蜂蜜淀粉酶值实验教学改革与创新
蜂蜜淀粉酶值实验教学改革与创新
【摘要】蜂蜜淀粉酶值检测是控制蜂蜜产品质量和安全的重要指
标之一。为促动高校与社会食品检验方法的衔接，激发学生的学习热情，山东农业大学卫生检验教研组采用最新国标检测方法取代陈旧方
法应用于蜂蜜淀粉酶值实验教学。在实施的过程中，通过增加碘溶液
预热管数保证淀粉酶酶促反应温度的一致性，采用全自动酶标仪替代
分光光度计提升学生实验效率等改进措施，提升了实验数据和结果的
精确度和准确性，改善了实验教学秩序，确保了国标检测方法法在蜂
蜜淀粉酶值实验教学中的应用。
关键词：实验教学；国标法；蜂蜜淀粉酶值；改进
蜂蜜的营养价值很高，口感独特，深受消费者欢迎1-2。在蜂蜜
所含有的一系列营养物质中，生物酶是其主要的生物活性物质，其中
淀粉酶的含量最高，能够促动人体对食物的消化和营养物质的吸收3-4。但当前市场上蜂蜜产品的质量参差不齐，真假难辨5-8。而蜂蜜淀粉酶活性的检测是控制商品化蜂蜜产品质量和安全的重要指标之一9-10。
蜂蜜淀粉酶值的检测方法有试管比色法和分光光度计法，其中分光光
度计法是最新的国家标准方法11-12。紧跟时代的步伐，与时俱进是高校实验教学改革的灵魂，促动实验教学内容的革新对于学生掌握新概念、新知识、新技能，开阔视野和思路具有极为重要的意义。为和社
会衔接，学校对蜂蜜淀粉酶值检测的实验教学实行了一系列的改革，
其中“国标进课堂”取代陈旧实验方法就是其中一项重要举措。在改
革的过程中发现实验教学不同于简单的实验验证，需要几十人同时实行，涉及到仪器、耗材、场地的共享使用，简单地照搬照抄国标方法并不能直接用于实验教学。为使国标法更好地适合实验教学，山东农业大学动物科技学院卫生检验教研组对蜂蜜淀粉酶值检测的部分内容实行了改革和创新。
1实验方案的设计
1.1材料
1.1.1蜂蜜
来源于山东泰安某养蜂场的新鲜百花蜜。
1.1.2试剂及配制
碘化钾、碘、乙酸钠(CH3COONa3H2O)、可溶性淀粉、氯化钠、冰乙酸等均为国产分析纯。按国标GB/T18932.16-2003要求12分别配制0.5molL-1氯化钠溶液、乙酸盐缓冲液、2%淀粉溶液、碘溶液等。
1.1.3仪器
超纯水系统，Pall，USA；微量移液器，Eppendorf，Germany；电子恒温水浴锅，常州国立，中国；Elx808多功能全自动酶标仪，Biotek，USA；可拆分酶标板，江苏光明器材。
1.2方法
1.2.1样品准备
将采购的蜂蜜样品充分搅拌均匀，勿加热。每组分装100g于烧杯中作为待检样品，标记后供淀粉酶值测定用，常温保存，勿冷藏。
1.2.2标定淀粉溶液
三支试管分别装有10mL水和5mL淀粉溶液和10mL碘溶液，放入40℃水浴中预热15min。然后将5mL淀粉溶液全部加入到10mL水的试
管中混合均匀作为待检的样品混合液，从中吸取1mL混合液加入到
10mL的碘溶液试管中，再加入一定体积的水稀释（先加入少量，需多
次加入确定准确的水的体积）。取200µL加入酶标板的检测孔中，以水作为空白参照，用多功能全自动酶标仪在660nm波长测定溶
液的吸光度（原国标中是用分光光度计实行检测，需取2mL加入比色
皿中待检），若吸光度值较高则继续加水实行检测，直到产生
0.760±0.02的吸光度值。记录多次加入的全部水的体积数，并以此作为检测样品溶液时的稀释系数。淀粉溶液新配制后应重新实行标定。
1.2.3样品检测1.2.3.1全自动酶标仪的检测条件波长为660nm；阴性
对照为水。1.2.3.2样品处理称取精确至0.01g的蜂蜜样品5g，加入
水15mL和乙酸盐缓冲液2.5mL，玻璃棒搅拌混匀后全部转移到提前加
入氯化钠溶液1.5mL的25mL容量瓶中，加水定容，作为样品溶液待检。
1.2.3.3样品检测5mL淀粉溶液1支、10mL样品溶液1支和10mL碘溶
液15支（原国标方法中碘溶液是1支），均提前放入40℃水浴中预热15min。将5mL淀粉溶液全部转入样品溶液，然后充分混合开始计时。
5min时取样品混合溶液1mL加入到盛有10mL碘溶液的试管中，以标定淀粉溶液时确定的水的体积数稀释并混匀充分。取200µL加入
酶标板的检测孔中，以水作为空白参照，用多功能全自动酶标仪于
660nm波长处测定待检样品吸光度（原国标方法中使用分光光度计实行检测，需取2mL待检液加入比色皿中，且比色皿要持续清洗，并漂洗）。如吸光度值大于特定吸光度值0.235，则重新吸取样品混合液加入到另1支碘溶液中实行测定，每隔5min检测1次，直到吸光度值小
