾滋病的流行，必须有可靠的诊断方法快速准确地诊断艾滋病。目前，艾滋病的诊断主要依靠实验室检测方法，近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步。现简单叙述目前采用的实验室诊断HIV的方法。 1 HIV结构特点 人类免疫缺陷病毒（HIV）外型呈球形或卵形，直径90～130nm，病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成其包膜。核心含有两条相同拷贝的RNA 链，外周核膜由多种蛋白质形成。HIV属逆转录病毒，基因组中存在三个大的开放读框，其顺序是gag-pol-env。Gag基因编码55KD的前体蛋白，在病毒成熟过程中，被pol基因编码的蛋白酶加工，分别产生核心蛋白P17、核壳蛋白P24和核酸结合蛋白P15 。P24是核壳组成蛋白，构成病毒的核衣壳，它的结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。在HIV-2与P24对应的是主要核心抗原P32，为HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白，由外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白

分子生物学检验完整版

１病原生物基因组在医学上有何应用?详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染与病毒载量c病毒分析ｄ细菌耐药监测与分子流行病学调查 2什么就是原癌基因，原癌基因有什么特性,原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见得激活机制有哪些？ 原癌基因就是指人类或其她动物细胞（以及致癌病毒)固有得一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征得基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白,核调节蛋白，细胞周期调节蛋白,抑制凋亡蛋白激活机制:插入激活,基因重排，基因点突变,基因扩增,基因转录改变 ３试述Dｏwｎ综合征（21三体综合征)得主要临床特征及核型。 临床特征:生长发育障碍,智力低。呆滞面容,又称伸舌样痴呆.４0％患者有先天性心脏畸形.肌张力低,５０%患者有贯通手,男患者无生育能力，女患者少数有生育能力,遗传风险高。 核型：92、5%患者游离型：核型为47，XX（XY），+21 2、５%患者为嵌合型：46，XＸ（XY)／４7，XX（ＸY)，+2１ 5％患者为易位型:４６,ＸX(XＹ)，—１4，＋t（1４ｑ2１q) 4简述淋球菌感染得主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法得优势 1直接涂片染镜检:敏感度与特异性差,不能用于确诊。 2分离培养法:诊断NG感染得金标准，但就是其对标本与培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中得非特异性反应严重以及抗体法间得稳定性与条件限制，推广受限. 分子生物学得优点：敏感,特异,可直接从了临床标本中检出含量很低得病原菌,适应于快速检测 5、在单基因遗传病得分子生物学检验中,点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HＡ）2突变体富集ＰCR法3变性梯度凝胶电泳法４化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法９RＮＡ酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌得分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNＡ)得检测、基因分型与耐药基因分析等。 1PCR技术:选择高度特异性得天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCＲ—斑点杂交技术：正向杂交与反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DＮA指纹技术：ＲFＬPRAPＤ电泳核型分析 AP—PCR技术：定义方法简便,快速，特别适合临床应用 DNA序列分析:可测定rDNＡ序列也适用于基因突变引起得耐药 基因芯片技术:适用于病原体得耐药研究 7、ＦVＩII基因倒位导致血友病A，ＤMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P19７,P2０3,P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了) 答:F VIIＩ基因倒位就是导致得血友病A得主要原因（占50％）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病Ａ。 同理DＭD基因外显子缺失就是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生得主要原因(６0％-７0％）。珠蛋白合成障碍性贫血有六种,主要得两种就是α珠蛋白生成障碍性贫血与β珠蛋白生成障碍性贫血,基因突变就是主要发病原因。 8、基因多态性有哪些得临床应用？(P4）

斑点金免疫渗滤试验

斑点金免疫渗滤试验 斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。 （一）原理 以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。 （二）试剂和操作 1.渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm

的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。 2.试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。 3.测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下： （1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。 （2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。 （3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。 （4）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。 （三）质量控制 滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。医学|教育网搜集整理双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵

