外泌体研究概述Exosome
细胞外泌体提取方法
外泌体提取详细步骤及方法 1、差速离心 差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤，包括低速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉淀外泌体： 300×g离心10分钟，取上清。 2000×g离心10分钟，取上清。 10，000×g离心30分钟，取上清。100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。 2、密度梯度离心 该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 3、尺寸排阻色谱 尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。 4、过滤 超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。 5、基于聚合物的沉淀技术 基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用
外泌体最新研究进展 成像流式的新发现
外泌体最新研究进展成像流式的新发现 外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。免疫细胞和肿瘤细胞之间通过外泌体进行信息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用。外泌体既可以通过抑制免疫细胞（DCs、NK细胞、CD4+和CD8+ T细胞等）引发的抗肿瘤反应，以及诱导免疫抑制或调节细胞群（MDSCs、Tregs和Bregs）的免疫抑制。 外泌体产生过程的示意图： Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles Emanuele Cocucci and Jacopo Meldolesi, Trends in Cell Biology, June 2015. V ol. 25. No.6 过去研究外泌体的主要工具包括Nanosight、Apogee、confocal和传统流式细胞仪。这几种工具各有优点，也都具有其局限性，如Nanosight、Apogee和传统流式细胞仪只能检测外泌体颗粒，测量外泌体的浓度，对外泌体进行定量。无法研究细胞与外泌体的相互作用以及外泌体功能；confocal可以拍摄到细胞分泌和吞噬外泌体，但是因为缺乏合适的量化参数，无法对吞噬过程进行量化分析，也无法定量产生的外泌体。而且confocal的通量太低，结果也可能存在人为偏倚性而不够客观。Amnis量化成像流式细胞分析技术，很好地解决了上述研究手段存在的问题，是目前为止研究外泌体产生机理及外泌体功能的最佳方法。Amnis能够同时采集12个检测通道中的细胞和颗粒物图像，其中包括明场、暗场，以及10个荧光通道。Amnis每个检测通道都有100余种量化参数，如面积、直径、长度、厚度、细胞短轴与长轴比值、荧光强度等等，这些参数可以提供传统流式和显微成像设备都不具备的量化统计学功能，获得全新的细胞或颗粒物量化统计学数据。Amnis采用最先进的用于航空遥拍的TDI CCD（Time Delay Integrated CCD）收集荧光信号，可以采集到液流中快速移动的细胞和小颗粒物的清晰图像，对数万乃至数以十万的细胞或小颗粒物的荧光信号进行量化分析。Amnis既具有显微成像的功能，可以呈现细胞和小颗粒物的细节，又具有对海量数据进行快速分析的
外泌体捕获分离
外泌体，带来革命变革的小不点（三）——外泌体捕获分离 外泌体天然存在于体液中，在包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中广泛分布，而且，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；但是，想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。今天，小优专题给您带来的就是外泌体研究的最关键步骤——外泌体捕获与分离这一部分的技术讲解与解决方案。 外泌体分离的传统方法为差速超速离心法和密度梯度超速离心法等，差速超速离心法是目前外泌体提取最常用的方法。简单来说是将细胞培养液或体液等样本依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，质量不好，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。另一种常用的外泌体分离方法为密度梯度离心法，将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16 h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18 g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。而且，这两种传统方法都需要用到超速离心机，设备昂贵，耗时长，一次最多只能做6个样品，效率低，并且需要大量的样品才能得到足够多的外泌体。 接下来小优就为您带来优宁维为您提供的高效外泌体捕获与分离技术，帮您远离枯燥乏味的超速离心，快速高效制备高质量的外泌体。话不多说，亮技术，上产品：首先闪亮登场的是简单的一步法分离外泌体，实验原理如下图： 一步法分离外泌体原理示意图 该技术的优势有节省时间，小体积样本适用（可从100 μl血浆中分离出足量外泌体），无需超速离心和其他预富集方式，试剂方便储存于运输（4℃保存）等。 除了一步法分离外泌体的技术外，小优还为您提供免疫捕获法，包括免疫微球产品与免疫预制板产品。首先我们来看免疫微球捕获分离外泌体的技术原理：