于0.235为止。1.2.4数据处理以吸光度值为纵坐标，检测时间为横坐标，在对数坐标纸上作图，连接各点成直线。然后在直线上查出样品
吸光度与0.235交叉点所对应的检测时间，结果按以下公式计算：
X=300/t其中X为所测样品溶液的淀粉酶值，单位为毫升每克小时（mLg-1h-1)；t为对应的检测时间，单位为分(min)。
2实验教学的实施
2.1学生分组
在实验开始前，指导教师提前1w实行实验布置，学生自由组合成2-3人的小组，小组内成员合理分工，并指定1人负责实验用品的领用、归还以及数据的统计、报送等。由班长负责统计分组数及小组成员名单，并于实验开始前上报给指导教师，由实验教师审核成员组合及分工是否合理。实验样品、耗材、器皿等均按小组编号分发。
2.2实验准备
指导教师提前布置实验内容，制定实验目标和要求。实验教师实行实验器材分组，并准备好备份。然后学生以实验小组为单位，课前实行合理分工，查阅相关资料，熟悉实验器材，制定出具体的实验方
案。指导教师针对每个小组的实验方案提出指导性意见和建议。
2.3实验过程的改进
国标方法“蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法
GB/T18932.16-2003”在用于本科实验教学时，因为参与实验人数多、
实验场地拥挤、仪器数量有限等原因，在实验教学过程中出现了诸多
问题，不能有效保障实验秩序的稳定和实验结果的有效性。为有利于
实验教学的顺利实行，卫生检验教研组对实验方法及仪器检测等实行
了部分改进。首先为减少误差，使实验中所用试剂准确保持在40℃，
样品检测中除了提前将样品、淀粉溶液和碘溶液放在水浴中保温外，
需准备15支10mL的碘溶液而不是1支。原因是淀粉和样品混合液共
有15mL，每次取1mL能够取15次，而碘溶液10mL只能使用1次，即
使大瓶的碘溶液放在水浴中能保持在40℃，但分装用的试管没有预热
仍会造成误差，从而影响实验结果。预热15支碘溶液比原国标方法中
仅预热1支碘溶液能更有效地保证实验结果精确度、科学性和有效性。其次检测仪器使用多功能酶标仪替代分光光度计。在样品检测过程中
需要5min测定1次，若OD值变化较快，则需要1min测定1次，时间
间隔比较短，不同小组之间不可能共用1台分光光度计。以1个班10-15个小组计至少需要10-15台分光光度计，而当前实验室的条件最多
只能提供4台，远远不能满足需要。再加上更换、清洗比色皿以及校
零的时间，误差在所难免。而多功能酶标仪配合使用可拆分一次性酶
标条，一个小组1条8个孔，自己做好标记，每次加样1孔，一台酶
标仪可同时检测12个小组，且不用清洗，自动校零，大大提升了时间
的精确性和结果的准确性。
2.4实验考核
实验课程的考核以小组为单位实行，兼顾小组中个人的表现。分
别从文献查阅是否充分、实验方案设计是否合理、实验操作是否规范、实验结果判断是否合理以及实验卫生整洁水准等方面做出评价。
3实验教学效果
3.1实验秩序
该次实验教学经过对参与实验的学生提前分组，以小组为单位实
行实验方案的设计和准备，然后独立完成实验操作以及数据的记录和
整理计算，发现除个别组准备不充分，仪器操作不够熟练外，其余组
都实行了充分的资料收集和器材准备，实验实行得有条不紊，井然有序。完全不同于之前实验课中无准备、无目的性地照着板书上实验步
骤呆板地称量加样、少数学生动手多数学生在实验室中转圈、依赖老
师操作仪器等状况。准备不充分的小组在看到别的小组实验进展顺利
时明显感受到了压力，这将对以后的实验准备工作起到一定的督促作
用。
3.2改进效果
从蜂场采集的新鲜蜂蜜淀粉酶值一般在8-10之间，测定过程至
少需要持续30-45min，5min测定一次则需要测定10-15次，国标中样
品混合液能够待检15次，而碘溶液只有1支，测定过程中需要持续重
装碘溶液，碘溶液的温度得不到保证，且学生需要持续在实验室中来
回走动，造成秩序混乱。温度是影响酶促反应的决定性因素，反应温
度的差异将会直接导致酶促反应的快慢不一致，致使最终计算出的淀
粉酶值出现误差。改进后的国标法直接准备好15支碘溶液，需要测定
时随取随用，既避免了实验过程中学生频繁找试管、洗试管、重装碘
