里氏木霉产酶菌株的选育研究_张秀江

实验一腐乳产蛋白酶菌株的筛选1

实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取

食用菌木霉的危害症状及防治方法

食用菌木霉的危害症状及防治方法 木霉俗称绿霉。属于真菌门，半知菌亚门。在自然界中分布极广，对各种食用菌的致病力强，不仅危害菌丝体生长阶段，也危害食用菌子实体，它是生产中发生最普遍、危害性最严重的杂菌之一，不论制种还是栽培，也不论生料、熟料、发酵料、发菌期间均可发生，甚至在出菇阶段也有发生，个别品种如草菇的菌种在完成发菌后亦可发生该种杂菌，并且发生的温度范围也越来越广，不少地区的银耳、香菇，近年的平菇、鸡腿菇等生产中曾发生毁灭性的污染，木霉就是主要杂菌之一。 危害症状木霉的主要生物特征为其菌丝成熟期很短，往往在一周内即可达到生理成熟，然后即生出绿色霉层，即其孢子层。当基料被侵染后，菌丝阶段不易察觉，直到出现霉层时才能引起注意；起初只是点状或斑块状，当条件合适或食用菌菌丝不很健壮时，很快发展为片状，直至污染整个菌袋或料床，若不及时采取措施，菇棚内短时间即可成一片绿色，其孢子飞扬，周边棚墙上也将附着大量木霉孢子，给以后的生产留下严重隐患。 发生规律木霉主要生存在朽木、枯枝落叶、土壤、有机肥、植物残体上和空气中。许多栽培的老菇房，带菌的菇具和场所是主要的初侵染源，已发病所产生的分生孢子，可多次重复侵染更为频繁。木霉发病率的高低与环境条件的关系较大，木霉孢子在15-30`C下萌发

率较高，菌丝体在4-42`C的温度下均能生长，在25-30`C生长最快。孢子在空气相对湿度95%的条件下，萌发最快，相对湿度低于85%较难萌发。因此，在高温、高湿、通气不良和培养料呈偏酸性时，很容易滋生木霉。木霉侵染寄主后，与寄主争夺养分和空间，同时还分泌毒素杀伤、杀死寄主，把寄主的菌丝缠绕、切断。 防治措施（1）制种或熟料栽培拌料时按比例加入1：1000倍疣霉净，并严格灭菌，以彻底杀死其孢子。 （2）科学调配基料组分，使营养全面、均衡，以保证食用菌菌丝的健康和抗性，可对霉菌形成拮抗或抑制。实践证明，生产中按比例加入天天菇耳壮即可。 （3）发酵栽培时，加入疣霉净后，基料仍要发酵均匀，尽可能多的杀死或抑制其孢子。 （4）接种操作要严格、规范，不使霉菌孢子落于料中。研究发现，接种时，开启食用菌接种净化机5min后再进行操作，生产效果与常规甲醛熏蒸相仿，并且，杜绝了甲醛对人体的刺激，避免了甲醛残留的可能。 （5）菌种或菌袋发菌以及出菇期间，每5天左右对菇棚空闲处

玉米芯酶法生产低聚木糖

玉米芯酶法生产低聚木糖 功能性低聚糖是日本七十年代研制八十年代开始工业化生产，并在保健食品中广泛使用的一类功能性食品添加剂。日本已投入工业化生产的低聚糖有10余种，总产量达4万多吨。我国从八十年代末开始对功能性低聚糖进行研究，低聚异麦芽糖和低聚果糖也相继投入了工业化生产。但是，我国投入工业化生产的功能性低聚糖的品种还比较少，还没有能耐酸、耐热和适合特殊人群如糖尿病、高血脂等患者食品要求的功能性低聚糖面市。 1、产品简介 与其它低聚糖相比低聚木糖具有以下特点：（1）有效用量少。低聚木糖是目前达到显著双歧杆菌增殖效果有效用量最少的功能性低聚糖。经试验: 每天口服0.7g, 两周后大肠双歧杆菌的比例从8.9%增加到 17.9%；每天口服1.4g, 一周后大肠双歧杆菌的比例从9%增加到33%。（2）耐酸和耐热。低聚木糖在pH2.5-8.0的范围内相当稳定, 100℃加热1小时, 几乎不分解。（3）普通纯度产品能应用于糖尿病和高血脂等患者的食品中。低聚木糖的伴随成分为木糖, 木糖也是不被消化的单糖,糖尿病和高血脂等患者可以食用。 2、生产技术 低聚木糖的生产原料为玉米芯、蔗渣、棉子壳等农副产物，其中玉米芯为最佳原料。玉米芯酶法生产低聚木糖生产流程如下。 原料（玉米芯）→木聚糖提取→提取液→精制→酶降解→