外泌体蛋白质组学研究进展_图文(精)
临床检验杂志2016年12月第34卷第12期Chin J Clin Lab Sci,Dec.2016,V01.34,No.12 DOI:10.13602/https://www.wendangku.net/doc/3a9300577.html,ki.jcls.2016.12.11 外泌体蛋白质组学研究进展宰 ?927??综述? 覃思华,郑磊(南方医科大学南方医院检验科,广州510515 摘要:外泌体(exosome是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡。可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白质和脂质等。大多数外泌体有特殊的功能,可能与细胞信号转导功能相关。现已发现外泌体参与疾病进展、肿瘤血管生成、免疫监视等多个环节。外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。该文总结外泌体蛋白质组学的研究思路及方法, 综述目前外泌体蛋白质的临床作用,并对外泌体蛋白质组学研究面临的挑战和前景进行分析与评述。 关键词:外泌体;蛋白质组学;疾病 中图分类号:R446文献标志码:A 20世纪80年代,Johnstone等¨1发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白,并首次将这种囊泡亚型命名为exosome(即外泌体。外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能,激活细胞信号通路,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。而其中蛋白质差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点,是研究外泌体起源的重要途径旧J。与核酸相比,外泌体蛋白质的差异表达更难被检测出来,并且常规的分离方法极易携带蛋白质污染,是外泌体蛋白质组学研究主要面临的难题,也限制了蛋白质研究的发展。但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋白质的研究将具有巨大的前景。 1外泌体及其结构功能
外泌体是细胞进化过程中内出芽形成的多泡体释放的一类直径为30~100am的脂质双层膜的小囊泡,可由各种类型的细胞分泌,也可在各种体液中分离出来,包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液等。外泌体携带着大量的细胞特异的生物活性分子,如核酸、蛋白质、脂类和糖类等,这些物质经过亲代细胞选择和特殊包装而进入外泌体,是激发信号转导机制的关键,在机体很多生理病理过程中发挥重要的作用,如免疫调节[3J、动脉粥样硬化H o、肿瘤药物抵抗垆1、抗病毒㈣等。 外泌体起源于胞内体途径。细胞内吞的囊泡被分类并到达溶酶体和细胞膜。瑚J。早期核内体与细胞内吞的囊泡融合,将囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收,成为再生的早期核内体。这些核内体经历一系列转化后成为晚期核内体。在此转化过程中,晚期核内体逐渐形成多泡小体(mul-tivesicular bodies,MVBs,而其中30~100nln的囊泡从多泡小体的管腔出芽一J。多泡小体可以与溶酶体融合,参与溶酶体途径,或参与分泌途径,与质膜融合¨1。溶酶体途径将导致内容物降解,而分泌途径中形成外泌体释放到细胞外微环境。以上一系列从核内体复合物到外泌体的形成过程需要内体分选转运蛋白复合物(ESCRT和其他相关蛋白质如 Alix[7]。外泌体是由胞外分泌产生的,不同的脂质与脂质相关的酶也控制着外泌体的分泌过程¨…。也有的理论强调胞质蛋白半乳凝集素5(galectin-5参与了核内体和外泌体的释放¨1。,所以蛋白质对于外泌体的产生和发挥生理功能都有着重要作用¨“。 目前的研究常以外泌体蛋白在细胞中的定位进行分类。外泌体中细胞质蛋白最丰富,在体液中可达47%,在细胞上清中为43%,其次是膜蛋白(体液和细胞上清中分别为28%和34%,核酸和线粒体蛋白则较低,大部分的膜蛋白和细胞质蛋白在外泌体中较保守,这在不同来源的外泌体中均已被证实¨3|。另一种分类方法主要将蛋白质分为两大类。一类是非特异性蛋白质,大部分是来源于亲代细胞中保守区域的细胞质和膜蛋白,如细胞骨架蛋白[肌动蛋白(actins、微管蛋白(tubulins、埃兹蛋白(ezrin、膜突蛋白(moesin],新陈代谢相关的酶[磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH、烯醇化酶1 (enolase 1、磷酸甘油酸激酶1(PGKl、丙酮酸激酶2 (PKM2],核糖体蛋白,跨膜蛋白[多聚免疫球蛋白受体 (PIGR、溶酶体相关膜蛋白1(LAMPl、CD59],膜联蛋白(annexins,热休克蛋白,粘附蛋白[整合素(integrin8、乳腺肪球因子8(MFGE8]等,这些
