肿瘤基因治疗技术
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中国肿瘤2001年第10卷第10期
安瑞生,陈晓峰
(中国科学院北京动物研究所,北京100080)
Gene Thera py Techni q ue
AN Rui sheng,C HEN Xiao feng
摘要:肿瘤基因治疗就是将一段特定的遗传信息物质DNA 或RN A 通过人工方法导入肿瘤细胞以治疗肿瘤性疾病。目前的
研究主要包括三个方面:肿瘤免疫基因治疗、反义RNA 、三链D NA 。其中研究较多的是肿瘤免疫基因治疗。本文主要对肿瘤免疫基因治疗的构建、接种、应用等方面做了综述,并简要介绍了反义RNA 和三链DNA 技术。
关键词:基因治疗;基因疫苗;DNA 疫苗;反义RNA;三链DN A;肿瘤中图分类号:R730.54文献标识码:B 文章编号:1004-0242(2001)10-0577-03
收稿日期:2001-08-22肿瘤免疫基因治疗就是将具有一定功能的外源基因导入人体细胞,以补充机体所缺乏的基因或纠正机体异常表达的基因。人类基因治疗的探索始于20世纪80年代初,目前已由动物实验向临床试验过渡。本文就肿瘤的基因治疗技术的现状综述如下。
1
肿瘤免疫基因治疗
1 1
载体的构建
获得合适的抗肿瘤编码基因并将它插入到载体DNA
上,是发展肿瘤基因治疗的一个主要工作。不言而喻,目的基因的选择至关重要。抗肿瘤基因可以是单个基因或具有协同保护功能的一组基因,也可以是编码抗肿瘤基因决定簇的一段核苷酸序列。但是,这都是建立在充分了解病原体基因的基础上的。表达文库免疫技术,提供了一种在各种已知或未知病原体基因组中获得目的基因的系统而普遍有效的方法。该技术根据病原体的所有抗原都由其DNA 编码这一基本原理,将病原体基因文库中的病原体DNA 片段插入特定的质粒中,利用基因免疫的方法筛选病原体基因组中具有免疫保护功能的基因片段。目前,基因表达文库免疫技术是发现目的基因的一种最系统、客观的手段。
质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增,而在动物细胞内则能高效表达,但不复制,也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列。用于基因治疗的载体主要有质粒和病毒,病毒载体曾经被用作抗原基因载体[1],现在主要用质粒构建载体,由于细菌质粒本身没有很强的免疫原性,这对保证质粒在体内长期稳定地表达有重要意义[2]。
载体一般以PBR322或PUC 质粒为基本骨架,它们能在
大肠杆菌内扩增,但不能在哺乳动物细胞内复制
[3]
。通常使
用的质粒载体有PBR322、PUC18、PUC19、PUC118、PUC119等。常用的质粒载体启动子多为来源于病毒基因组的巨细胞病毒(CMV)早期启动子,具有很强的转录激活作用,带有细菌复制子(ORI),真核生物的启动子和PolyA 加尾信号。启动子大多来源于病毒基因组,如CMV 、PSV 、LTR 等,其中以CMV 的转录活性最高,PolyA 序列具有保证mRNA 在体内的稳定性的作用,这种稳定性因PolyA 来源不同而异,目前认为较好的PolyA 来自牛生长激素基因或兔B 球蛋白基因。另外,还可包含一些合适的增强子、终止子、内含子、免疫激活序列及多聚腺苷酸信号等。筛选载体可以选用卡那霉素、氨苄青霉素或新霉素等抗性基因。1.2
目的基因的导入
主要途径包括间接体内法和直接体内法。间接体内法是指在体外用基因转染肿瘤细胞,然后将经转染的肿瘤细胞输入病体内,最终给予病体的疗效物质是基因修饰的细胞[4]。直接体内法是指基因片段或完整基因直接注入体内进行治疗的办法。就直接体内法而言,目前使用的方法有以下几种:
裸DNA 直接注射,将裸质粒DNA 直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。脂质体包裹DNA 直接注射,包裹DNA 的脂质体能与组织细胞发生膜融合,而将DNA 摄入,减少了核酸酶对DNA 的破坏。注射途径类似裸DNA 直接注射[5]
。金包被DNA 基因枪轰击法,将质粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA 的金微粒子高速穿入组织细胞。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA 法,选择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然后用质粒DNA 转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由于能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA [6]。经改造的mRNA 法,将目的基因的mRNA 结构进行重组后直接送入体内。
肿瘤基因治疗技术
专
题报道
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1.3肿瘤免疫基因治疗的免疫效果
基因治疗肿瘤的动物试验疗效很好,但在临床试验中,仅少数可观察到肯定疗效。其原因可能是: 人体是复杂整体,外源基因进入人体后,尚无法控制其整合与表达; 肿瘤是多基因病,仅仅修正1、2个异常基因,难以将其彻底控制; 人体肿瘤负荷远大于实验动物,治疗难度大;!人体肿瘤多为自发瘤,免疫原性弱,具机体免疫耐受时间长,抗肿瘤免疫难以调动;?外源基因在人体内的转染效率及表达水平均很低,不能满足治疗肿瘤的需要,当务之急应发展高效、低毒的载体。
1.4肿瘤基因免疫治疗机理