溶液的麻烦，保证了实验温度的一致性和实验结果的精确度，又使实
验实行得井然有序，保障了实验秩序。分光光度计一般只有4个比色
皿槽，其中1个要加入空白对照，仅余下3个槽位能够放置待检样品，放置好后需要手动拉杆检测，检测样品少，且需要时间比较长。另外
比色皿需要即时清洗、再用待检液漂洗，在本实验中样品需要5min检
测一次，就会显得手忙脚乱，导致实验结果出现不可避免的误差。而
全自动酶标仪具有连续波长，波长选择范围比较大，能够满足不同波
长的需求。可检测比色皿、24孔板、96孔板等。实验中使用可拆分96孔酶标板，可同时检测96个样品，即使一个小组1条，也能够同时检
测12个小组的样品。且全自动酶标仪能够自动进样，然后实行扫描检测，只要提前在电脑上设计好板的布局，将酶标板放在检测台上，点
击“检测”就能够了，检出结果会自动扣除空白或者阴性对照，一目
了然。既避免了实验过程中清洗比色皿更换样品的环节，又缩短了学
生等待检测的时间，减少了实验误差，有效保障了实验数据和结果的
准确性。
3.3考核结果
鉴于本科实验教学中学生的独立性稍差，无法单独完成整个实验设计及具体操作，所以采用小组内团队合作的形式实行实验。在考核时要兼顾到小组的整体成果和小组内个人的贡献和表现。在对每个小组的实验过程实行考核时发现绝绝大多数小组对数据的记录、整理、计算等非常清晰，课后能够对实验过程和实验结果实行完整的总结汇报和准确的结果分析，甚至有的小组还配备了图片说明实验过程中随时间变化淀粉酶分解淀粉后剩余淀粉和碘溶液反应产生颜色的变化过程。表明学生在实验过程中对出现的结果及数据变化实行了充分的思考和分析，这次实验教学的改进充分调动了学生的实践动手热情，也促动了高校对创新型人才的培养。
4结语
“民以食为天，食以安为先”，国标进课堂实行蜂蜜的卫生检验，缩短了高校与社会之间的距离，激发了学生的学习热情。而改进后的国标法应用于实验教学保障了实验结果的准确性，减少了误差。同时高值精密仪器的使用也拓宽了学生的视野13，调动了学习的积极性，
提升了实践动手水平，收到了超出预期的实验教学效果。
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蜂蜜淀粉酶值实验教学改革与创新
淀粉酶含量测定
淀粉酶(AMS)测定试剂盒说明书 (碘-淀粉比色法) 一、 原理： 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，家人碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMS 的活力。 二、 试剂组成与配制：（100T ） 1、0.4mg/ml 底物缓冲液：60ml ×1瓶，4℃冰箱保存6个月。 2、0.1mol/L 碘贮备液：7ml ×1瓶，4℃避光保存6个月。 0.01mol/L 碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。 三、 操作表： 测定管（u 管） 空白管（0管） 底物缓冲液（ml ）37℃预温5分钟 0.5 0.5 待测样本（ml ） 0.1 混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟 碘应用液（ml ） 0.5 0.5 蒸馏水（ml ） 3.0 3.1 混匀，660nm 波长，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 *注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度，将 （空白OD-测定OD 控制在0.05～0.150之间） 四、 计算： 1、 单位定义：100ml 血清（浆）中的AMS ，在37℃与底物作用30分钟，水解10mg 淀粉为1个单位。 2、公式： 样本测试前稀释倍数空白管吸光度 测定管吸光度空白管吸光度样本测试前稀释倍数分钟分钟空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度??-=?????-=801 .01005.730105.04.0dl AMSu （此公式适用于测定血清中淀粉酶）
