斑点杂交法检测

斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨

作者：陆文英作者单位：江苏省盐城市慈航医院，江苏盐城224001

【摘要】目的：探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法平行检测76例临床标本和28种标准菌株。结果:46例肺结核患者痰标本抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性率分别为43.4%、50.0%、73.9%和56.5%；30例非结核患者痰标本、19种非结核分枝杆菌和9种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性，PCR法有3例阳性。结论:斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便，结果可靠，可用于结核病的快速诊断。

【关键词】结核分枝杆菌点杂交酸染色L-J培养

The Clinical V alue of Detection Mycobacterium

Tuberculosis by Dot Blot Hybridization

LU Wen-ying, et al

(Cihang Hospital of Y ancheng City, Jiangsu Y ancheng 224001,China)

Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis . Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It can be uesd to rapid diagnosis of TB.

Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J culture

近年来结核病的发病率大幅提高，为早期、快速、准确诊断结核病，我们建立了斑点杂交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌，并应用于临床，同时与传统的涂片抗酸染色法、L-J 培养法、PCR法进行平行观察，以探讨其临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 菌种来源: 19种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9种非分枝杆菌来自中国科学院微生物研究所。

1.2 标本来源：46例结核病人痰标本来自2004年至2006年盐城第一人民医院门诊病人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人，所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结核，30份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做4项检查，首先集菌涂片镜检，余下标本经3%NaAC-NaOH处理后分别用L-J培养法、PCR法、斑点杂交法进行检测。

1.3 试剂和仪器：斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成，其5＇端以地高辛标记，探针序列：5＇-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3＇。FQ-PCR试剂由深圳匹基公司提供，扩增仪为罗氏公司light cycle型。

1.4 方法

1.4.1 斑点杂交法：根据结核分枝杆菌16s rRNA保守序列设计探针，其5′端以地高辛标记，标本经3%NaAC-NaOH 消化后，常规异硫氰酸胍裂解，酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀法提取结核分枝杆菌rRNA，将抽提的rRNA纯化后直接点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标记探针杂交，酶呈色观察结果。

1.4.2 FQ-PCR法，严格按试剂说明书操作，同时作阳性，阴性对照。

1.4.3 集菌涂片抗酸染色法采用结核病诊断细菌学检验规程［1］推荐方法，痰培养采用L-J培养法［1］。

1.5 统计学处理:采用PEMS3.0统计软件对数据进行X

2 检验。

2 结果

2.1 四种方法平行检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，结果表明，集菌涂片镜检法，L-J培养法、PCR法、斑点杂交法结核分枝杆菌的检出率分别为4

3.4%(20/46)、50.0%(23/46)、73.9%(34/46)、56.5%(26/46)，结果见表1。表1 46例临床标本斑点杂交法与其它三种方法平行检测结果（略）

2.2 30例非结核呼吸系统疾病患者痰标本和牛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏加分枝杆菌、胃分枝杆菌、次要分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、不产色分枝杆菌、母牛分枝杆菌、浅淡黄分枝杆菌、草分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假白喉杆菌、草绿色甲链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌、卡他球菌、大肠埃希菌、肺炎球菌检测结果显示，培养法、斑点杂交法均为阴性，PCR法有3例阳性,培养法、斑点杂交法特异性为100%，而PCR法特异性为94.8%(55/58)。

3 讨论

斑点杂交法根据结核分枝杆菌菌体内含有大量rRNA的特点，直接将细菌的rRNA抽提后，点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标记探针杂交，酶呈色观察结果，目前国内尚未见报道。由于rRNA在细菌死后极易降解，一般认为只存在于活菌菌体内，故阳性具有结核分枝杆菌活菌的诊断价值［2］。该法采用探针杂交的方法，具有较高的特异性，同时又采用酶呈色观察结果，使杂交信号得以放大，提高了灵敏度，有一定的推广应用价值。

传统的结核分枝杆菌检测方法主要有集菌涂片法和培养法，涂片法具有简便、快速、价廉的特点，但检出率较低，并需进一步试验才可确定是否为结核分枝杆菌，同时它不能鉴别菌体的死活。培养法一直被作为结核分枝杆菌检测的金标准，然而检测时间长，不适合临床早期诊治的需求，同时影响其检出率的因素较多，易造成漏诊。近年来兴起的PCR方法，大大提高了检出率，但假阳性率较高，又有假阴性，从而影响其临床应用［3］。实验结果显示，斑点杂交法检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，检出率为56.5%，高于集菌涂片法（43.4%）和培养法（50.0%），低于PCR法的73.9%；30例对照组、19种非结核分枝杆菌和9种非分枝杆菌标准株检测结果显示，斑点杂交法、培养法均为阴性，特异性为100%，而PCR法有3例阳性，特异性为94.8%，由此可以看出，斑点杂交法检测时间短，结果准确，且不会像PCR检测出现假阳性，可以用结核病的快速诊断。