基因免疫能引起多种免疫反应:一是体液免疫反应,在绝大多数基因免疫试验中,都能得到编码蛋白的特异性抗体,抗体主要类型为IgG;二是细胞毒T 淋巴细胞免疫反应,基因免疫在抗原提呈细胞内表达的编码蛋白,经过提呈,诱导细胞毒T 淋巴细胞产生;三是辅助T 细胞反应,基因免疫能激发辅助T 细胞的增殖,并伴有细胞因子的分泌,主要的细胞因子为白介素_12和干扰素,属典型的Th1型辅助T 细胞反应。还有些试验还发现,基因免疫还有辅助T 细胞参与的免疫记忆效应。
基因免疫的详细机理目前尚不十分清楚。但是一些研究已搞清了基因免疫反应机制的两个主要问题。第一是关于肌肉注射的问题。基因免疫采用肌肉注射的方法能激发强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应,这可能与其自身的结构有关[7]
。目前已确定的是,经过肌肉组织的树突状细胞带走了肿瘤免疫疫苗并产生了抗原[8]
。树突状细胞是体内专职的抗原提呈细胞,负责将细胞内的异源物质提呈给免疫系统。少量的树突状细胞内吞了肿瘤免疫疫苗DNA,表达后可激活所有的树突状细胞,进而激发强烈的免疫反应[9]。一些以前的研究包括:Wolff 等[10]认为,肌细胞通过T 小管和细胞膜穴样内陷把外源基因纳入并表达相应的抗原蛋白,后者被降解为8~12个氨基酸小肽,包含不同的抗原表位。来源于胞液和囊液的抗原表位分别与MHC _#类分子和MHC _?类分子结合,被呈递到细胞表面,分别激活T 细胞(CTL)和T 细胞(炎性T 细胞和辅助T 细胞);而分泌到细胞外的抗原则被带有相应抗体的B 细胞捕捉,在Th 细胞的作用下转化为浆细胞产生抗体;Vahlsing 等[11]认为,肌细胞可能作为一种中心成分直接参与免疫应答;另一种观点是,肌细胞的直接参与并非必需,NP 被分泌出来后被巨噬细胞和(或)树突样细胞吞噬、处理、提呈,分别在MHC _#类和MHC_?类分子的限制下,诱导CTL 前体、B 细胞和特异性Th 细胞[12]
;还有一种解释是,DNA 免疫时,肌细胞和APC 均被转染,引起、T 细胞亚群同时活化,产生特异性免疫应答。不管是哪一种途径均可诱导机体的应答,特别是更有效的细胞应答。第二,基因免疫在动物体内产生微量的抗原蛋白所诱发的机体免疫应答效果可以同活疫苗相比,而用等量的抗原蛋白直接免疫动物根本不能诱发任何免疫应答。其原因就在于用作载体的细菌质粒DNA 中带有一定数量的C p G 寡核苷酸
序列,起到了免疫激活作用[12]。未甲基化C p G 二核苷酸在原核生物基因组中以一定的频率存在,而在真核生物基因组中较少且被甲基化。基因免疫疫苗C p G 寡核苷酸序列在动物体内通过一系列的连锁反应,激活机体的免疫系统,放大抗原的免疫效应。首先,导入个体的疫苗DNA 被B 细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞内吞进入细胞,质粒中的CpG 寡核苷酸序列被细胞识别并导致核因子_ B(NFka pp aB)的激活,激活的核因子- B 刺激细胞的基因转录及细胞因子的分泌[13]
。其中,B 细胞快速分泌白介素_6和I g M 抗体,巨噬细胞分泌白介素_12。白介素_12激活自然杀伤细胞分泌 _干扰素, _干扰素能进一步协助抗原提呈细胞MHC _?类表面分子提呈疫苗编码的抗原蛋白,激活Th1辅助T 细胞的分化、增殖并分泌 _干扰素。在 _干扰素和Th1辅助T 细胞的配合下,MHC _#类表面分子提呈疫苗编码的抗原蛋白,激活细胞毒T 淋巴细胞成熟分化,导致细胞免疫反应;同时,由白介素-6等细胞因子和Th1辅助T 细胞协助,疫苗编码的抗原蛋白激活B 细胞成熟分化并分泌抗体I g G2a,而体现一种Th1细胞依赖的由IgM 到IgG 的抗体类型转换[14]
。
1.5肿瘤免疫基因疫苗优缺点
抗原基因在体内持续表达产生抗原,不断刺激机体免疫系统产生长程免疫,免疫效果更可靠。对于易变异的病毒,可以选择各亚型共有的核心蛋白保守DNA 序列作基因疫苗,产生跨株系的免疫保护反应,从而避免易变异病毒产生的免疫逃避问题。一个质粒可插入多个抗原基因,即组成多价基因疫苗,故一种基因疫苗可免疫多种疾病。基因疫苗具有减毒活疫苗的免疫原性,但不会存在活疫苗的毒力回升的危险。基因疫苗的质粒DNA 无免疫原性,不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应,故可重复使用。另外,基因还不会受机体已有抗体的影响,可用于带母体抗体的婴儿。对于毒性大、危险的病毒,以及难以提取抗原的疫苗,基因疫苗的制备相对安全,容易得多。基因疫苗制备简单,容易大量生产,且成本低。质粒DNA 非常稳定,易于贮存和运输。使用方便,可以经多种途径给药,不需免疫佐剂等。
另一方面基因疫苗作为一类新型疫苗,还有一些方面不完善,在实际应用中还存在一些问题有待解决:安全性问题,基因疫苗一般不会整合到染色体基因组上,但不能排除少数质粒DNA 插入到染色体上,引起插入突变的可能性。不过目前的动物实验尚未发现发生插入突变的证据。免疫效率有种属个体差异,各动物之间的免疫效率不一样,这可能与不同动物细胞需要不同启动子有关。同种动物之间也有个体差异,免疫效率往往不能达到百分之百,这可能与抗原基因、给药方法途径、给药量有关。基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白,可能引发免疫耐受。以上不足之处给基因疫苗的研究工作提出了新的课题。
2反义RNA
反义RNA 指与mRNA 互补后,能抑制与肿瘤发生直接
CD 8+CD 4+CD 4+CD 8+专题报道
相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达,具有特异性强、操作简单的特点,可用来治疗由基因突变或过度表达导致的肿瘤疾病。反义RNA治疗的基本方法有:
A反义寡核苷酸:体外合成十至几十个核苷酸的反义寡核苷酸或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列,用脂质体等将反义寡核苷酸导入体内靶细胞,然后反义寡核苷酸与相应mRNA特异性结合,从而阻断mRNA的翻译。