斑点杂交法检测

斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨 作者：陆文英作者单位：江苏省盐城市慈航医院，江苏盐城224001 【摘要】目的：探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法平行检测76例临床标本和28种标准菌株。结果:46例肺结核患者痰标本抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性率分别为43.4%、50.0%、73.9%和56.5%；30例非结核患者痰标本、19种非结核分枝杆菌和9种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性，PCR法有3例阳性。结论:斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便，结果可靠，可用于结核病的快速诊断。 【关键词】结核分枝杆菌点杂交酸染色L-J培养 The Clinical V alue of Detection Mycobacterium Tuberculosis by Dot Blot Hybridization LU Wen-ying, et al (Cihang Hospital of Y ancheng City, Jiangsu Y ancheng 224001,China) Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis . Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It can be uesd to rapid diagnosis of TB. Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J culture 近年来结核病的发病率大幅提高，为早期、快速、准确诊断结核病，我们建立了斑点杂交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌，并应用于临床，同时与传统的涂片抗酸染色法、L-J 培养法、PCR法进行平行观察，以探讨其临床应用价值。 1 材料和方法 1.1 菌种来源: 19种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9种非分枝杆菌来自中国科学院微生物研究所。 1.2 标本来源：46例结核病人痰标本来自2004年至2006年盐城第一人民医院门诊病人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人，所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结核，30份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做4项检查，首先集菌涂片镜检，余下标本经3%NaAC-NaOH处理后分别用L-J培养法、PCR法、斑点杂交法进行检测。 1.3 试剂和仪器：斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成，其5＇端以地高辛标记，探针序列：5＇-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3＇。FQ-PCR试剂由深圳匹基公司提供，扩增仪为罗氏公司light cycle型。 1.4 方法

斑点印迹试验

免疫斑点试验 免疫斑点试验(Dot Immunobinding Assay, DIBA)是利用硝酸纤维素膜(N、C或醋酸纤维素膜作为固相支持物，进行抗原抗体反应的免疫学检测方法。该法具有微量、快速、经济、方便等特点，可用于检测抗体或抗原。近年来已较多地应用于医学基础研究和疾病的诊断。 (一)免疫斑点试验的基本原理 硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后(即可与膜上的抗原结合，犎;后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而判定结果。根据所用的标记物不同，可分为：辣根过氧化物酶免疫斑点试验（使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物)，碱性磷酸酶免疫斑点试验(使用硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶复合物作为酶标记物)和金银染色免疫斑点试验(使用胶体金作为抗抗体的标记物)等。其中，最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。下面以辣根过氧化物酶免疫斑点试验和碱性磷酸酶免疫斑点试验为例作一简单介绍。 (二)免疫斑点试验的基本步骤 方法一辣根过氧化物酶免疫斑点试验 将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液2μl 点于硝酸纤维素膜(或醋酸纤维素膜)上 ↓ 置37℃温箱中干燥20～30分钟 ↓ 滴加封闭液37℃温盒中封闭10分钟 ↓ 用洗涤液洗1～2次，滤纸吸干 ↓ 加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置 37℃湿盒中30分钟 ↓ 用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干 ↓ 水洗终止反应，观察结果。出现明显综 色斑点者为阳性 方法二碱性磷酸酶免疫斑点试验 将0.01M PBS PH7.4 稀释的抗原液2μl 点于硝酸纤维素膜上 ↓ 置37℃温箱中干燥20～30分钟 ↓ 用封闭液37℃湿盒中封闭10分钟 ↓ 用洗涤液震洗1～2次，滤纸吸干 ↓ 加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，

