DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法

点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybr i-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。

（1）DNA斑点杂交：

①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。

②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。

③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl（2-10μg DNA）。

④将膜烘干，密封保存备用。

（2）RNA斑点杂交：

与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA

溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。

（3）完整细胞斑点杂交：

应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使

细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。

DNA斑点杂交系列(二)-实验举例

一、实验原理

用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。

二、实验步骤

1. 处理：

将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）

2. 变性：

【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。

将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。）

3. 点样：

【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。

将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

4. 预杂交：

【原理】封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。

将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。用1000μL加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min. 5. 杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。（已准备好）

6. 杂交：

剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL,除去气泡，封口。置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。

7. 洗膜：

【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。

（1）回收杂交液；

（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min；

（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min。

8. 封闭：

取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用3 0-60min。

【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。（在此阶段末期，准备下一步的抗体稀释。稀释

方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后轻轻混匀，4℃可保存12h.）

9. 酶联抗体结合：

将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室温作用30min，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。

10.洗膜：

（1）取出膜，将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中，洗膜两次，每次15min。

【原理】洗去未结合的酶联抗体。

（2）取出膜，将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平衡2min。

11.显色：

（1）将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中，（注：显色液必需现配现用！）

（2）在10mL新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时，常在12h内完成显色反应。

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法） 1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。 2.应用范围: PCR实验室。 3.职责: 3.1 文件编写：实验室技术员。 3.2 文件审核：实验室主管。 3.3 文件审批：实验室主任。 3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。 4. 参考文献: 4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》 4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书 5. 内容: 5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。 5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA. 5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。 5.3.1 标本类型：血清。 5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。 5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。 5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。 5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。 5.4 设备和试剂: 5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。 5.4.2 试剂： 5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒 5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100

实验一-DNA提取

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

实验二 园艺植物有性杂交技术

实验二园艺植物有性杂交技术 一、实验目的 通过实验掌握有性杂交技术。 二、实验材料 油菜、甘蓝、桃花、油菜花 三、实验用具 毛笔、镊子、标签、纸袋。 四、实验原理 杂交是基因重组的过程。通过杂交可以把亲本双方控制不同性状的有利基因综合到杂种个体上，使杂种个体不仅具有双亲的优良性状，而且在生长势、抗逆性、生产力等方面超越其亲本，从而获得某些性状都更符合要求的新品种。 五、步骤 1.亲本选配：根据育种目标和亲本选配的原则选配亲本； 2.杂交母株的选择：选择生长健壮、开花结实正常的优良单株作为母株。在母株数量较多时，一般不要在路旁或人流来往较多的地方选择，以确保杂交工作的安全。去雄的花朵以选择植株中上部和向阳的花为好。每株保留2～3朵花较好，种子和果实小的可适当多留一些，多余的摘去，以保证杂种种子的营养。 3.花期调整：杂交育种时，有时选择的两个杂交亲本开花时间不一致，使得难于进行杂交，在这种情况下，就需对开花期进行调整或收集父本花粉贮藏等。植物开花与温度、光照等因素有关。掌握了植物生长发育规律，就可通过适当的栽培措施，调节温度、光照或采用植物生长调节剂等手段对植物进行处理，使开花期满足杂交要求。在调整花期前，首先应弄清楚影响植物花期的主要因子是什么，然后再采用相应的措施调整开花期。 4.隔离：两性花的品种为防止自交，杂交前需将花蕾中未成熟的花药除去。去雄时注意尽量不要碰伤雌蕊。去雄时如果工具被花粉污染，须用70%酒精消毒，去雄后立即套袋以免其他花粉干扰。风媒花可用纸袋，虫媒花可用细纱布袋。袋子应两端开口，套上后上端向下卷折，用回形针夹住，下端扎在枝上，在扎口周围最好垫上棉花，防止昆虫钻入或夹伤花枝。对于不需要去雄的母本花朵，也必须套袋，以防止外来花粉影响。对于同一朵花的花药开裂时间较长的花卉，如山茶，它的父本花朵也应在开花前套上袋子隔离。套袋上挂上纸牌或塑料牌，用铅笔注明去雄日期。 5.花粉采集：（1）花粉收集：为了保证父本花粉的纯度，在授粉前对将要开放的发育好的花朵或花序必须应先套袋隔离，以免掺杂其他花粉，待花粉成熟散粉时，可直接采摘父本花朵，对母体进行授粉。也可以把花朵或花序剪下，在室

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/b37609095.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；