B反义RNA表达载体:合成或PCR扩增获取反义RNA的DNA,将它克隆到表达载体,然后将表达载体用脂质体导入靶细胞,该DNA转录反义RNA,反义RNA即与相应的mRNA特异性结合,同样阻断某基因的翻译。
反义RNA的特点:反义RNA用于基因治疗具有特异性强,只阻断靶基因的翻译表达,反义RNA只与特定mRNA结合,不改变基因结构,最终会被RNase水解,不残留。适应于多种疾病,亦可同时用多个反义RNA封闭多个基因,有可能应用于多基因病。但是,反义RNA的选择设计难,反义RNA 与mRNA亲和力、结合的特异性受结合位点两侧序列的二级或三级结构的影响较大。
3三链DNA
脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合,形成三链DNA来阻止基因转录或DNA复制,为了与作用在mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别,将三链DNA 技术称之为反基因技术。
基本方法与机理:设计合成15~40个碱基的脱氧寡核苷酸,这些序列具有较短而兼并性较高的特点,与双链DNA 结合,通常结合在蛋白识别位点处,形成三链DNA,干扰DNA 与蛋白质的结合,如转录激活因子,从而阻止基因的转录与复制。
三链DNA所需剂量小,因为它是针对转录水平的DNA 序列,并且具有较强的特异性,因为1~2个碱基的错配将导致三链DNA稳定性大大降低。但是三链DNA稳定性不够,半衰期较短。而且它必经与同聚嘌呤同聚嘧啶片段结合,但这样DNA片段在真核细胞很少。
4肿瘤基因治疗的应用
随着对肿瘤的研究在分子水平上取得突破性进展,肿瘤的基因治疗已成为当前研究的热点。肿瘤细胞常常会有多种基因的改变,因此,目前将一些涉及肿瘤的主要基因进行基因治疗,如p53抑癌基因、ras癌基因等。p53基因是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,约50%的人类恶性肿瘤中都存在p53基因的异常。因此在基因治疗的研究中p53基因的地位十分突出。另外,由于外源遗传物质可能影响生物的群体遗传特征,因此,目前的基因治疗主要限于生物的体细胞,而生殖细胞和受精卵则禁止使用。
基因免疫的免疫力已被人们所公认,但其免疫机制不甚
了解,所以目前对基因免疫机制的研究,主要是构建高效免
疫效力的基因疫苗。
基因治疗的安全性问题即载体DNA的自身免疫问题,
有关的报道比较少,因此建议该方法首先用于动物治疗。
基因免疫在体内表达的微量抗原蛋白能够激发个体的
免疫反应,但很多情况下强度很弱,一方面是由于基因免疫
的转化效率有限,同时也因为基因免疫疫苗在宿主体内不能
像活疫苗那样自我复制。因此寻找合适的免疫佐剂是增强基
因免疫活性的重要手段。
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专
题
报
道
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中国肿瘤2001年第10卷第10期
肿瘤基因治疗的最新进展
肿瘤基因治疗的最新进展 王佩星 （徐州师范大学科文学院 08生物技术 088316103） 摘要：癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。癌症的基因治疗目前主要是用复制缺陷型载体转运抗血管生成因子、抑癌基因、前药活化基因（如ＨＳＶ－１胸腺嘧啶激酶）以及免疫刺激基因。主要抗肿瘤机制为：抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导抗肿瘤免疫反应、提高肿瘤细胞对化疗的敏感性、提高肿瘤细胞对放疗的敏感性、切断肿瘤细胞的营养供应。 关键词：肿瘤、基因治疗、免疫、原癌基因、抑癌基因 The latest progress of cancer gene therapy WangPeiXing (xuzhou normal university institute of biotechnology 088316103 foremen who 2008) Abstract: the cancer is a genetic disease, its occurrence, development and recurrence are associated with genetic variation, loss, deformity related. Human body cell carries oncogenes and tumor-suppressor genes. Cancer gene therapy is now primarily with copy DCF with carrier transport antiangiogenic factors, tumor-suppressor genes, before medicine activated genes (such as HSV - 1 thymine bases kinase) and immune irritancy genes. Main antitumor mechanism for: inhibiting tumor cell growth, inducing tumor cell apoptosis, inducing antineoplastic immune response, improving the sensitivity of the tumor cells to chemotherapy, radiotherapy of tumor cells to improve sensitivity, cut tumor cells to nutrition. Keywords: tumor, gene therapy, immunity, protocarcinogenic gene, tumor-suppressor genes 从本质上来讲，癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。