血清淀粉酶的含量测定 一、实验准备： 1、实验器材：移液枪（100~1000ul、10~100ul、1000~5000ul、2~20ul）、5mlEP管、0.5mlEP 管、比色皿、100ml烧杯、漩涡仪、水浴箱，分光光度计、计时器。 2、实验药品：NaCl、蒸馏水、0.4mg/ml底物缓冲液、0.1mol/L碘贮备液。 二、实验步骤： 1、0.01mol/L碘应用液的配制： 将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。 2、生理盐水的配置： 称取9gNaCl置100ml烧杯，加入100ml蒸馏水，溶解即得。 3、样品最佳取样浓度摸索： 取待测血清用生理盐水稀释成不同比例（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍等倍数进行稀释），取0.1ml进行检测。 取两个5mlEP管，标记为空白、血清所稀释的倍数，分别加入底物缓冲液0.5ml，其中带有倍数的EP管加入相应的稀释好的血清0.1ml，于漩涡仪上混匀，同时放入37℃水浴箱反应7.5分钟，取出后各加入0.5ml 0.01mol/L 碘应用液，空白管加入3.1ml蒸馏水，带有倍数的EP管加入3.1ml蒸馏水，混匀，蒸馏水调零，迅速于660nm波长测定吸光度，控制空白OD-测定OD在0.05~0.150之间。 4、样品测定： 将所需测定样品按摸索确定的倍数稀释，同法测定吸光度，记录数据。 5、数据处理：按给定公式计算待测血清淀粉酶含量。 注：加入碘应用液后不能长时间放置，否则碘见光分解后影响测定结果
淀粉酶活力测定实验报告
淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热 恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6
的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。
澳大利亚蜂蜜中的羟甲基糠醛与淀粉酶含量
澳大利亚蜂蜜中的羟甲基糠醛与淀粉酶含量 摘要 澳洲蜂蜜样品(加工及未加工)的质量是用来评估HPLC技术。羟甲基糠醛作为主要的质量指标。包括四个经过商业加工的蜂蜜样品（澳大利亚雨林,Beechworth、homebrand和Leabrook)和三个未加工的蜂蜜样品(Banksia、灰盒子和Mallee)。所有样品,除了Leabrook和Beechworth,中的初始羟甲基糠醛(HMF)含量低于法典委员会标准和国际蜂蜜标准(40毫克/公斤)外，其余样品都高出标准。Leabrook和Beechworth中的羟甲基糠醛分别为50.8±1.34毫克/公斤和74.9 ±234毫克/公斤。在85°加热未加工的蜂蜜2分钟造成显著(p≤ 0.05)蓄积的羟甲基糠醛含量。在85°C加热2分钟后Mallee的样品中羟甲基糠醛的量从34.0±0.31增加到42.3±0.37毫克/公斤。所有的蜂蜜淀粉酶活性样品显示超过最低限度(8 Gothes)。蜂蜜成品的理化性质的变化有明显的样品。结果显示,加热也并不是唯一的影响羟甲基糠醛(HMF)在蜂蜜中形成的因素,还有蜂蜜的成分、pH值和植物源可导致这些变化。因此,一定数量的羟甲基糠醛(HMF)可能不是一个唯一的蜂蜜质量指标。 关键词: 羟甲基糠醛;Gothe单位数,淀粉酶活性;加工过的蜂蜜；新鲜蜂蜜。 1．介绍 澳大利亚新西兰食品标准 (FSANZ,2006年)规定了蜂蜜的定义即蜜蜂是从花朵或植物的生命部位所分泌的物质中制造出的自然甜美的物质。它必须包含至少60%的还原糖和不超过21%的水分。蜂蜜成分是高度受到蜂蜜所采的花朵的类型、区域和气候条件的影响(门德斯,Proenca、费雷拉、和费雷拉,1998)。 澳大利亚是世界上第四大蜂蜜出口国。在澳大利亚蜂蜜行业每年至少价值达6500万美元。新南威尔士是蜂蜜的主要生产者,占总产量的45%。制造出的蜂蜜有一半是在国内消费的,而剩下的则出口(澳大利亚蜂蜜工业委员会,2004年)。在澳大利亚桉树代表了生产蜂蜜的主要本土植物(78%)（吉布斯和Muirhead，1998)。约有95%的桉树构成了安大利亚的植被,统治了森林植被中的约550-600个不同类型的物种和品种,还有许多杂交物种(凯莉,1983)。 加热新鲜蜂蜜通常是为了方便加工和保持良好的质量。然而过度热处理会形成羟甲基糠醛(HMF)以及降低蜂蜜质量。羟甲基糠醛的量在新鲜蜂蜜中几乎没有或很低 ,而在加热过的蜂蜜中含量很高,它们储存在不适当的条件,或搀假在逆变糖浆中(Nozal伯纳作了开题报告,Toribio,希门尼斯,马丁,先后,2001)。蜂蜜的理化性质如酸碱度,矿物含量和总酸度也会影响羟甲基糠醛含量。在有机酸存在和低水分活动的情况下,也会影响产品中的羟甲基糠醛含量 (Kalabova ,Borkovcova ,Smutna,和Vecerek,2003)。食品法典(2001)和国际蜂蜜委员会 (2002)设定了最大的羟甲基糠醛浓度：非热带地