外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取 上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。 2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小 时而不进行抗凝。此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。 3、 为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。 外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机 50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表 3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1） 注意：所有离心均应在4℃下进行。 1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g，4℃下离心30分钟。 2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。在12,000×g，4℃下离心45分钟。 3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时。 4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。 5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。 6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储存长达1年。
外泌体在糖尿病中的研究进展
366 中国医药生物技术2019年8月第14卷第4期Chin Med Biotechnol, August 2019, V ol. 14, No. 4 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.014· 综述·外泌体在糖尿病中的研究进展 王丽萍，冯尚勇，余果，宋斌，陈晖，张真稳，闫彩凤，潘云龙 糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由遗传因素和环境因素共同导致的一类代谢性疾病[1]。由于糖尿病的高发性和严重性，在世界范围内，糖尿病及其各种并发症已成为威胁人类健康的第三大杀手[2]。近年来，随着生活方式的改变和人口老龄化的加剧，我国糖尿病的发病率逐年增加，目前我国糖尿病的患病率已达总人口的9.7%[3]，因此早期诊断并给予有效治疗对于延长糖尿病患者生存期和提高生活质量至关重要。外泌体是由多种细胞在生理病理情况下经过“内吞-融合-外排”等调控过程所分泌的大小均一、直径30 ~ 100 nm的双层膜包裹的球状或杯状囊泡。外泌体可携带多种信号分子和生物活性物质并参与机体免疫、细胞间通信、细胞增殖、细胞迁移、细胞分化以及代谢性疾病的发生发展过程[4]。本文主要对外泌体的生物学特性和功能以及在糖尿病及并发症中的研究进展进行总结综述，旨在为糖尿病的诊治提供新思路。 1 外泌体的基本概念 1983年，外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中[5]，以细胞管腔内囊泡的形式存在。外泌体密度为1.10 ~ 1.18 g/ml，电镜下呈扁形、球形或杯状，在体液中主要呈球形结构。外泌体是细胞内吞过程的末端产物，细胞的胞吞形成带有外源性抗体的内体小泡（intraluminal vesicls，ILVs），在高尔基体等细胞器的作用下形成早期核内体（early endosomes，EEs）。EEs 的囊膜不断内陷，并选择性地接受细胞内的蛋白质、核酸、脂类等生物活性成分，最终形成晚期核内体（late endosomes，LEs）。LEs 与细胞膜融合，将外泌体释放至胞外环境[6-7]。外泌体中携带丰富的蛋白质，一种为普遍存在的蛋白成分，主要包括肌动蛋白、微管蛋白、热休克蛋白等细胞骨架蛋白，Rab、Alix、Flotillin 和TSG101 等膜转运蛋白和融合蛋白，以及CD9、CD81、CD63 等内体转运相关的四跨膜蛋白等[8]；另一种为具有细胞特异性的蛋白成分，如CD3 分子由T 细胞来源的外泌体所携带[9]，血小板来源的外泌体含有特异性的血友病因子和整合蛋白CD41a[10]，神经元分泌的外泌体含有谷氨酸受体[11]等。此外，外泌体携带的DNA、mRNAs、miRNAs、lncRNAs 等核酸分子与受体结合从而介导胞内信号调控，改变细胞功能。外泌体可通过与邻近细胞的胞膜发生融合，或通过转运蛋白质、脂质等直接激活靶细胞，使靶细胞发生一系列生物学效应。2 外泌体与糖尿病 2.1 外泌体与 1 型糖尿病 1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种特殊的自体免疫性疾病，主要诱因包括遗传因素、外源性感染性病原体、非感染性环境因子、内源性抗原和生理应激等。T1DM 的潜在自体免疫过程一般发生在临床糖尿病发病前，正是这种无症状期为疾病的预测和预防提供了绝佳的机会。外泌体在T1DM 胰岛的自体免疫反应中起着非常重要的作用[12]。