正常情况下，这两种基因相互拮抗，维持协调与平衡，对细胞的生长、增殖和衰亡进行精确的调控。在遗传、环境、免疫和精神等多种内、外因素的作用下，人体的这一基因平衡被打破，从而引起细胞增殖失控，导致肿瘤发生。基因治疗的策略有基因替代、基因修复、基因添加、基因失活，目前临床使用的最主要方式是基因添加。针对肿瘤的特异性分子靶点设计肿瘤治疗方案，具有治疗特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的优点。这种肿瘤靶向治疗是肿瘤治疗中最有前景的方案。 1.肿瘤基因治疗的历史进展 肿瘤、艾滋病、遗传病是困扰人们的三大疾病，对肿瘤的根治是人们一直迫不及待想要实现的愿望。
基因诊断和治疗的医学应用
基因诊断和治疗的医学应用 郭龙飞 （保山学院资源环境学院云南保山678000） 摘要：各种癌症和恶性肿瘤是目前危害人类健康最为严重的疾病之一，且死亡率很高，现在还没有一种有效的治疗方法。传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期的患者治疗疗效已经明显不足。因此。找到一种新的治疗癌症和恶性肿瘤的治疗方法对人类健康发展是意义重大的。而基因治疗则是用各种手段从基因水平上来治疗各种疾病。于是，基因治疗为众多患者提供了希望，成为了现在医学界的热门话题。本文就是依据前人的研究成果，以基因治疗癌症和恶性肿瘤为主来论述基因治疗在医学上的应用。 关键词：基因诊断基因治疗癌症恶性肿瘤 1基因治疗概述 基因治疗的基本含义是通过遗传或分子生物学技术在基因水平上治疗各种疾病[1]。它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞,以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗,而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗,一般用DNA序列[2]。它是运用基因工程技术直接纠正肿肿瘤细胞基因的结构及（或）功能缺陷，或者间接通过增强宿主对肿瘤的杀伤力和机体的防御功能来治疗肿瘤。通过外源基因的导入，激活机体抗瘤免疫，增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达或增加肿瘤细胞对药物的敏感性，这些基因主要包括细胞因子基因、抗肿瘤基因、肿瘤药物相关基因和病毒基因等[3]。 目前基因治疗的方式(type of gene therapy)主要有3种：①基因矫正或置换：即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变。②基因增补：不去除异常基因，而是通过外源基因的导人，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。③基因封闭：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达[4]。 2基因诊断应用 2.1基因诊断新生儿脊髓性肌萎缩 目前报道有一些较严重的SMA I型患儿会出现关节挛缩、骨折、呼吸困难和感觉神经元受损的表现，但机制还不清楚，可能与5ql3缺失大小有关。SMA尚无特异的治疗方法，临床主要是对症治疗，如早期发现SMA患儿呼吸系统受累并干预性通气治疗可以延长疾病的病程、改善患儿生活质量、减少肺部继发性感染及呼吸衰竭发生。本例患儿经抗炎、吸氧、吸痰、补充维生素、给予丙种球蛋白等对症治疗和支持治疗，呼吸困难逐渐缓解，双肺痰鸣音减少，但最终家长考虑远期预后不良而放弃治疗[5]。 最近，在体外实验研究中发现丁酸纳、丙戊酸和Htra—ISl的调节因子可以增加SMN2基蛋白的作用，而且对细胞几乎没有毒性作用，但研究工作还处于动物实验阶段，没有正式应用于临床，该类药物可能为SMA的治疗开辟了新的途径[5]。 2.2早期胰腺藩的基因诊断 近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年有新发病例约20万人，占全部恶性肿瘤发病的2％。其发病匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，80％-90％的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有15％，年生存率为1％-5％。而早期胰腺癌的手术切除率为90-100％，5年生存率可达70％- 100％。另有研究表明，肿瘤的大小是重要的生存率预测因子，如果直径 《免疫学概论》课程论文 肿瘤基因治疗的研究进程及发展趋势 姓名：郭冬阳 学号： 200904123100** 学院：材料与化工学院 专业班级： 2009级生物工程（2）班 指导教师：郑育声 分数： 2012年12 月30 日 摘要 肿瘤的基因治疗就是将一个治疗基因“捆绑”在“病毒”上，随后将这种载有治疗基因的“病毒”感染肿瘤患者或肿瘤细胞，使治疗基因进入肿瘤细胞，进而“摧毁”肿瘤细胞。这种肿瘤的治疗技术已成为现代广大肿瘤学者的研究热点，其具有特异性、安全性、有效性的特点而受到越来越多的关注，而且许多实验及临床研究取得了满意的效果。本文将从肿瘤基因治疗的方法、我国肿瘤基因治疗的现状及发展趋势等方面进行论述。 关键词：肿瘤；基因治疗；研究进展；发展趋势 基因治疗是以改变遗传物质为基础的DNA重组技术，需要将目的基因传递到细胞内，这一过程必需载体的协助才能达到目的，因此载体在基因的转移中担任重要角色。