实验七尿淀粉酶活性测定
实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和 唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液（自备）。 2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液 体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。依此类推，如此继续稀释 至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
(植物中)淀粉酶活性的测定
(植物中)淀粉酶活性的测定 一实验目的 本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。 二实验原理 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。 α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。 三实验材料 萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右） 四实验仪器和试剂 1．仪器： 电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管[25mL（9个）、10mL（1个）]、试管6支、移液管[1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计 2．试剂： 1％淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、 pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL 混匀即是。 3,5－二硝基水杨酸：精确称取3,5－二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH 中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。 麦芽糖标准液：称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 五操作步骤 1．酶液的提取： 称取萌发的水稻种子0.5g（芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。 2．α－淀粉酶活性的测定： （1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。 （2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。
淀粉酶活性的测定
淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。 （三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；4.1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 三、实验步骤 （一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线. （二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm 下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。 （三）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）进行操作。（四）结果计算：淀粉酶活力=C×V T/(W×V s×T)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
蜂蜜掺假检测方法分析总结
蜂蜜掺假检测方法分析总结 李兆锦广东医科大学药理学 [摘要]蜂蜜具有较高的营养价值和保健功能,深受消费者的青睐，但猖狂的掺假行为与复杂多样的掺假手段已成为社会关注的焦点。本文综述分析了目前各种蜂蜜掺假鉴别技术的优缺点，对新的检测技术进行展望。 [关键词]蜂蜜；检测；掺假 在最新国家蜂蜜标准GB 14963-2011中，首先规定了蜂蜜的含义，即“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物融合后，经充分酿造而成的天然甜物质”。其成分复杂包括蛋白质、氨基酸、维生素、有机酸、色素、蜂花粉、激素、微量元素等[1]。《神农本草经》把“石蜜、蜂子、蜜蜡”列为上品，指出有“除百病、和百药”的作用，且“多服久服不伤人。” 《蜜蜂赋》中写道：“散似甘露，凝如割脂，冰鲜玉润，髓滑兰香。百药须之以谐和，扁鹊得之而术良。”可见其营养价值和功效之高，不法分子在巨大的商业利益驱动下，大肆作假，极大损害了蜂农、消费者和正规蜂蜜生产企业的利益。然而蜂蜜成分复杂、内部组分含量变化范围大等特征使得掺假造假容易，也使得蜂蜜品质检测技术遇到了很大的挑战。为使我国蜂蜜产业的健康发展，对建立一套灵敏、高效、准确的蜂蜜掺假鉴定方法具有非常重要的意义与价值，为建立蜂蜜掺假鉴定方法提供理论依据与实施基础。 1.造假手段 蜂蜜造假手段越来越多，随着检测方法的不断发展，造假手段也越来越多。但总的可分为以下几种[2]：（1）直接往蜂蜜中添加白糖或其他糖分（2）给蜜蜂喂食糖水（3）用白糖、明矾、香精等调出全假蜂蜜[3]。 2.鉴别方法 2.1传统鉴别法 对于一般的消费者来说，掌握一些普通简单的鉴别蜂蜜真假的方法尤为重要。首先是观察其颜色深浅，是否有光泽以及其组织状态是否呈胶体状，有无沉淀、杂质、气泡等；嗅其气味是否清香宜人；最后是品尝其滋味，感知味道是否清甜纯正，有无苦涩、酸和金属味等不良滋味以及麻舌感[4]。与蜂蜜接触最多的蜂农，他们建议，对于优劣蜂蜜，可以从如下几个方面进行区分[5]：第一，用碘酒判断是否有添加物。挑出一点蜜，兑入一两滴碘酒，如果蜂蜜变色（变色后为黑色略带蓝色）则说明该蜂蜜经过了后期加工，添加了白糖等物质。如果滴入碘酒不褪色，则说明该蜂蜜为正宗蜂蜜。第二，用纸巾检测是否含有水分。取一点蜂蜜放在纸巾上，如果蜂蜜很快扩散，说明其中添加了水分。反之，则说明该蜂蜜中没有添加水分，是比较纯的蜜。第三，看蜂蜜是否会结晶。一般而言，如果蜜糖好的话，会随着气温降低而产生结晶（如凝固的猪油一般）。而假蜂蜜一般不结晶。不过如果假蜂蜜中加入白糖，在一定条件下也会出现类似结晶的东西，在瓶底形成沉淀。但真蜂蜜结晶较为松软，放在手上很容易捻化，假蜂蜜析出的白糖沉淀较为致密，放在手上时，会有沙砾感。第四，纯正的蜂蜜表面无大量气泡，掺有淀粉的蜂蜜，会显得混浊不清，透明度差。第五，优质蜂蜜口感醇厚、回味绵长，给人一种芳香甜润的感觉，或有极轻微的淡酸味；质量较次或假蜂蜜，则会出现除香甜味外的其他异味，如掺糖蜜，白糖味较浓，掺淀粉的蜜，甜度下降香
淀粉酶活性测定实验报告
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：03 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。
蜂蜜淀粉酶值实验教学改革与创新