园艺植物有性杂交技术

园艺植物有性杂交技术 一、实验目的 通过实验，学习并掌握去雄、套袋、授粉等有性杂交技术，为开展园艺植物杂交育种工作打下初步基础。 二、实验材料 xx，黄花xx，葱兰等植物中的一种。 三、实验用具 镊子、标牌、放大镜、隔离纸袋、回形针、铅笔、记录本等。 四、实验原理 有性杂交是基因重组的过程。通过杂交可以把亲本双方控制不同性状的有利基因综合到杂种个体中，使杂种个体不仅具有双亲的优良性状，而且在生长势、抗逆性、生产力等方面甚至超越其亲本，从而获得某些性状更符合人类需要和育种目标的新品种。 五、实验方法与步骤 1．亲本的选择与选配根据育种目标和亲本选择、选配的原则选择和选配亲本。 2．亲本植株和花朵的选择 选择发育正常、生长健壮、无病虫害且具有本品种典型特征的植株作为杂交亲本植株。杂交母株应选开花结实正常的优良单株，在母株数量较多时，一般不要在路旁或人流来往较多的地方选择，以确保杂交工作的安全。杂交的花朵以选择健壮花枝中上部即将开放的花蕾为好，每株（或每枝）保留3～5朵花，种子和果实小的可适当多留一些，多余的花蕾、已开放的花朵、果实全部摘去，以保证杂交果实的顺利生长与成熟。 3．花期调整

杂交时，如果选择的两个亲本存在花期不遇现象，则需对其开花期进行调整或收集父本花粉贮藏。在调整花期前，首先应弄清楚影响植物花期的主导因子，然后再采用相应的措施进行调整。如可通过采取适当的栽培措施，调节温度、光照或采用植物生长调节剂等手段对植物进行处理，使开花时期能满足杂交要求。 4．去雄、套袋 两性花的品种为防止自交，杂交前需将花蕾中未成熟的花药除去。去雄时，剥开花瓣用镊子夹住花丝，将雄蕊全部除去，同时注意尽量不要碰伤雌蕊。去雄过程中，如果工具被花粉污染，须用70%以上的酒精消毒，去雄后立即套袋隔离以免其他花粉干扰。风媒花用纸袋，虫媒花可用细纱布袋。袋子一般两端开口，套上后上端向下卷折，用回形针夹住，下端扎在花枝上，扎口周围最好垫上棉花，防止夹伤花枝。对于不需要去雄的母本花朵，也必须套袋，以防外来花粉影响。套袋后挂上标牌，注明母本名称和去雄日期。 5．花粉采集贮藏 为了保证父本花粉的纯度，在授粉前应对将要开放的发育良好的花蕾或花序先行套袋隔离（已开放的花朵摘除），以免掺杂其他花粉。待花药成熟散粉时，可直接采摘父本花朵，对母体进行授粉；也可把花朵或花序剪下，于室内阴干后，收集花粉备用。 对于双亲花期不能相遇或亲本相距较远的植物种类，如果父本先于母本开花，可将父木花粉收集后妥善贮藏或运输，待母本开花时再进行授粉，从而打破杂交育种中双亲时间上和空间上的隔离，扩大杂交育种范围。 6．授粉 待母本柱头分泌粘液或发亮时，即可授粉。授粉工具可用毛笔、棉球等，或者用镊子夹住父本已开裂花药的花丝轻轻碰触母本柱头；对于风媒花，由于花粉多而且干燥，可用喷粉器授粉。为确保授粉成功，可重复授粉2～3次。授粉工具授完一种花粉后，必须用酒精消毒，才能授另一种花粉。授粉完成后立即封好套袋，并在挂牌上标明父本名称、授粉日期、授粉次数等。数日后如发

检测试剂盒反向斑点杂交法

人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书 （PCR-反向斑点杂交法） 【产品名称】 通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB） 【包装规格】25人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。 【检测原理】反向斑点杂交法 本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。 本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、 68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、 69、70、72、81型。

【主要组成成分】 【自备试剂】 1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓 HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容 至200mL，高压灭菌，室温保存。 3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0， 定容至1000mL，室温保存。 4、A液：(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 5、B液：（0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 6、C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。 【储存条件及有效期】 核酸扩增组分（试剂盒I）于-20℃以下冷冻保存；杂交组分（试剂盒II）和核酸提取组分于2～8℃冷藏保存；TMB应避光保存。试剂有效期6个月。 【适用仪器】 核酸扩增仪：ABI-Veriti(USA)；Ependorf Gradient(German)；MJPTC-100(USA)；AB9700(USA)等。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

dna粗提取的实验步骤

实验步骤——以洋葱为实验材料： 1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L 的氯化钠溶液，充分研磨。 洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。 2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。 3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。 此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。 实例: 用鸡血细胞液粗提取DNA 并鉴定步骤 1、提取鸡血细将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好) 5~10mL，注入到50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL 的烧杯中，取其滤液。图示胞的细胞核物质 2、溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液40 mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA 在溶液中呈溶解状态。 3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 5、将DNA 的粘稠物再溶解取一个50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中)。 7、提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95% 的酒精溶液50 mL(加入时动作要慢)，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/ L 的NaCl 溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