研究发现，抗原递呈细胞（APC）来源的外泌体含有大量的主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）分子，可以激活T 淋巴细胞产生免疫应答，进一步激活 B 淋巴细胞启动体液免疫，两者共同作用并高度特异性地对胰岛 B 细胞产生自体免疫性攻击，导致β 细胞减少，最终因胰岛素分泌不足而引起血糖升高及糖尿病[13-14]。 外泌体转运可作为多种疾病及并发症的生物标记物，包括T1DM[15]、肾病[16]或视网膜疾病[17]等。Garcia-Contreras 等[18]对12 例T1DM 组和12 例对照组患者血浆样本进行外泌体miRNA 芯片检测，结果显示有7 个miRNAs 在两组中存在显著差异，其中上调的为miR-16-5p、miR-302d-3p、miR-378e、miR-570-3p、miR-574-5p、miR-579；下调的为miR-25-3p。通过RT-qPCR 验证，对照组miR-16-5p 和miR-574-5p 明显高于T1DM 组（P < 0.05，P < 0.01）。该研究首次揭示，从患者血浆外泌体中分离出的miRNA 有望作为T1DM 诊断的潜在生物标记物。相比于传统生物标记物，外泌体具有独特优势，原因包括：①采集方便，可以很容易地从血液、尿液、唾液、腹水等多种体液中提取；②相对稳定，可以长期储存在–80 ℃；③敏感性高，可提供蛋白酶/核酸酶控制环境，提高分子稳定性； ④有利于分离粒子的特殊分子浓度；⑤特异性高，可以使用特定的抗细胞表面标记抗体进行分离，然后对特定的转运蛋白/RNAs4 进行分析，这些特征使其在临床诊断应用中更具吸引力。 2.2 外泌体与 2 型糖尿病 随着人类生活水平的提高，2 型糖尿病（type 2 diabetes 基金项目：国家人类遗传资源共享服务平台项目（2005DKA21300）；江苏省自然科学基金（BK20161323） 作者单位：225001 江苏，扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院生物样本库（王丽萍），内分泌科（冯尚勇、宋斌、陈晖、张真稳、闫彩凤、潘云龙），药物临床试验机构（余果） 通信作者：潘云龙，Email：NJPHWLP@https://www.wendangku.net/doc/3a9300577.html, 收稿日期：2019-05-09
外泌体及其蛋白质组学研究文献解读
外泌体及其蛋白质组学研究文献解读 外泌体是什么鬼？连这都不知道，就真的out啦 外泌体（Exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-200 nm。外泌体存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，不同组织来源的外泌体在内容物组成和功能方面存在差异，这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。对外泌体的分析和检测可以辅助疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析。 外泌体都有哪些分离提取方法，喏，都给你打包整理好啦 对于外泌体研究，分离和收集外泌体是非常关键的一步。目前对于外泌体收集有：超高速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀等几种主要方法，各种方法均存在不同优缺点。 表1 各种分离方法优缺点比较 但是嘞，大牛们的CNS文章大多用的都是超速离心的方法，不信你看：表2 CNS文章外泌体提取方法之——惊鸿一瞥
怎么知道提取的外泌体合不合格？ 鉴定外泌体提取合格与否有三大法宝：电镜、NTA粒径、Western blot检测 目前外泌体的分离提取还没有到达炉火纯青的地步，几乎没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。所以提取的外泌体需要通过三大法宝来相互佐证：形态学鉴定
（电子显微镜技术）、NTA粒径分析以及Western blot检测标志蛋白（常用的有CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等）。电镜可以观察样品中是否有与外泌体相似的经典结构，有经典结构说明样品中有外泌体或者与外泌体类似的，如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构。WB检测发现样品中具有外泌体的标志物，可以一定程度上排除溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况，但依旧不知道样品的整体情况。因为电镜和WB的连用只能证明样品中有外泌体，但是有多少、纯度等就不得而知了。所以这个时候需要再来一个NTA实验，NTA粒径分析可以反应外泌体样品中粒子的群体特征，以达到跟电镜和WB相辅相成的作用。 图1 Characterization of C666‐1, NP69 and NP460 exosomes. （引自Chan, Yuk‐Kit, Zhang H, Liu P, et al. Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins[J]. International Journal of Cancer, 2015, 137(8):1830-1841.） 外泌体蛋白质组学研究，有啥好期待的嘞： 外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能，激活细胞信号通路，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。而其中蛋白质的差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点，是研究外泌体起源的重要途径。蛋白质组学已经逐渐成为研究各种亚细胞组分蛋白质组的重要工具。针对外泌体进行蛋白质组学研究，可以揭示疾病发病机制、寻找疾病诊断和预后的生物标志物、筛选疾病治疗靶点等。