随着免疫学的发展和基因技术研究的不断加深，结合病毒载体、免疫基因和转基因等方法在肿瘤的基因治疗中取得了许多成就，为肿瘤的治疗展现了广阔的应用前景。 一、肿瘤基因治疗 1．1 肿瘤基因治疗的策略 （1）免疫基因治疗，又称细胞因子基因治疗，通过转导细胞因子基因，增强机体抗肿瘤免疫能力； （2）自杀基因治疗，使肝癌细胞产生对某些药物前体的特异敏感性而被杀； （3）基因置换或补充，置换突变的基因或补充缺失的抑癌基因； （4）反义苷酸技术，用于抑制癌基因的表达。 1．2 肿瘤基因治疗基因工程的程序 首先取得所需要的基因即目的基因，将其同载体连接，再将经过重组的环状DNA即质粒引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因的性状得以表达等几个环节。 （1）在内切酶的作用下分离制备待克隆的DNA片段； （2）将目的基因与载体在体外连接形成重组DNA； 577 中国肿瘤2001年第10卷第10期 安瑞生,陈晓峰 (中国科学院北京动物研究所,北京100080) Gene Thera py Techni q ue AN Rui sheng,C HEN Xiao feng 摘要:肿瘤基因治疗就是将一段特定的遗传信息物质DNA 或RN A 通过人工方法导入肿瘤细胞以治疗肿瘤性疾病。目前的 研究主要包括三个方面:肿瘤免疫基因治疗、反义RNA 、三链D NA 。其中研究较多的是肿瘤免疫基因治疗。本文主要对肿瘤免疫基因治疗的构建、接种、应用等方面做了综述,并简要介绍了反义RNA 和三链DNA 技术。 关键词:基因治疗;基因疫苗;DNA 疫苗;反义RNA;三链DN A;肿瘤中图分类号:R730.54文献标识码:B 文章编号:1004-0242(2001)10-0577-03 收稿日期:2001-08-22肿瘤免疫基因治疗就是将具有一定功能的外源基因导入人体细胞,以补充机体所缺乏的基因或纠正机体异常表达的基因。人类基因治疗的探索始于20世纪80年代初,目前已由动物实验向临床试验过渡。本文就肿瘤的基因治疗技术的现状综述如下。 1 肿瘤免疫基因治疗 1 1 载体的构建 获得合适的抗肿瘤编码基因并将它插入到载体DNA 上,是发展肿瘤基因治疗的一个主要工作。不言而喻,目的基因的选择至关重要。抗肿瘤基因可以是单个基因或具有协同保护功能的一组基因,也可以是编码抗肿瘤基因决定簇的一段核苷酸序列。但是,这都是建立在充分了解病原体基因的基础上的。表达文库免疫技术,提供了一种在各种已知或未知病原体基因组中获得目的基因的系统而普遍有效的方法。该技术根据病原体的所有抗原都由其DNA 编码这一基本原理,将病原体基因文库中的病原体DNA 片段插入特定的质粒中,利用基因免疫的方法筛选病原体基因组中具有免疫保护功能的基因片段。目前,基因表达文库免疫技术是发现目的基因的一种最系统、客观的手段。 质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增,而在动物细胞内则能高效表达,但不复制,也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列。用于基因治疗的载体主要有质粒和病毒,病毒载体曾经被用作抗原基因载体[1],现在主要用质粒构建载体,由于细菌质粒本身没有很强的免疫原性,这对保证质粒在体内长期稳定地表达有重要意义[2]。 载体一般以PBR322或PUC 质粒为基本骨架,它们能在 大肠杆菌内扩增,但不能在哺乳动物细胞内复制 [3] 。通常使 用的质粒载体有PBR322、PUC18、PUC19、PUC118、PUC119等。常用的质粒载体启动子多为来源于病毒基因组的巨细胞病毒(CMV)早期启动子,具有很强的转录激活作用,带有细菌复制子(ORI),真核生物的启动子和PolyA 加尾信号。启动子大多来源于病毒基因组,如CMV 、PSV 、LTR 等,其中以CMV 的转录活性最高,PolyA 序列具有保证mRNA 在体内的稳定性的作用,这种稳定性因PolyA 来源不同而异,目前认为较好的PolyA 来自牛生长激素基因或兔B 球蛋白基因。另外,还可包含一些合适的增强子、终止子、内含子、免疫激活序列及多聚腺苷酸信号等。筛选载体可以选用卡那霉素、氨苄青霉素或新霉素等抗性基因。1.2 目的基因的导入 主要途径包括间接体内法和直接体内法。间接体内法是指在体外用基因转染肿瘤细胞,然后将经转染的肿瘤细胞输入病体内,最终给予病体的疗效物质是基因修饰的细胞[4]。直接体内法是指基因片段或完整基因直接注入体内进行治疗的办法。就直接体内法而言,目前使用的方法有以下几种: 裸DNA 直接注射,将裸质粒DNA 直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。脂质体包裹DNA 直接注射,包裹DNA 的脂质体能与组织细胞发生膜融合,而将DNA 摄入,减少了核酸酶对DNA 的破坏。注射途径类似裸DNA 直接注射[5] 。金包被DNA 基因枪轰击法,将质粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA 的金微粒子高速穿入组织细胞。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA 法,选择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然后用质粒DNA 转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由于能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA [6]。经改造的mRNA 法,将目的基因的mRNA 结构进行重组后直接送入体内。 