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【参考文献】

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2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： （1）外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生

DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。

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ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，

原位杂交原理及具体操作

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射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位

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几种常用的抗体检测方法 (1)免疫酶技术 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。 A、器材和试剂 a. 包被缓冲液： 碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。 Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml 混合，加蒸馏水至1000ml。 b. 洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4&S226;12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。 c. 稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。 d. 酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。 e. 底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L 柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。 f. 底物使用液： OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。 ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。 g. 抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。 h. 抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。 病毒感染的传代细胞或全菌抗原。 淋巴细胞等悬液。 i. 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。

检测试剂盒反向斑点杂交法

人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书 （PCR-反向斑点杂交法） 【产品名称】 通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB） 【包装规格】25人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。 【检测原理】反向斑点杂交法 本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。 本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、 68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、 69、70、72、81型。

【主要组成成分】 【自备试剂】 1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓 HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容 至200mL，高压灭菌，室温保存。 3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0， 定容至1000mL，室温保存。 4、A液：(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 5、B液：（0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 6、C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。 【储存条件及有效期】 核酸扩增组分（试剂盒I）于-20℃以下冷冻保存；杂交组分（试剂盒II）和核酸提取组分于2～8℃冷藏保存；TMB应避光保存。试剂有效期6个月。 【适用仪器】 核酸扩增仪：ABI-Veriti(USA)；Ependorf Gradient(German)；MJPTC-100(USA)；AB9700(USA)等。

酶联免疫法

酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之

结核感染T细胞T-SPOTTB检测项目酶联免疫斑点技术

结核感染T细胞（T-SPOT.TB） 一、名称 结核感染T细胞（T-SPOT.TB） 二、项目简介、临床意义及收费标准 T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，其灵敏高于ELISA方法。该检测通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。 该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况，其诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。 对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。 收费标准：740元/人份，收费依据：混合淋巴细胞培养（W0309050020）（250元）×2次；干扰素测定（W0309060008）（120元）×2种抗原。 三、标本采取 1.静脉血：肝素锂（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀， 以免血液凝固。采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。 2.脑脊液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混 匀。 3.浆膜腔积液（胸水、腹水、心包积液）：无菌密闭容器留取50ml以上，每100毫 升加2500IU（0.4ml）抗凝并立即混匀。 4.关节液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混 匀。 四、检测时间、报告时间 检测时间：每周二（节假日除外）进行检测，标本必须在上午9点前送达实验室。 报告时间：周三出报告。 五、注意事项 1.标本采集后4小时内必须送到实验室进行检测，标本采集后如果超过4小时未送 检将严重影响检测结果。 2.检测脑脊液、浆膜腔积液、关节液，须同时送检静脉血。 3.冬季运送标本时注意保温，避免冷冻。 六、联系科室和电话 检验科微生物室(TeL：84205491)

斑点杂交实验

斑点杂交实验 探针的标记： 取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。 点膜： 样品DNA：50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释） 变性：1N NaOH 30分钟 中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。 预杂交： 预杂交液 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）

膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。 杂交： 杂交液的配制： 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml） 双蒸水补4ml 探针DNA（变性）20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗：62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’

酶联免疫分析法

酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围

原位杂交技术步骤

1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design). 每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。另外。互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。 **注意关键： 1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。 2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套 3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5￠(反义核酸探针)或3￠(对感官探测)来插入。净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。 2| Run the PCR using the conditions tabulated below. 使用下面列出的条件运行PCR **暂停点：把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。 3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature. 加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。在室温下1000g离心15 - 20分钟。 **注意关键：膜应该是干的。如果没有再离心 4|Place the Microcon column into a new microfuge tube (provided in the kit), add 20ml of sterile water, vortex briefly and then turn the Microcon column upside down. Spin for 1 min at 1,000 g at room temperature to recover the DNA. 把小层析柱放在一个新的离心管(在这个工具包中提供),增加20毫升的无菌水、短暂离心,然后颠倒层析柱。自旋1分钟1000 g在室温下恢复了DNA **注意关键：离心的步骤应该快速。离心机1分钟只是为了避免样本太干。 5|Check the quality, quantity and size of the PCR amplification product by loading 1/20 of the preparation on a 1% (wt/vol) agarose gel in 1 TBE buffer. DNA should appear as a band and not as a smear. The 1/20 of the preparation should contain at least 40 ng of DNA. 通过装载1/20的稀释液在1*的TBE buffer缓冲液中的1% (wt/vol)的琼脂糖凝胶检查PCR的扩增产物的质量