外泌体的生物特点及在肿瘤诊断中的应用
外泌体的生物特性及在肿瘤临床诊断中的应用 陈利鹏 摘要：外泌体是生物体内广泛存在的由各类细胞释放的囊泡小体，被磷脂双分子层包裹。 里面含有蛋白和RNA等多种成分，在细胞间信息传递中扮演重要角色。具有抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能。在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，特别是有携带肿瘤遗传信息、调节肿瘤微环境、促进肿瘤血管生成等效应。越来越多的研究将目光投向了利用外泌体进行疾病的诊断、预后及治疗临床应用。本文就其研究现状和在肿瘤临床诊断中的应用做简要综述。 关键词：外泌体，肿瘤，诊断，临床应用 1 外泌体简介 外泌体（exosome）是细胞向外分泌的一种囊状小泡，直径大约40-140 nm。具有脂质双层膜结构[1]。Johnstone在网织红细胞培养液中分离得到一种囊泡状的结构物质，并将其命名为外泌体（exosome）[2]。但当时研究人员认为它只是一种细胞的废弃物。 最近几年研究发现，外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生和进程密切相关。2013年，诺贝尔生理或医学奖颁发给了外泌体领域的三位科学家，使得外泌体成为医学领域研究的热点。目前外泌体研究主要集中在细胞通讯介导细胞行为、生物标志物筛选、药物载体研发三大方向[3]。 1.1外泌体的形成 真核细胞和原核细胞都能分泌细胞外小囊泡（extracellular vesicles，EVs）。在哺乳动物中，血液、淋巴液、组织液、尿液都能分离到EVs[4]。细胞向外分泌的膜性小囊泡有多种，包括微泡（microvesicle）、凋亡小体和外泌体。微泡是细胞胞体直接出芽，脱落后形成的细胞外囊泡，直径约50-1000 nm。凋亡小体则是细胞凋亡时产生的囊泡，一般直径在500-2000 nm。外泌体是通过细胞内体途径生成，首先是细胞内内溶酶体微粒体内陷，形成多囊泡小体（multi-vesicle body ，MVBs），在刺激作用下，多囊泡小体与细胞膜融合，然后将小体内的囊泡释放到细胞外，即为外泌体。外泌体大小均一，直径一般在40-140 nm[5]。
外泌体在肺结核中的研究进展
志,２０１１,８(２):１４７Ｇ１４９． [２３]俞小飞,徐燕,张梦．妊娠高血压患者与DＧ二聚体二维生素B１２二血清同型半胱氨酸的关系[J]．医学检验与临床,２０１５,２６(４):６１Ｇ６２,２４． [２４]郭跃丽,奚经巧,孔万仲,等．妊娠期H c y和凝血相关指标与胎儿生长发育的临床研究[J]．中国妇幼健康研究, ２０１６,２７(２):２１０Ｇ２１３． [２５]黄华,梁红梅,罗奇智,等．孕妇血清同型半胱氨酸二叶酸二维生素B１２水平与妊娠高血压综合征关系探讨[J]．国际 检验医学杂志,２０１４,３５(２１):２８６９Ｇ２８７１． (收稿日期:２０１７Ｇ１０Ｇ２４一修回日期:２０１８Ｇ０１Ｇ０５) 综一一述 外泌体在肺结核中的研究进展? 李志强１综述,张俊爱２?审校 (１．广东医科大学医学检验学院,东莞５２３８０８;２．广东医科大学广东省分子诊断重点实验室,东莞５２３８０８)一一摘一要:目的一外泌体可由几乎所有类型细胞产生并释放,其被发现存在于多种体液中,包括血液二尿液二唾液二胸腔积液和支气管肺泡灌洗液(B A L F)等.外泌体含有的组分在不同生理病理条件下不同,外泌体在调节细胞功能及疾病发生中扮演重要角色.外泌体在细菌组分传播中起重要作用.本文阐述了外泌体的研究背景二外泌体的形成和分泌二外泌体与结核分枝杆菌(MT B)的相互作用.旨在为结核疫苗和诊断靶标的研究提供新的思路. 关键词:外泌体;一结核分枝杆菌;一巨噬细胞;一疫苗;一诊断 D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．０９．０２５中图法分类号:R５２９．３ 文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)０９Ｇ１１０７Ｇ０６文献标识码:A 一一外泌体是释放到细胞外的直径为４０~１００n m膜性胞外囊泡(E V s),可运载多种蛋白质二脂质及核酸,是一种重要的细胞间信息传递载体[１].结核分枝杆菌(MT B)是肺结核的主要病原菌,作为一种兼性胞内寄生菌,通过感染巨噬细胞为自身创造适宜繁殖环境.MT B在感染后期能诱导宿主细胞死亡以促进胞内M B T外排,也可通过坏死的感染细胞碎片或凋亡小体的释放将致病成分散布到胞外环境.这些外泌体不仅携带各种病原体相关分子模式(P AM P s),还包含T二B细胞抗原蛋白,核酸和病原体相关毒素.根据产生机制不同[２],胞外囊泡分为３类:外泌体二微囊泡和凋亡小体.