肿瘤基因治疗技术 专 题报道 《免疫学概论》课程论文 欧阳歌谷（2021.02.01） 肿瘤基因治疗的研究进程及发展趋势 姓名：郭冬阳 学号： 200904123100** 学院：材料与化工学院 专业班级： 2009级生物工程（2）班 指导教师：郑育声 分数： 2012年12 月30 日 摘要 肿瘤的基因治疗就是将一个治疗基因“捆绑”在“病毒”上，随后将这种载有治疗基因的“病毒”感染肿瘤患者或肿瘤细胞，使治疗基因进入肿瘤细胞，进而“摧毁”肿瘤细胞。这种肿瘤的治疗技术已成为现代广大肿瘤学者的研究热点，其具有特异性、安全性、有效性的特点而受到越来越多的关注，而且许多实验及临床研究取得了满意的效果。本文将从肿瘤基因治疗的方法、我国肿瘤基因治疗的现状及发展趋势等方面进行论述。 关键词：肿瘤；基因治疗；研究进展；发展趋势 基因治疗是以改变遗传物质为基础的DNA重组技术，需要将目的基因传递到细胞内，这一过程必需载体的协助才能达到目 的，因此载体在基因的转移中担任重要角色。随着免疫学的发展和基因技术研究的不断加深，结合病毒载体、免疫基因和转基因等方法在肿瘤的基因治疗中取得了许多成就，为肿瘤的治疗展现了广阔的应用前景。 一、肿瘤基因治疗 1．1肿瘤基因治疗的策略 （1）免疫基因治疗，又称细胞因子基因治疗，通过转导细胞因子基因，增强机体抗肿瘤免疫能力； （2）自杀基因治疗，使肝癌细胞产生对某些药物前体的特异敏感性而被杀； （3）基因置换或补充，置换突变的基因或补充缺失的抑癌基因； （4）反义苷酸技术，用于抑制癌基因的表达。 1．2肿瘤基因治疗基因工程的程序 首先取得所需要的基因即目的基因，将其同载体连接，再将经过重组的环状DNA即质粒引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因的性状得以表达等几个环节。 （1）在内切酶的作用下分离制备待克隆的DNA片段； （2）将目的基因与载体在体外连接形成重组DNA； （3）重组DNA进入宿主细胞； （4）筛选、鉴定阳性重组子； （5）重组子的扩增。 1．3肿瘤基因治疗基因工程所需的载体 肿瘤基因治疗基本方法 基因是一段染色体DNA序列，用于产生功能产物多肽或功能RNA分子。基因治疗一般是指将限定的遗传物质转入病人特定的靶细胞，以达到预防或治疗疾闰的目标的方法。肿瘤基因治疗是用正常或野生型基因矫正或置换致病基因或引入有治疗价植的其它来源基因的一种治疗方法。基因治疗一般是引入修饰基因于病人体内而并非该基因的产物，即是一种疗法而非新产品。但是，通过体内直接途径可将外湖DNA象传统的药物一样注射到机体内，帮、故有人称这些外源的DNA的基因药物。 基因治疗中，从分子生物学角度可分为两种方式：一是基因矫正和转换，即将基因的异常序列进行矫正和置换，即将基因的异常序列进行矫正和精确的原位修复；二是基因添加和增补，即不去除异常基因，而是通过具有治疗意义的外源基因的定点整合，使其表达正常产物以补偿缺陷基因的功能。根据针对宿主病变细胞基因采取的措施不同，可分为基因置换、基因修正、基因转移和基因灭活四种方法。肿瘤基因治疗研究中，通常采用基因转移和基因灭活方法。基因转移是指将外源性目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物修饰缺陷细胞，使其恢复功能或使原有的功能得到加强，故又称为基因修饰。肿瘤基因修饰治疗研究包括免疫基因治疗、增强抑癌基因表达、靶向化疗或提高机体化疗耐受性等内容。基因灭活是应用反义技术特异性封闭某些基因的表达。反义技术是指利用针对特异性DNA和RNA片段按碱基配对的原则人工合成小分子核苷酸序列（反义寡苷酸），与其目的DNA和RNA序列互补结合，以选择性抑制目的基因翻译或转灵过程的技术和方法。在肿瘤基因灭活治疗中，订要是利用反义寡核苷酸抑制或封闭某些癌基因的表达。 基因转移疗法一般分为两类：一是体细胞系基因转移，主要用于防治遗传性及非遗传性疾病；二是胚胎基因转移，用于预防遗传性疾病。临床上，基因治疗是指体细胞基因治疗。基因治疗基本上分为三步：①基因导入：是指把基因或含有基因的载体导入机体；②基因传递：是指基因从导入部位进入靶细胞核；③基因表达：是指细胞中治疗性基因产物的形成。 1990年，Rosenberg等首次在晚期癌症病人中利用逆转录病毒载体基因转移技术，将转导了编码肿瘤坏死因子的肿瘤浸润淋巴细胞用于治疗晚期癌症。近10年来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入，肿瘤基因治疗获得了突飞猛进的发展，并逐渐走向成熟，批准进入临床试验的基因药物逐年增多。目前开展的免疫基因治疗、转导抑癌基因、反义癌基因以及靶向化疗等肿瘤基因治疗研究，其结果令人鼓舞。肿瘤基因治疗已成为目前攻克和治愈肿瘤最具希望的，也是最活跃的领域。 1、肿瘤基因治疗的基本方法 1.1确定基因治疗载体 运载或携带治疗性遗传物质的工具称之为载体（V ector）。天然存在的载体可通过三种不同的机制在不同细胞之间转移：结合（和运动），转导和转染。转导依赖于整合入细胞基因组并经细胞分裂繁殖的病毒DNA分子。转染是DNA通过物理或化学的方法被动转运至细胞的过程。转导用载体通常是病毒，也是非病毒载体。基因治疗载体应具备以下条件：①易于进入细胞；②在特异细胞或组织达到有规律的、充分的及持续的外源基因表达；③外源基因应含有或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。④整个过程应安全有效并具有选择性；⑤易于大量生产。目前采用的载体还没有一种能具备上述所有的条件。理想的基因治疗载体除具备以上条件外，应该是静脉内传递并只转染特异细胞。目前常用基因治疗载体可分为病毒载体和非病毒载体两类。 肿瘤基因治疗的研究进展 摘要：基因治疗是一种新的肿瘤治疗手段。抗肿瘤有效基因的筛选、基因治疗方法的选择、基因治疗的相关载体的选择及其安全性改造的研究逐步深入，使肿瘤的基因治疗研究进展迅猛，部分基因治疗方案已进入临床试验阶段。