粗产品→精制→浓缩→低聚木糖产品。 该生产技术于2006年获得国家发明专利授权。专利号：CN200410013840.8。该专利于2009年获得江苏省专利金奖和中国专利优秀奖。 3、产品形式及得率 产品有70 糖浆、90糖浆、70 粉末、90 粉和35粉末等形式。这些产品已获准应用于各种饮料、巧克力、调味料（醋）等保健食品和一些功能饲料中。 每8吨玉米芯粒可制成1吨以上固形物为70％以上，低聚木糖含量为70％(对总糖)的糖浆产品。 4、投资 年产300吨低聚木糖生产线需生产厂房：2000-3000M2、蒸汽：5吨/小时、电力：200KW。设备投资1000万元。

高产蛋白酶菌株的选育.总结

课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法 武汉轻工大学食品学院王宏勋 一、课堂报告依据的知识背景 1、遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。 PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。

1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。 2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。 3、基因和性状 1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定——基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。

实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013

实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术

, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作

灵芝栽培中木霉的预防和治疗

灵芝栽培中木霉的预防和治疗 灵芝是一种名贵的中药材，近年来灵芝的生产发展很快，但在灵芝栽培中常因杂菌的污染造成不同程度的损失，其中绿色木霉是发生频率和危害程度最高的，在灵芝栽培的各个阶段均可发生。 灵芝是一种名贵的中药材，近年来灵芝的生产发展很快，但在灵芝栽培中常因杂菌的污染造成不同程度的损失，其中绿色木霉是发生频率和危害程度最高的，在灵芝栽培的各个阶段均可发生。绿色木霉广泛存在于自然界的各种有机物质和土壤中，还常以分生孢子的形式漂浮在空气中，它适应性强，特别是在营养丰富的基质上生长迅速，传播蔓延快，既可以和栽培的灵芝菌丝竞争养料，消耗养分，也可以分泌毒素破坏灵芝菌丝的细胞质，抑制灵芝菌丝的生长，严重影响着灵芝的产量和质量，是灵芝栽培中病害防治的重点。在近几年的栽培中我们采取了以预防为主、并辅助治疗的措施，取得了较好的效果。 1、选用抗杂性好、菌丝生长势强的灵芝品种。选用优质的灵芝品种是栽培成功的关键。抗病能力好、生长势强的品种不易被绿色木霉菌感染。 2、严格挑选栽培用种。所选菌种要求种性纯正，菌丝生活力强，菌丝洁白、浓密、健壮、菌龄适宜，防止菌种带入绿色木霉。 3、搞好栽培环境的清洁卫生。菇房内要清除菌渣、垃圾，彻底清洗栽培用架，并进行空间消毒，消灭杂菌隐匿场所，以减少传播媒介。搞好环境卫生对防止污染能起到事半功倍的效果。 4、严格选料。培养料要求新鲜、无霉变，用前要曝晒数天，培

养料配方要求合理，主料和辅料要充分拌匀，含水量控制在60%-70%左右，装量合适、松紧适度，装好后立即进行高压或常压灭菌，以防培养基的酸化。灭菌要求彻底。 5、接种中树立严格的无菌观念。由于空气中到处漂浮有绿色木霉的孢子，操作时不能因为肉眼看不见而麻痹大意，操作人员的双手、衣物和所用接种工具、材料须严格消毒，如选用接种室接种的操作人员应戴上帽子，以防头发上落有绿色木霉的孢子。接种动作要尽量快捷、熟练，防止接种过程中带入杂菌、杂菌孢子，对灭菌过程中破损的袋子用胶布封好，并在封口处用75%酒精消毒。 6、适当加大接种量，可使灵芝菌丝以绝对优势迅速占领地盘，减少杂菌的污染，起到以菇抑菌的作用。 7、保证培养室内具有适宜的小气候，把好菌丝培养关。控制25℃左右的温度、60%-70%的湿度，注意通风换气，严防高温高湿，创造灵芝菌丝生长的最适宜环境条件，促进灵芝菌丝快速生长，迅速占领整个料面。 8、认真抓好出芝阶段的培养管理工作。浙江一带灵芝栽培一般选在春季进行，出芝时正好是6、7月份的高温季节，子实体生长阶段由于需要较高的湿度，因此是防治绿色木霉污染的重要时期。灵芝原基长出后，要及时拔去棉塞或开袋，以免原基损坏而感染绿色木霉菌。做好保温保湿工作，同时加强通风和给予一定的光照，促使原基健康地长成子实体，子实体成熟后及时采摘。 9、加强早期防治。定期检查生长情况，一旦发现污染，应采取