小麦的有性杂交技术

小麦的有性杂交技术实验 一、目的： 了解小麦的花器结构和开花习性，掌握小麦的有性杂交技术. 二、实验原理 小麦是自花授粉作物，通常自然异交率极低，为了提高育种效率，促进品种间的基因重组，进行小麦的人工有性杂交是小麦育种中最常用的方法。㈠小麦的花器构造小麦属复穗状花序，由许多互生的小穗组成，小穗基部着生两个护颖和3-9 朵小花，但正常发育的都是基部的2-5 朵小花，小穗上部的小花往往退化。 每朵小花自外向里有外颖、内颖各1 片；鳞片2 个；雄蕊（花丝、花药）3 个；雌蕊（子房、柱头、花柱）1 个，呈羽毛状分裂。外颖顶端有芒或无芒㈡开花习性小麦多数品种为开颖授粉，也有少数闭颖授粉。通常小麦抽穗2-4 天开花（有的当天就开花，也有的抽穗10 天才开花），小麦的开花昼夜进行，其开花的高峰期随地区、品种、当时温、湿度有所差异。通常一天有两个高峰，上午8-11 时，下午约2-6时开花最盛，小麦开花的最适温度18-23E，最适相对湿度70-80%, 小麦花粉在田间条件下的生活力约20分钟。小麦的开花顺序，就全株而言先主穗后分蘖穗；同一穗上，先中部的小穗，然后依次向上、向下两端开放；就一个小穗而言，先基部第一朵小花，然后依次向上，全穗开花约3-5 天。 小麦开花时，鳞片吸水膨胀，迫使外颖张开，同时花丝迅速伸长并伸出颖片外，花粉囊破裂而散粉，一朵小花开花时间很短，大约15-20分钟，开花后花粉落在柱头上1-2 小时开始萌发 三、所需用品 1.用品试验地种植的小麦品种，镊子、剪刀、75%的酒精、透明纸袋、纸牌回形针、小杯。 四、操作方法 1. 普通法（1 ）选穗整穗 根据确定的杂交组合，在母本群体内选择典型、健壮植株的主茎穗（刚抽出叶鞘、花药呈绿色）用镊子去掉穗基部和顶部发育不良的小花每穗留中部10个发育较一致的小穗. 用镊子将小穗的上部小花去掉，只留基部外侧两朵发育好的小花. 全穗约留20 朵左右小花 2.去雄套袋 去雄时用左手大拇指和中指夹住麦穗，用食指轻压外颖的顶部使内外颖分开，右手用镊子插入内外颖的合缝里，轻轻镊出三个雄蕊（注意：不要夹破花药和碰伤柱头）. 去雄工作应从穗的一侧由下而上顺序进行，去完一侧再进行另一侧，不能遗漏. 去雄时如发生花药破裂（或花药呈黄色）这朵花应剪去，应用酒精擦净镊子，以免发生串粉现象. 去雄完毕，即刻套袋隔离. 挂号标牌 3.授粉： 在去雄后1-3天内进行授粉，结实率较高。授粉以上午8时以后（8-11时）4 时以前开花较盛时为宜，授粉前先检查柱头有无损伤。如柱头已呈羽毛状分叉、有光泽，表明正是授粉适期。采集成熟的父本花粉（花药金黄色，有花粉散出）于小杯（或纸上）中，然后立即用授粉器（将花粉）依次放入每朵去雄的花内，全穗授粉后将纸袋套好，牌上写上父本名称，授粉日期，10 天后将纸袋去掉。㈡“小麦捻调穗”杂交法

斑点杂交实验

斑点杂交实验 探针的标记： 取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。 点膜： 样品DNA：50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释） 变性：1N NaOH 30分钟 中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。 预杂交： 预杂交液 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）

膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。 杂交： 杂交液的配制： 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml） 双蒸水补4ml 探针DNA（变性）20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗：62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’