然而，肿瘤基因治疗仍然存在风险。本文对肿瘤基因治疗的应用及所面临的挑战进行综述。关键词基因治疗；肿瘤；治疗方法；载体 引言 随着现代分子生物学及其技术的发展,人们对疾病的认识和治疗手段已进入分子水平。越来越多的研究资料表明,多种疾病与基因的结构或功能改变有关,因而萌生了从基因水平治疗疾病的想法。DNA重组、基因转移、基因克隆和表达等技术的建立和完善,为基因治疗(gene therapy)奠定了基础。 1 肿瘤基因治疗概述 1.1基因治疗的诞生和发展 早在上个世纪60年代末,美国科学家迈克尔·布莱泽首次在医学界提出了基因治疗的概念;进入80年代,对基因治疗能否进入临床存在很大争议。直到1990年,美国国家食品药品监督管理局(FDA)才正式批准了第一个基因治疗临床试验,美国国立卫生研究院(NIH)进行了世界上首次人体基因治疗的临床试验。一名年仅4岁患有先天性腺苷脱氨酶缺乏症(ADA)的小女孩,经过基因治疗技术导入正常的腺苷脱氨酶基因,患儿的免疫能力得以提高,获得了明显的治疗效果。这项临床试验的成功是当今生物医学发展最重要的篇章。 此后,世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮，许多人认为这预示着基因治疗时代的到来。在华盛顿美国国家历史博物馆有一份DNA研究的历史档案,记载了自1943年Avery及其同事McLeod、McCarty证明DNA是生命的遗传物质以来所有发展的里程碑,档案上清楚地显示基因治疗是当今基因生物技术最新的重要里程碑。 然而,基因治疗的诞生与发展从来就不是一帆风顺的。由于最初基因治疗技术达不到预期持久稳定的治疗效果,在不断遭到质疑的同时,人们便逐渐对其丧失兴趣。1999年,美国一位患有先天性鸟氨酸转甲酰酶缺陷症的18岁少年Jesse Gelsinger,在宾西法尼亚大学人体基因研究所施行基因治疗4天后死去,致使基因疗法遭受重创,人们对基因治疗的热情骤然间降至冰点。在人们怀疑基因治疗安全性的同时,美国FDA终止了该大学的8项正在进行中的基因治疗临床试验。但随后的调查结论证明,问题不在基因治疗本身。死者在治疗前正在发热,其用药 肿瘤基因治疗的最新进展 摘要：癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。癌症的基因治疗目前主要是用复制缺陷型载体转运抗血管生成因子、抑癌基因、前药活化基因（如ＨＳＶ－１胸腺嘧啶激酶）以及免疫刺激基因。主要抗肿瘤机制为：抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导抗肿瘤免疫反应、提高肿瘤细胞对化疗的敏感性、提高肿瘤细胞对放疗的敏感性、切断肿瘤细胞的营养供应。 关键词：肿瘤、基因治疗、免疫、原癌基因、抑癌基因 从本质上来讲，癌症是一种基因病，其发生、发展与复发均与基因的变异、缺失、畸形相关。人体细胞携带着癌基因和抑癌基因。正常情况下，这两种基因相互拮抗，维持协调与平衡，对细胞的生长、增殖和衰亡进行精确的调控。在遗传、环境、免疫和精神等多种内、外因素的作用下，人体的这一基因平衡被打破，从而引起细胞增殖失控，导致肿瘤发生。基因治疗的策略有基因替代、基因修复、基因添加、基因失活，目前临床使用的最主要方式是基因添加。针对肿瘤的特异性分子靶点设计肿瘤治疗方案，具有治疗特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的优点。这种肿瘤靶向治疗是肿瘤治疗中最有前景的方案。 1.肿瘤基因治疗的历史进展 肿瘤、艾滋病、遗传病是困扰人们的三大疾病，对肿瘤的根治是人们一直迫不及待想要实现的愿望。 1964年9月，实验室证实紫杉树提取物确实能够阻止癌细胞生长〔1〕，从此紫杉醇在世界各地广泛使用。 在过去的十年里，随着细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，基因治疗，特别是肿瘤的基因治疗已成为备受瞩目的研究领域并已初步取得令人振奋成果，如针对肿瘤细胞、肿瘤的血管改变、肿瘤患者的免疫系统和骨髓变化的基因治疗等。尽管目前还没有哪一种肿瘤基因治疗方法的作用是比较理想的，但都显示出了良好的应用前景。 癌症的基因治疗目前主要是用复制缺陷型载体转运抗血管生成因子、抑癌基因、前药活化基因（如ＨＳＶ－１胸腺嘧啶激酶）以及免疫刺激基因。其中以腺病毒携带ｐ５３的临床进展最为迅速。 2.肿瘤基因治疗的最新现状分析 2.1诱导抗肿瘤免疫反应 肿瘤细胞由于抗原性太弱而逃避了机体免疫系统对其的追杀〔2〕，病毒可以利用其他种类病原体或体细胞的病态表面结构，例如癌症肿瘤细胞呈现出特殊的蛋白结构，免疫系统通常就是利用这个来识别肿瘤细胞的，该特殊的蛋白结构称为肿瘤标记物 [3]。我们可以制造出可识别肿瘤标记物的单克隆抗体，这样就可以检测到肿瘤的大小和位置，以便提出更好的治疗方案。 单克隆抗体加上细胞毒素药物就是“百发百中的魔弹”在这个领域取得的第一个成就就是使用人鼠嵌合性单克隆抗体，这种抗体经过遗传修饰，可以专门针 基因治疗现状的五大策略 肿瘤的基因治疗早已经不是一个陌生的话题，目前基因治疗现状的策略主要在于以下五个方面。其中基因置换和基因修复时最理想的基因治疗方法： 1、免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白血球介素（IL）基因导入肿瘤患者体内，提高IL的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤的目的； 2、基因失活：利用反义RNA、核酶或核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞耐药基因的表达，增加化疗效果； 3、基因代替：这种基因治疗方法缺陷基因仍然存在，是目前临床上主要采取的基因治疗方式，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，表达产物能加强或纠正缺陷细胞的功能； 4、基因修复：定点修复，基因的异常部分； 5、基因置换：用正常的基因原位置换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常 基因治疗现状 收藏本文分享到： 目前世界上已开展100多项基因治疗的临床研究。