赖氨酸高产菌株的选育

赖氨酸高产菌株的选育 摘要：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。　 关键词：赖氨酸，菌种选育，基因改造，高通量筛选　 Breeding of high-yielding lysine producers Abstract:L-lysine as an important amino acid for livestock has been increasing in demand, all traditional lysine producers have been created over many years by multiple rounds of random mutagenesis and selection. In recent decades, the development of recombinant DNA techniques and increased understanding of the biochemistry of metabolic reactions has enabled the identification of genetic targets for improved lysine production,and the successful optimization of a wild-type strain into a high-producing cell factory may serve as foundation to combine rational design of metabolic blueprints with targeted genetic engineering and integrated omics analysis for engineering microbial metabolism. Here, we describe the development of a genetically defined process of L-lysine hyperproducing by systems metabolic engineering of the wildtype and the method combining with high throughput screening (HTS) permits the efficient and rapid cloning of rarely transcribed differentially expressed genes. The experimental strategy virtually excludes the possibility of isolating false positive clones. Keywords: Lysine, Strain optimization, Genetic modification, High throughput screening L-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。随着L-赖氨酸的需求量急剧增加，L-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。

里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展_覃玲灵

综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2011年第5期 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展 覃玲灵 何钢 陈介南 (中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙410004) 摘 要: 随着纤维素在能源、材料及化工等领域的广泛开发和应用,里氏木霉作为一种重要的产纤维素酶工业用菌种,越来越受到人们的广泛关注。为了提高其酶活,人们做了大量的工作,获得了一些相当好的突变株。对里氏木霉及其突变株的基因组进行研究,有助于人们理解其高效产酶的机制,同时也有利于构建其基因工程菌。介绍里氏木霉T r ichoderma reesei 的背景及其部分高产纤维素酶突变株,并阐述近些年来对其突变株的基因组的研究进展。 关键词: 里氏木霉 纤维素酶 突变株 基因组 SNV Research Develop m ent of Trichoder ma reesei and Its Cell ulase Hyperproduction Strai ns Q in L i ng ling H e G ang Chen Jienan (Instit ute of B i o l og ic al an d Environ ment al Science&T echnology,Ce ntral South University of Forest ry and Tec hnology,Changsha 410004) Abstrac:t A s w i de l y deve lop m ent and utilization of ce llulose i n the fi e l d of energy ,m ate rials and chem istry i ndustry,T r ichoderma reesei has been caught m ore and m ore attenti on for its be i ng a k i nd of i m portant ce ll u l ase stra i n for i ndustry .Fo r enhanc i ng i ts cell u l ase product ,peop l e hav e done a lot of work on it ,and ob tained seve ra l cons i derably good mutant strai ns .T o learn the genom e o f T r ichoderma reesei and its mu tant strains is he l p f u l to us understand its syste m o f ce llulase hype rproduction ,also he l p f u l to people construct its g enet ic eng i neering stra i n i n the f uture .T h i s article i ntroduced t he background o f T richoderma reesei and part of its hyperce llulase product stra i ns ,a l so elabo rated the research deve l op m ent of its m utan t strains geno m e i n t he recent yea rs . K ey words : T richoderma reesei Cell u l ase M u tant stra i n G enom e SNV 收稿日期:2010 11 24 基金项目:国家林业局 948 项目(2006 4 123) 作者简介:覃玲灵,女,硕士研究生,研究方向:生物质能源;E m ai:l canaceili ng @163.co m 通讯作者:何钢,男,教授,从事生物技术教学和科研;E m a i :l hegong262@yahoo .co https://www.wendangku.net/doc/2a6027343.html, 1 背景 随着人口不断增长,以及现有的煤、天然气和石 油存储量的减少,发展新能源成为实现经济社会可持续发展的必经之路。以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质收集并且存储了大量太阳能,是一种重要的能源和物质资源[1] 。地球上最主要的生物质来自绿色植物,每年光合作用的生物质净产量约为1800亿t [2] 。生物质中含量最多的是纤维素,其由成百上千个葡萄糖分子聚合而成,是地球上存在最丰富的有机大分子,储量约为850亿t [3] ;其次是半纤维素,储量约为500亿;t 第三类是木质素,由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成,约 占20%,即350亿t [4] 。这些生物质大多以农业和林业废弃物的形式存在,并且每年都在大量积累,这不仅会导致环境的恶化,而且会导致这种可利用资源的流失[1] 。因此如何充分利用这些资源成为迫 在眉睫的问题,在对生物质的开发利用中,一个重要瓶颈就是如何高效利用微生物进行酶催化水解将生物质降解为单糖[5] 。 自然界中能降解和利用纤维素的微生物种类很多,许多细菌可分解纤维素,而且产生的纤维素酶具有高度专一性,但是它们生长速度慢,需要厌氧的生长条件[6],这些都限制了其应用。真菌所产生的纤维素酶多是胞外酶,便于分离和提取,且