酶联免疫斑点技术诊断潜伏结核的系统分析

酶联免疫斑点技术诊断潜伏结核的系统分析 【摘要】目的系统分析方法评价酶联免疫斑点技术快速诊断潜伏结核的准确性。方法通过检索PubMed、EMBASE、CNKI等数据库和其他方式收集文献。用Meta-Disc软件计算合并灵敏度、合并特异性和ROC曲线等评价T细胞斑点试验的诊断正确性。结果终纳入6篇文献。酶联免疫斑点技术在检测潜伏结核时,均显示了较高的灵敏度,但特异性相对较低,且存在异质性。合并灵敏度=93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],合并特异性=合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],ROC曲线下面积为0.9658。结论联免疫斑点技术诊断潜伏结核显示了较高的灵敏度,但特异性相对较差,限制了该方法的应用。 【关键词】潜伏结核;分枝杆菌;诊断;酶联免疫斑点技术;系统分析 人体感染结核分枝杆菌后,只有小部分可引起急性疾病过程,大部分则由于机体形成有效的免疫应答,阻止疾病的发展而成为无临床症状的潜伏感染状态[1]。控制结核病的一个重要措施,就是筛查出潜在性结核感染者并进行预防性治疗。有鉴于此,近年来该病的早期诊断成为一个研究热点[2]。免疫斑点(enzyme link immunospot,ELISPOT)试验的理论基础是当结核菌致敏的T淋巴细胞再次遭遇人型结核分枝杆菌抗原时,可在体内产生体外抗原诱导的干扰素-γ(INF-γ)[3]。目前,国内外已开展了多项ELISPOT检测分泌INF-γ的研究,但各家结果不尽相同。本研究旨在客观评价ELISPOT在潜伏结核快速诊断中的临床应用价值,结果报告如下。 1 资料和方法 1.1 纳入标准潜伏结核患者,痰涂片结核分枝杆菌阴性;以结核分枝杆菌培养为金标准;检测早期分泌抗原-6(early-secreted antigenic target 6,ESAT-6)的ELISPOT试验。 1.2 排除标准纳入对象合并可导致免疫力下降的疾病,如HIV/AIDS;病例数＜30例的研究;未设对照组的研究;结果中没有报告且通过计算不能得到四格表原始数据的研究。 1.3 文献检索及资料收集 1.3.1 检索词tuberculosis, latent, Mycobacterium tuberculosis, interferon-gamma, ELISPOT, T-cell response, ESAT6, interferon gamma assay, sensitivity, specificity,结核,潜伏,结核分枝杆菌,干扰素-γ,酶联免疫斑点试验,T细胞应答,早期分泌抗原-6,干扰素-γ释放试验,敏感性,特异性。 1.3.2 检索策略参考《The Bayes Library of Diagnostic Studies and Reviews》制定检索策略,检索词分目标疾病和诊断准确性指标两大部分,并根据具体数据库

酶联免疫斑点技术

酶联免疫斑点技术 摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。 关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术 随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。1.ELISPOT技术的发展史 1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。但该方法不够灵敏。另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。 1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。 1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。 2. ELISPOT技术的基本原理 2.2ELISPOT 检测原理.在细胞受到刺激后局部产生CK,该CK被特异性的单克隆抗体捕获。洗去分泌细胞后,被捕获的CK与生物素(Biotin) 标记的二抗结合,然后再与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase , AKP) 或辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP) 标记的链亲和素结合。经底物,如BCIP/ NBT孵育后, 在PVDF 孔板出现有色的斑点即表明细胞产生了CK。通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。 2.2ELISPOT技术原理.ELISPOT的技术原理与ELISA 基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感度,便于检测微量的抗原或抗体。其实验设计是在96 微孔培养板的底部披覆PVDF 薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含Sodium azide、内毒素Endotoxin) 的单克隆抗体。然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞(Peripheral blood mononu2clear cell ,PBMC) ) 分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌CK,此时局部(紧靠分泌细胞的周围) 分泌出的CK会被PVDF 薄膜上包被的特异性抗体捕获。洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。然后将未结合的酶洗除,再以AKP 或HRP 标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/ NBT) 使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。斑点多少可以在ELISPOT读数系

斑点杂交实验服务

斑点杂交实验服务 一、实验技术简介: 斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。【晶莱生物】 二、实验技术原理: 斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。 慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验， 蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、 核心期刊等服务。 三、实验操作流程： 1、DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 2、RNA斑点杂交 与上法类似、，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯0仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 3、完整细胞斑点杂交 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 四、实验注意事项： 客户提供： TotalRNA（DNA）≥20ug，浓度>1ug/ul，A260/A280>1.8；提供标记后的探针，需同时告知标记后探针的浓度及活性，待检测目的基因的Genbank 序列号。 交付标准： 1、图片

ELISA检测方法

ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。

②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。

原位杂交技术的操作详解及小贴士

原位杂交技术的操作详解及小贴士 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细

胞样本中不同RNA序列的多重检测。 原位杂交中探针的选择 DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。 就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。 Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization 原位杂交检测步骤 原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