基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段,将改变人类疾病治疗的历史进程。人类基因治疗作为在分子水平治疗疾病的手段,将对医学产生巨大影响。一、基因治疗的概念及应用范围从分子生物学角度,基因治疗可理解为将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法;从更广义的疾病治疗角度,则认为凡是将新的遗传物质转移到某个体内使其获得治疗效果的方法均属基因治疗。基因治疗可分二种方式:1.基因矫正或置换,即将基因的异常序列进行校正和精确的原位修复;2.基因添加和增补,即不去除异常基因,而是通过有治疗意义的外源基因作定点整合,使其表达正常产物以补偿缺陷基因的功能。目前绝大多数基治疗属后一种形式。基因治疗实施中有二种方法:1.直接体内法(ｉｎｖｉｖｏ)。即将外源性基因直接导入受者体内有关器官组织或细胞内,以达到治疗目的,如肌内注射、静脉注射、器官内灌注、皮下包埋等;2.间接体内法(ｅｘｖｉｖｏ),即先在体外将外源性基因导入载体细胞,然后将基因转染后的细胞回输给受者,使携有外源性基因的载体细胞在体内表达治疗产物以达到治疗目的 定义：通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的 肿瘤的基因治疗 《摘要》随着分子生物学的发展，肿瘤基因治疗实验研究和临床应用都有了很大进步。本文就抑癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗五种策略，从其理论基础和相关实验研究进展进行了分析。 《关键词》肿瘤基因治疗 恶性肿瘤传统疗法如放疗、化疗、手术治疗的局限性促使人们寻找新的抗肿瘤方法。现已证明，肿瘤的发生与某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调有关。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。基因治疗具有特异性、敏感性以及明确的作用机制等诸多优点, 使其在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用 目前，肿瘤基因治疗的主要途径包括：抑癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）治疗，多药耐药基因治疗，肿瘤血管基因治疗等。 1 抑癌基因治疗 抑癌基因（tumor suppressor gene）又称抗癌基因（antioncogene）指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。研究表明几乎一半人类肿瘤都存在抑癌基因的失活，因此可将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞，去补偿和代替突变或缺失的抑癌基因、逆转肿瘤细胞的表型、抑制癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗的目的。野生型p53基因是目前研究最多的抑癌基因。，p53 有参与细胞周期调控；抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达，从而抑制肿瘤血管生成；降低mdr1/P-gp 的表达，上调TopoⅡa 的表达，逆转耐药性；增加放、化疗对肿瘤细胞的杀伤力。刺激机体的特异性抗肿瘤免疫反应等作用。研究发现,人类恶性肿瘤中至少有50%发生了p53 基因突变。恢复p53 的活性需要将野生型p53 引入到肿瘤细胞中，通过腺病毒（载体）选择性地复制和降解将突变型p53消除，将突变型p53 修复为野生型，稳定p53，激活其他p53 家族成员来代替突变型p53 以及激活p53的野生活性，在体外、动物实验和临床前期研究已经达到预期效果。此外，P53 靶向治疗也存在一些问题。例如，如何消除野生型p53 对肿瘤的次级选择，而不是下游区缺陷途径。 2 肿瘤免疫基因治疗 免疫基因治疗法是指利用基因进行免疫治疗，包括细胞因子基因治疗、制备DNA疫苗等。由于在肿瘤形成过程中机体免疫系统存在对瘤细胞的免疫耐受现象，而这种现象可能是由于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可能是由于抗原呈递细胞（APC）不能提供足够的刺激信号（B7），或者是机体免疫分子分泌不足等原因。Yoshida等构建了携带人干扰素 β（IFN β）基因的腺相关病毒载体，干扰人胶质瘤细胞后可诱导瘤细胞凋亡和坏死，将此载体注入荷瘤鼠组织后可诱导肿瘤细胞产生热休克蛋白，抑制肿瘤生长，动物生存期显著延长［16］。Gansbacher等人将克隆IL 2CD NA基因的病毒载体转染小鼠肿瘤细胞，输入小鼠体内后，这些肿瘤细胞除了自身失去体内成瘤能力，还抑制了体内野生型肿瘤细胞的生长。Han SK等用逆转录病毒作为载体，将人TNF acDNA转染给人肺癌细胞株，再将其经皮注射给裸鼠，发现其明显抑制肿瘤生长。 3 药物敏感基因（自杀基因）治疗肿瘤基因治疗的研究进程及发展趋势-郭晓明
肿瘤基因治疗技术
肿瘤基因治疗的研究进程及发展趋势-郭晓明之欧阳歌谷创作
肿瘤基因治疗基本方法
肿瘤基因治疗的研究进展
肿瘤基因治疗的最新进展
基因治疗现状的五大策略
肿瘤的基因治疗(综述)