产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离

实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃

绿色木霉

绿色木霉 木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。 绿色木霉（Trichoderma viride）在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。在植物病理生物防治中具有重要的作用 绿色木霉是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好，绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性病害。 使用方法 可直接加入腐熟剂、有机肥料、生物菌剂等肥料中，在分解纤维、病理防治中有重要作用。 1.1 形态学特征木霉的菌落生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝，厚垣孢子有或无。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称或互生分枝，形成二级和三级分枝，分枝角度为锐角或近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端。 1.2 生态学特性 1.2.1 生长发育的物理条件 1.2.1.1 温、湿度生长适温为20－28℃，在6℃或32℃仍生长良好，它是一种嗜温真菌，在37℃条件下能生长，但在48℃条件下不能生长；木霉的生长要求较高湿度，其营养生长的相对湿度要求92%以上，孢子的形成需要93%－95%，因而木霉在潮湿土壤中的生命力较干性土壤中强。 1.2.1.2 光照若光照以对数比例增强可以促进分生孢子的产生，有研究发现380nm和440nm波长的光诱导力最强，而254nm和1100nm以外波长的光不可能诱导繁殖体的产生。木霉经日光处理3min或经紫外线光处理10-30s诱导产孢的效果更好。 1.2.1.3 pH值和CO2木霉的最适生长pH值为5－5.5，在pH值为1.5或9.0的培养基上也可能生长，但酸性条件比碱性条件下的萌发率更高。CO2对木霉生长的影响取决于CO2的浓度和培养基的pH值，在碱性基质中，高浓度的CO2有利于木霉菌的生长。 1.2.2 营养条件 1.2.2.1 碳源木霉菌株能够利用多种有机物作为碳源，较理想的是单糖、双糖、多糖、嘌呤、嘧啶和氨基酸等。绿色木霉在富含碳水化合物的培养基上大量产生酸类，用葡萄糖或淀粉作为碳源，该菌产生60%－80%的柠檬酸（理论上推算）。 1.2.2.2 氮源在缓冲介质中，铵是木霉菌最易利用的氮源，其他氮源如氨基酸、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐也能维持其正常生长。以天冬门素为氮源生长特别好，含氮量低，会促进孢子形成，对高浓度硝酸盐的负影响由于硫酸镁的存在可以得到补偿。 1.2.2.3 无机盐及微量元素无机盐对木霉的生长很重要，对绿色木霉来说，镁离子能促进其生长，铜离子能促进分生孢子色素形成，铁离子对孢子的形成也很重要。

高产胞外蛋白酶正文

高产胞外蛋白酶菌株的选育生命科学学院生物科学0901班王亚云 2009044020119 摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；诱变；鉴定 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基： 1.1. 2.1 筛选培养基： 酪素培养基 1.1. 2.2营养培养基： 肉汤培养基 1.1. 2.3鉴别性培养基 （1）淀粉培养基 （2）明胶培养基

（3）葡萄糖发酵培养基 （4）葡萄糖蛋白胨培养基 乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。 1.2 方法 1.2.1 菌种的筛选 1.2.1.1 培养基的配置及灭菌 按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。 1.2.1.2 涂布分离 称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化 观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。 将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备 在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep 管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变

产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化

陇东大学 学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 生命科学与技术学院 08生物技术班 作者： 指导教师： 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍

(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

柠檬酸高产菌株选育

柠檬酸高产菌株的选育 222011********* 刘亚超 2011级生物技术 关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵 摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。 引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌种 以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。 1.1.2培养基 分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。 1.1.3 试剂及仪器 3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离纯化 用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。 1.2.2 初筛 用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。取各个不

碱性蛋白酶菌株的分离鉴定

产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定 摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。 关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定 Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing Strains Wensi Hou (Yanshan university , Liren college , Hebei 066004) Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect. Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification 1．碱性蛋白酶 1.1简介 碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 1.2碱性蛋白酶的理化性质 微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60℃以下。 碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活性基团,因此,一些金属离子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)

实验十一 产蛋白酶菌株的筛选

实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一基本原理 ?自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白 水解圈。 ?水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 ?碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 ?原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化 合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。 二实验目的 ?学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 ?学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 ?掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三实验器材 1 菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四操作步骤 1 培养基和试剂的配制 （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml 水中，二液等量混合。 （4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH 缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。 2 酶活标准曲线的制作 用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。 3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株