根据国际外泌体协会建议,文献中所认为的外泌体往往是各种囊泡的混合物,以往多数研究中囊泡纯度并无严格明确,囊泡群中可能包含外泌体,微囊泡甚至细菌胞外囊泡,因此,本文采用 外泌体 一词包括其他类型来源胞外囊泡.本文阐述了MT B感染细胞来源外泌体的免疫调节作用,及其作为结核疫苗和诊断靶标的新思路. １一外泌体的研究背景 一一 外泌体 一词最初由J O H N S T O N E等[３]在研究网织红细胞成熟过程中囊泡形成时提出.R A P O S O 等[４]发现E B病毒转化人B淋巴细胞源囊泡表面表达主要相容性复合体,具有激活免疫系统作用,与红细胞外泌体形成和释放途径相似,这极大激起研究者对外泌体免疫调节作用的研究热情.定义外泌体在免疫应答中的作用的相关研究大多数在自身免疫和癌症生物学背景下进行,而阐述外泌体对感染性疾病如肺结核感染的免疫作用的研究少之又少.在对鸟分枝杆菌的研究中,B E A T T Y等[５]观察到鸟分枝杆菌感染过程中相关P AM P s如脂阿拉伯甘露糖(L AM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(P I M)从吞噬小体被转运至 多囊体并释放到胞外,可在相邻未感染细胞检测到这些P AM P s.观察到鸟分枝杆菌二卡介苗或MT B感染巨噬细胞释放的囊泡含有L AM二糖肽脂和相对分子质量为１９?１０３的脂蛋白等MT B组分,流式细胞术检测发现囊泡释放量与多种内体标志物(包括L AM P１二L AM P２二MH CⅠ二Ⅱ和４次跨膜蛋白C D８１)的数量呈正相关[６Ｇ７].这些具有晚期内体标志物的囊泡通过钙依赖性胞吐释放到胞外,暗示这些囊泡属于外泌体[８].P R A D O SＧR O S A L E S等[９]发现MT B可释放带有菌体成分的胞外囊泡,可引起T o l l样受体(T L R)依赖性免疫应答.研究发现,感染细胞分泌的胞外囊泡中含有脂聚糖与脂蛋白标记的MT B胞外囊泡和C D９二C D６３标记的宿主源性外泌体,但有部分细菌组分掺入宿主外泌体,提示外泌体可作为MT B胞外囊泡运输的次要途径[１０].MT B感染细胞释放的胞 ７０１１ 国际检验医学杂志２０１８年５月第３９卷第９期一I n t J L a bM e d,M a y２０１８,V o l．３９,N o．９ ?基金项目:广东省医学科学基金项目(A２０１６６０６３二A２０１８４３４７);广东医学院面上培育项目(M２０１５０２１);广东医学院大学生创新实验项目(２０１６Z Z D C００３二２０１６Z Y D G００２);国家大学生创新创业训练项目(２０１６１０５７１０１９). ?一通信作者,EＧm a i l:z h a n g j u n a i＠g d m u．e d u．c n. 一一本文引用格式:李志强,张俊爱．外泌体在肺结核中的研究进展[J]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(９):１１０７Ｇ１１１２．
干细胞源外泌体在治疗心肌梗死中的作用机制研究进展_李玲
综 述 干细胞源外泌体在治疗心肌梗死中的作用机制 研究进展 李 玲综述，石 蓓审校 ［摘要］干细胞移植为心肌梗死后受损心肌的修复带来曙光， 然而移植的干细胞群在缺血缺氧环境中的存活率、有效性及相关作用机制仍备受争议。近年来，干细胞旁分泌效应对心肌细胞的保护作用逐渐受到重视。外泌体作为干细胞旁分泌效应的典型代表，是在不同应激反应中所产生的直径介于30 100nm 的膜状小体，富含大量与其母体干细胞相关的miＲNA ，mＲNA 及蛋白质，作为一种新型替代疗法在治疗心血管疾病中具备巨大潜力。不同干细胞来源的外泌体可通过促进受体细胞存活、增殖及血管生成等多种方式改善心梗后心脏功能。文中主要针对不同干细胞来源的外泌体在心肌梗死后通过促进心肌细胞存活、增殖及新生血管形成；抑制炎症反应及心脏纤维化等方式修复受损心肌的潜在机制进行综述。 ［关键词］外泌体；干细胞移植；心肌梗死；microＲNA ［中图分类号］Ｒ542．2 ［文献标志码］A ［文章编号］1008-8199（2016）09-0987-06［DOI ］10．16571/j．cnki．1008-8199．2016．09．021 基金项目：国家自然科学基金（81560041） 作者单位：563003遵义，遵义医学院附属医院心血管内科［李 玲 （医学硕士研究生）、石 蓓］ 通讯作者：石 蓓， E －mail ：shibei2147@163．com Advances in Ｒesearch on Stem cell-derived exosomes in Ischemic heart disease LI Ling reviewing ，SHI Bei checking （Deparment of Cardiology ，the First Affiliated Hospital ，Zunyi Medical College ，Zunyi 563003，Guizhou ，China ） ［Abstract ］Stem cell therapy provides immense hope for restoring the impaired cardiomyocytes．However ，it has been debated on the effectiveness ，mechanisms ，and survival of the donated cell population in the ischemic myocardial milieu．