斑点杂交实验服务

斑点杂交实验服务 一、实验技术简介: 斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。【晶莱生物】 二、实验技术原理: 斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。 慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验， 蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、 核心期刊等服务。 三、实验操作流程： 1、DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 2、RNA斑点杂交 与上法类似、，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯0仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 3、完整细胞斑点杂交 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 四、实验注意事项： 客户提供： TotalRNA（DNA）≥20ug，浓度>1ug/ul，A260/A280>1.8；提供标记后的探针，需同时告知标记后探针的浓度及活性，待检测目的基因的Genbank 序列号。 交付标准： 1、图片

dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。 （2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。 （3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀 （4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h； （4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。 （4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。 （6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。 （7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 （8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。 （11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。 （12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。 （13）-20℃保存备用。 1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增 （1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

实验一 DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

实验四、园艺植物的有性杂交技术

实验四园艺植物的有性杂交技术 一、实验目的 通过实验掌握有性杂交技术。练习实际操作方法，提高实际动手能力。 二、实验原理 杂交是基因重组的过程。通过杂交可以把亲本双方控制不同性状的有利基因综合到杂种个体上，使杂种个体不仅双亲的优良性状，而且在生长势、抗逆性、生产力等方面超越其亲本，从而获得某些性状都更符合要求的新品种。 三、实验材料与用品 （一）材料：已经开花的不同品种园艺植物（月季、菊花、桃花、番茄、黄瓜等）植株。 （二）仪器设备和药品：镊子、放大镜、铅笔、纸牌、脱脂棉、各种规格的羊皮纸袋、70%的酒精、隔离网。 四、时间安排 2学时。 五、方法与步骤 1.亲本选配：根据育种目标和亲本选配的原则选配亲本； 2.杂交母株的选择：选择具有母本品种典型性状的、生长健壮、开花结实正常的优良单株作为母株。在母株数量较多时，一般不要在路旁或人流来往较多的地方选择，以确保杂交工作的安全。去雄的花朵以选择植株中上部和向阳的花为好。每株（或每株）保留3～3朵花较好，种子和果实小的可适当地多留一些，在选定了花序或花之后，把多余的花序、已开的花、结的果实及小蕾除去，以保证杂种种子的营养。 3.花期调整：杂交育种时，有时选择的两个杂交亲本开花时间不一致，使得难于进行杂交，在这种情况下，就需对开花期进行调整或收集父本花粉贮藏等。植物开花与温度、光照等因素有关。掌握了植物生长发育规律，就可通过采取适当的栽培措施，调节温度、光照或采用植物生长调节剂等手段对植物进行处理，使开花时期能满足杂交要求。在调整花期前，首先应弄清楚影响植物花期的主要因子是什么，然后再采用相应的措施调整开花期。 4．母本花的去雄和隔离两性花的品种为防止自交，杂交前需将花蕾中未成熟的花药除去。去雄时可用手或镊子，同时注意尽量不要碰伤雌蕊。去雄时如果工具被花粉污染，须用70%以上的酒粉消毒，去雄后立即套袋以免其他花粉干扰。风媒花可用纸袋，虫媒花可用细纱布袋。袋子应两端开口，套上后上端向下卷折，用回形针夹住，下端扎在枝上，在扎口周围最好垫上棉花，防止昆虫钻入或夹伤花枝。对雌雄异花的在雌花开放前适当整枝后套袋隔离。在去雄前应把已经开的花、果和小蕾去掉，只留用于去雄的大蕾，去雄的时间一般在授粉前的1~2天进行，去雄后套上纸袋隔离，套袋上挂上纸牌或塑料牌，用铅笔注明日期。 5．父本花的隔离和采粉无论异花授粉植物还是自花授粉植物，为了防止非目的杂交，都应对父本进行隔离。花粉的收集与贮藏在前面的实验中已经讲述。

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法 点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybr i-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 （1）DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl（2-10μg DNA）。 ④将膜烘干，密封保存备用。 （2）RNA斑点杂交： 与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA 溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 （3）完整细胞斑点杂交： 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使

细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 DNA斑点杂交系列(二)-实验举例 一、实验原理 用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。 二、实验步骤 1. 处理： 将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作） 2. 变性： 【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。 将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。） 3. 点样： 【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。 将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