酶联免疫斑点技术

酶联免疫斑点技术 摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。 关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术 随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。1.ELISPOT技术的发展史 1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。但该方法不够灵敏。另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。 1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。 1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。 2. ELISPOT技术的基本原理 2.2ELISPOT 检测原理.在细胞受到刺激后局部产生CK,该CK被特异性的单克隆抗体捕获。洗去分泌细胞后,被捕获的CK与生物素(Biotin) 标记的二抗结合,然后再与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase , AKP) 或辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP) 标记的链亲和素结合。经底物,如BCIP/ NBT孵育后, 在PVDF 孔板出现有色的斑点即表明细胞产生了CK。通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。 2.2ELISPOT技术原理.ELISPOT的技术原理与ELISA 基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感度,便于检测微量的抗原或抗体。其实验设计是在96 微孔培养板的底部披覆PVDF 薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含Sodium azide、内毒素Endotoxin) 的单克隆抗体。然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞(Peripheral blood mononu2clear cell ,PBMC) ) 分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌CK,此时局部(紧靠分泌细胞的周围) 分泌出的CK会被PVDF 薄膜上包被的特异性抗体捕获。洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。然后将未结合的酶洗除,再以AKP 或HRP 标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/ NBT) 使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。斑点多少可以在ELISPOT读数系

分子生物问答及答案

1 什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么? 答：概念见名解56. 所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展，从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。 功能：基因是编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位，最终可合成各种特异的多肽，具有不同的功能。从化学角度看，基因是具有特定功能和结构的连续脱氧核糖核苷酸序列，是构成染色体的重要组成部分，是构成DNA的功能单位。 2真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？ 答：不能，真核细胞基因序列中的内含子是插入在结构基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随DNA 转录参与形成前体mRNA，而后在转录后的加工修饰过程中通过两次转脂反应而剪切，在原核细胞中，由于其基因组序列不包括这类内含子，也缺乏相应的内含子的剪接功能和转录后加工系统。因此不能完成内含子基因序列的剪切过程，是一种无效转录。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的原核RNA聚合酶以及可识别的原核细胞的启动子, 才能催化RNA的合成。 3试述DNA分子的结构及其意义。 答： DNA一级结构：即DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。其中A,T,C,G 碱基分布不均匀，但脱氧核糖和磷酸均一样。意义：1、蕴藏着极为丰富的转换为蛋白质的遗传信息；2、一些特定序列以其大量信息决定着DNA的空间结构及基因间相互作用和调控功能。 DNA二级结构：为DNA双螺旋结构，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成，两条链之间靠碱基间的氢键结合，多为右手螺旋。意义：解释了DNA 复制时两条链可分别作为模板生成新的子代互补链，从而形成遗传信息稳定传递的半保留复制机制。 DNA三级结构，指双螺旋结构基础上的卷曲，包括线状双链中可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环及环状DNA中的扭结、超螺旋和连环等体拓扑学状态。意义：1、使DNA体积更小，2、DNA的线性序列带遗传信息，而紧绷的超螺旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。 三链DNA：双螺旋结构基础上形成的三链螺旋结构。意义：1、作为精确切割双螺旋DNA靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响DNA 与蛋白质结合及DNA复制转录等。 四链DNA：如端粒酶是真核细胞DNA 3’末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。 4 试述cDNA文库的构建及其意义？ 答：过程：1、cDNA克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总RNA，根据3’末端polyA尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的mRNA2、第一股cDNA 合成：以分离纯化的mRNA为模板，以Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板的3’→5’方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长

临床医学检验技术(师)考试过关(含真题)必做题-(体液免疫球蛋白测定)

第十八章体液免疫球蛋白测定 A1/A2型题 1．与单向免疫扩散相比较，速率散射的优点在于（）。 A．灵敏度高 B．检测时间短 C．测定范围宽 D．精密度高 E．以上均是 【答案】E 2．自然杀伤细胞通过其表面Fc受体发挥的作用称为（）。 A．吞噬作用 B．趋化作用 C．ADCC效应 D．提呈作用 E．调理作用 【答案】C 3．下列属于非病理现象的是（）。 A．心肌梗死、糖尿病可观察到补体升高 B．新生儿脐带血中检测到IgM C．急慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌时补体合成下降