Protective paracrine effect of stem cells on cardiomyocytes gradually arose great attentions．Exosomes ，as typical representative of paracrine effect of stem cells ，are 30－100nm in size and tiny microvesicles released by cells in response to different physiological states ，and enriched in pro-teins ，messenger ＲNAs ，and miＲs characteristic of parental stem cells ，represent great potential for treating cardiovascular diseases．Ｒecent studies show that exosomes from different kinds of stem cells can effectively promote cardiac function by means of promoting the donated cell survival ，proliferation and angiogenesis in the ischemia heart．The aim of this review is to summarize current research ef-forts on exosomes from different kinds of stem cells ，including their potential mechanism to develop a potentially viable therapy for the treatment of impaired cardiomyocytes via promoting cardiomyocytes survival ，proliferation and angiogenesis ；inhibiting inflammatory re-sponse and cardiac fibrosis after myocardial infarction． ［Key words ］Exosomes ；Stem cell tansplantion ；Myocardial infarction ；microＲNA 0引言 冠状动脉疾病是最常见的心血管病症，其中，心肌梗死的发病率和死亡率位居全球首位。目前，干细胞移植治疗心肌梗死被认为是修复受损心肌，促进心肌细胞再生最具前景的方法 ［1］ 。胚胎干细 胞、诱导多能干细胞、骨髓源干细胞/祖细胞（如间 充质干细胞、内皮祖细胞、单个核细胞、CD34+ 细胞、CD133+细胞）和心脏干细胞等均具备向心脏系细胞分化的潜能。其中， c-kit +心脏干细胞（cardiac stem cells ，CSCs ）因其具有与心脏细胞相似的遗传背景；
如何分离纯化、鉴定外泌体(借鉴材料)
如何分离纯化、鉴定外泌体 外泌体相关研究逐渐从小众走向大众，受到越来越多的关注，涌现了一大批的外泌体课题。但大家还是感觉外泌体研究好难啊！为什么呢？首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。 一、分离 超速离心法: 超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。据不完全统计，约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。该方法由几个离心步骤组成，可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，沉淀外泌体（如图所示）。但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低，且重复离心操作有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。 如将超速离心配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体，是公认可以得到最高纯度的分离方法。但此法对离心时间非常敏感，一般需要8-30h，产率较低，同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离，因此难以广泛普及。 聚合物沉淀法: 第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了，最常见的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心，沉淀外泌体（如图所示）。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒，比如图中的ExoQuick?（System Biosciences）。这类试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备，且随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。不过大家不用担心，一般来说这些物质不会干扰下游分析，使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。