试验八植物有性杂交试验

实验八植物有性杂交实验 一、实验目的与要求 掌握一些作物或花卉的杂交方法，为遗传育种研究奠定基础。 二、实验类型 本实验为验证型实验。 三、实验原理及说明 两个具有不同基因型的品种类型，通过雌雄细胞的结合，产生新类型，称为杂交。 在有性杂交中把接受花粉的植株叫做母本，用符号“♀”表示；供给花粉的植株称父本，用“♂”表示。父母本统称亲本，用“P”表示，杂交符号用“×”表示，自交符号用“○×”表示，杂种一代用F1表示，杂种二代用F2表示，依此类推。 四、实验仪器 略 五、实验内容和步骤 1.实验准备 （1）用具：小麦、水稻小镊子，剪刀，棉花，纸牌，透明纸袋，回形针，大头针等。 （2）药品：酒精等 2.实验方法和步骤： （1）小麦 ①选穗，整穗：选择生长壮健的植株主穗作母本，剪去上部和基部小穗，只留中部10个小穗10个小穗（两边各5个），每个小穗只留基部两个花，中间的花用镊子夹除，若有芒一起剪掉，便于操作。 ②去雄：用左手握住麦穗，并轻轻压开花朵的颖顶部，右手将镊子插入到内外颖的合缝里，夹住雄蕊，轻轻拿出，注意不要夹破也不要碰伤柱头。去雄要有顺序，从下而上。每次去雄后的镊子在酒精棉花内洗一下。以免把花粉带到别处去了。 ③套袋隔离：母本穗子去雄完毕后，必须立即用纸袋套上，以防其他花粉进入，套袋后把袋口折叠住，用回形针或大头针别住，以免被风吹落，挂上纸牌（在纸牌上用铅笔注明母本“♀”名称，去雄日期）。 ④采集花粉的方法：可根据小麦开花习性，看到某穗中部有一、二朵小花已开时，那些靠近的花也将开放，用镊子把这些花药取出，也可以剪去一些颖壳，促使开花，收集花粉，以便进行授粉。 ⑤授粉：去雄花朵的柱头呈羽状分叉时，表示柱头已经成熟，应该进行授粉，一般在去雄后的第二天上午8时以后（露水已干），下午4时以前进行授粉，较为适当，若遇到阴雨，温底低，可在去雄后3—4天内授粉，授粉完毕后，再套上纸袋。在去雄纸牌的背面写

分子生物学检验完整版

１病原生物基因组在医学上有何应用?详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染与病毒载量c病毒分析ｄ细菌耐药监测与分子流行病学调查 2什么就是原癌基因，原癌基因有什么特性,原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见得激活机制有哪些？ 原癌基因就是指人类或其她动物细胞（以及致癌病毒)固有得一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征得基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白,核调节蛋白，细胞周期调节蛋白,抑制凋亡蛋白激活机制:插入激活,基因重排，基因点突变,基因扩增,基因转录改变 ３试述Dｏwｎ综合征（21三体综合征)得主要临床特征及核型。 临床特征:生长发育障碍,智力低。呆滞面容,又称伸舌样痴呆.４0％患者有先天性心脏畸形.肌张力低,５０%患者有贯通手,男患者无生育能力，女患者少数有生育能力,遗传风险高。 核型：92、5%患者游离型：核型为47，XX（XY），+21 2、５%患者为嵌合型：46，XＸ（XY)／４7，XX（ＸY)，+2１ 5％患者为易位型:４６,ＸX(XＹ)，—１4，＋t（1４ｑ2１q) 4简述淋球菌感染得主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法得优势 1直接涂片染镜检:敏感度与特异性差,不能用于确诊。 2分离培养法:诊断NG感染得金标准，但就是其对标本与培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中得非特异性反应严重以及抗体法间得稳定性与条件限制，推广受限. 分子生物学得优点：敏感,特异,可直接从了临床标本中检出含量很低得病原菌,适应于快速检测 5、在单基因遗传病得分子生物学检验中,点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HＡ）2突变体富集ＰCR法3变性梯度凝胶电泳法４化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法９RＮＡ酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌得分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNＡ)得检测、基因分型与耐药基因分析等。 1PCR技术:选择高度特异性得天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCＲ—斑点杂交技术：正向杂交与反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DＮA指纹技术：ＲFＬPRAPＤ电泳核型分析 AP—PCR技术：定义方法简便,快速，特别适合临床应用 DNA序列分析:可测定rDNＡ序列也适用于基因突变引起得耐药 基因芯片技术:适用于病原体得耐药研究 7、ＦVＩII基因倒位导致血友病A，ＤMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P19７,P2０3,P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了) 答:F VIIＩ基因倒位就是导致得血友病A得主要原因（占50％）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病Ａ。 同理DＭD基因外显子缺失就是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生得主要原因(６0％-７0％）。珠蛋白合成障碍性贫血有六种,主要得两种就是α珠蛋白生成障碍性贫血与β珠蛋白生成障碍性贫血,基因突变就是主要发病原因。 8、基因多态性有哪些得临床应用？(P4）