D．妊娠时补体增高 E．急性期反应时补体下降，常伴随其他血浆蛋白的改变【答案】D 4．免疫球蛋白的重链不包括（）。 A．α链 B．γ链 C．ε链 D．μ链 E．β链 【答案】E 5．评估肾小球滤过膜受损程度，常测定（）。 A．血IgG B．血IgM C．尿IgG D．尿IgM E．选择性尿蛋白指数 【答案】E 6．单克隆免疫球蛋白即（）。 A．A蛋白 B．M蛋白 C．热休克蛋白 D．N蛋白

E．X蛋白 【答案】B 7．下列关于免疫球蛋白与抗体关系的描述，正确的是（）。 A．免疫球蛋白就是抗体 B．抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白也就是抗体 C．抗体不等于免疫球蛋白 D．所有的抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都是抗体E．免疫球蛋白和抗体的结构是完全不同的 【答案】D 8．连接Ig分子的四条多肽链主要是依靠（）。 A．二硫键 B．极性结合 C．范德华力 D．氢键 E．非共价键 【答案】A 9．常可检测到血清中单一免疫球蛋白增高的疾病是（）。 A．慢性肝病 B．肺结核 C．类风湿性关节炎 D．SLE E．多发性骨髓瘤

基因扩增实验室可开展项目

基因扩增实验室可开展项目 乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)定性和定量检验 【正常参考值】 HBV-DNA定性(PCR法或斑点杂交试验):阴性；荧光定量PCR法:HBV-DNA＜103拷贝／ml 【临床意义】血液中HBV-DNA的存在是HBV感染最直接、最灵敏和最特异的诊断指标 丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)定性和定量检验 【正常参考值】 HCV-RNA定性(RT-PCR法):阴性；荧光定量PCR法:HCV-RNA＜103拷贝／ml 【临床意义】HCV-RNA阳性，有助于HCV感染的早期诊断:提示HCV复制活跃，传染性强。HCV-RNA和抗-HCV同时阳性，提示活动性感染；HCV-RNA阴转，提示复制受抑，预后较好；HCV-RNA阴性而抗-HCVIgG阳性提示既往感染。HCV-RNA检测有助于发现抗-HCV阴性期的急慢性肝炎，尤其对抗-HCV低滴度反应患者更有意义。 HCV-RNA定量检测，可连续观察HCV-RNA的动态变化，对判断病情及预后、监测干扰素等药物的疗效以及检测血制品的安全性有重要意义。 乳头瘤病毒(HPV)的DNA检测 【正常参考值】PCR法检测HPV-DNA定性试验:阴性。 【临床意义】生殖道标本HPV-DNA检测阳性可确诊为乳头瘤病毒感染，是目前最常用的主要检查手段 HPV基因分型 【临床意义】宫颈癌是人类所有癌症中唯一病因明确的癌症，即人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌发生的必要条件和主要病因，99.7%的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染，从HPV感染到宫颈癌的发生需要经过多年甚至数十年的时间，这为宫颈癌筛查指明了方向。因此早期定期进行HPV感染的筛查，对预警癌变倾向，及时发现、预防和早期诊断及临床治疗具有非常重要的意义。 相关检查项目：组织原位杂交，基因芯片技术，液基细胞学试验 EB病毒DNA定性 【正常参考值】PCR法检测EBV-DNA定性试验:阴性。 【临床意义】EB病毒属于疱疹病毒，可引起增殖性感染和非增殖性感染。特别是非增殖性感染，可导致细胞癌变。被认为与传染性单核细胞增多症。淋巴癌、鼻咽癌、何杰金氏癌、慢性疲劳综合症有关。 相关检查项目：EB病毒特异性抗体或异嗜性抗体凝集试验 沙眼衣原体(CT) DNA检测 【正常参考值】PCR法检测CT-DNA定性试验阴性。 【临床意义】沙眼衣原体阳性常见于非淋病性尿道炎、性病性淋巴肉芽肿、新生儿眼结膜炎等。泌尿生殖道标本CT-DNA检测阳性可确诊为沙眼衣原体感染，是目前最常用的主要检查手段。 解脲支原体(UU)的DNA检测