二、鉴定 外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。如果大家看过外泌体研究相关的文献，就肯定对一张图印象深刻。 不错，想发外泌体文章，光找到高效率的分离方法还不够，要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。鉴定方式不外乎就是下面这三种：1. 形态学（电镜）；2. 粒子大小（径粒分析）；以及3. 标志蛋白（WB）。综合来说，透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等，属于鉴定方法中的金标准，其他两种方式则常常作为辅助使用。
外泌体对组织修复的作用及其机制研究
目录 中文摘要.......................................................................................V ABSTRACT.................................................................................VII 缩略词表.......................................................................................IX 第一章绪论 (1) 第二章SMSC-Exos预防骨坏死的作用及机制研究 (4) 2.1 前言 (4) 2.2 材料和方法 (5) 2.2.1 实验动物 (5) 2.2.2 主要试剂 (5) 2.2.3 主要实验溶液配制 (7) 2.2.4 主要实验仪器 (7) 2.2.5 SMSCs和BMSCs的分离培养和鉴定 (8) 2.2.5.1 SMSCs的分离培养 2.2.5.2 BMSCs的分离培养 2.2.5.3 SMSCs的鉴定 2.2.6 SMSC-Exos的提取和鉴定 (11) 2.2.6.1 SMSC-Exos的提取 2.2.6.2 SMSC-Exos的形态学鉴定 2.2.6.3 SMSC-Exos的粒径分布测定 2.2.6.4 SMSC-Exos的表面标志物鉴定 2.2.7 体外实验 (14) 2.2.7.1 BMSCs摄取外泌体实验 2.2.7.2 细胞增殖实验 2.2.7.3 细胞凋亡Annexin V 实验 2.2.8 骨坏死动物实验 (16) 2.2.8.1 实验动物模型制作和动物实验分组 2.2.8.2 实验动物的一般行为学观察 2.2.8.3 MicroCT观察
实验新人必读(六)：外泌体实验研究的正确打开姿势!
实验新人必读（六）：外泌体实验研究的正确打开姿势！ 导语最近，外泌体在科研界以迅雷不及掩耳之势火了起来，国自然中标量那是翻着倍的蹭蹭往上涨。然而目前外泌体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次对其他囊泡与外泌体的区别仍不能做出清楚的判断。 外泌体的藏身之处正所谓高手在民间，欲一睹高人风采，就必先找到高人隐身之处。通常外泌体藏身于细胞上清、血液、尿液、脑脊液和其他体液。血液血液离心后有两种形式：血清和血浆，但不少小伙伴对它们傻傻分不清楚。前者是不经抗凝处理的血液会自动在一系列凝血因子的作用下 发生凝集，离心后的上层液体；后者是经抗凝剂处理后，离心出去血细胞所得液体。两者虽然一母同胞，但显然血浆比血清更有内涵，其包含一些纤维蛋白原以及大量的外泌体，因而血浆也更受广大研究者的青睐。 Tips:1）血样抗凝剂花样繁多，科研汪们一不小心就会跌的鼻青脸肿。肝素除了会抑制PCR外，还可与外泌体结合阻止细胞摄取外泌体；双嘧达莫（CTAD）则会阻止血小板的激活并抑制其释放外泌体；EDTA可能会干扰PCR反应（尽管其程度小于肝素），但是还是优于其他选择。 2）抽血时动作要轻柔迅速，并记录准确的抽血时间。因为
外泌体在抽血后30分钟内是稳定的，时间过长血小板会因 种种物理因素而被激活并释放外泌体，导致外泌体数量增加。尿液尿液中的外泌体性质稳定且RNA含量高于尿液中的细胞内的RNA。而收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液，并注意避免细菌污染。受试者的亲属（性别相同、年龄相仿）可作为对照。同时也要注意对饮食的控制。脑脊 液脑脊液中的外泌体含量虽然较其他体液如血液少，但可 作为神经系统疾病的潜在生物标志物。采集脑脊液时避免受到血液污染，一般由于健康对照脑脊液获取困难，往往以其他神经异常的患者为对照。外泌体的通缉之法既然已经找到了外泌体的藏身之处，接下来就是请高手出山了。正常情况下外泌体是有侠义之风的，默默无闻的传递信号分子，以激活下游信号通路，帮助其他细胞各司其职。比如树突状细胞源性的外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。然而一旦细胞变坏了，其分泌的外泌体也就成了恐怖份子，像肿瘤细胞分泌的外泌体小哥就作恶多端，在机体中掀起了一片腥风血雨，引得科研界中的各路人马纷纷亮出自家法宝对其进行缉拿通缉。秘笈一：超速离心法此秘笈普遍被科研 者所接受，通常与蔗糖密度梯度结合，使相对低密度的外泌体漂浮起来。然而，此法比较耗时耗力，一般需要8-30h，一次仅能处理6个样品，且产率较低，不适用于如血浆和血清等粘性生物液体。然而却可以获得高纯度的外泌体，并且