蜂蜜淀粉酶值实验教学改革与创新 【摘要】蜂蜜淀粉酶值检测是控制蜂蜜产品质量和安全的重要指 标之一。为促动高校与社会食品检验方法的衔接，激发学生的学习热情，山东农业大学卫生检验教研组采用最新国标检测方法取代陈旧方 法应用于蜂蜜淀粉酶值实验教学。在实施的过程中，通过增加碘溶液 预热管数保证淀粉酶酶促反应温度的一致性，采用全自动酶标仪替代 分光光度计提升学生实验效率等改进措施，提升了实验数据和结果的 精确度和准确性，改善了实验教学秩序，确保了国标检测方法法在蜂 蜜淀粉酶值实验教学中的应用。 关键词：实验教学；国标法；蜂蜜淀粉酶值；改进 蜂蜜的营养价值很高，口感独特，深受消费者欢迎1-2。在蜂蜜 所含有的一系列营养物质中，生物酶是其主要的生物活性物质，其中 淀粉酶的含量最高，能够促动人体对食物的消化和营养物质的吸收3-4。但当前市场上蜂蜜产品的质量参差不齐，真假难辨5-8。而蜂蜜淀粉酶活性的检测是控制商品化蜂蜜产品质量和安全的重要指标之一9-10。 蜂蜜淀粉酶值的检测方法有试管比色法和分光光度计法，其中分光光 度计法是最新的国家标准方法11-12。紧跟时代的步伐，与时俱进是高校实验教学改革的灵魂，促动实验教学内容的革新对于学生掌握新概念、新知识、新技能，开阔视野和思路具有极为重要的意义。为和社 会衔接，学校对蜂蜜淀粉酶值检测的实验教学实行了一系列的改革， 其中“国标进课堂”取代陈旧实验方法就是其中一项重要举措。在改
革的过程中发现实验教学不同于简单的实验验证，需要几十人同时实行，涉及到仪器、耗材、场地的共享使用，简单地照搬照抄国标方法并不能直接用于实验教学。为使国标法更好地适合实验教学，山东农业大学动物科技学院卫生检验教研组对蜂蜜淀粉酶值检测的部分内容实行了改革和创新。 1实验方案的设计 1.1材料 1.1.1蜂蜜 来源于山东泰安某养蜂场的新鲜百花蜜。 1.1.2试剂及配制
测定α-淀粉酶活力的方法
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH 对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定a-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。 温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH 范围内酶活力可达最高，在最适PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级a - 淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、 黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对 淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。a -淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的a -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称 a -淀 粉酶为液化淀粉酶。a -淀粉酶不能水解淀粉支链的 a -1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽 糖、葡萄糖和a -1,6 键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪a -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响 （一）试剂及材料 1、1: 30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1: 30倍蒸馏水稀释。
蜂蜜中掺伪鉴别检验方法论述
蜂蜜中掺伪鉴别检验方法论述 姓名：叶泳班级：食安1201 学号：1201070522 摘要：淀粉酶在真假蜂蜜鉴别中的应用天然蜂蜜中的淀粉酶来源于蜜蜂，而不是花粉或花蜜，说明天然蜂蜜中的淀粉酶是一种动物来源淀粉酶。通常动物性酶的稳定性较差，其活性极易受到外界温度的影响，随着时间的延长，活性下降。天然蜂蜜淀粉酶值和蛋白质含量在储存过程中有相似的变化规律，即低温时，淀粉酶值和蛋白质含量都基本保持不变，但是随着储存温度提高和储存时间延长，样品的淀粉酶值和蛋白质含量迅速降低。 一、淀粉酶在真假蜂蜜鉴别中的应用【1】 天然蜂蜜中的淀粉酶来源于蜜蜂，而不是花粉或花蜜，说明天然蜂蜜中的淀粉酶是一种动物来源淀粉酶。通常动物性酶的稳定性较差，其活性极易受到外界温度的影响，随着时间的延长，活性下降。天然蜂蜜淀粉酶值和蛋白质含量在储存过程中有相似的变化规律，即低温时，淀粉酶值和蛋白质含量都基本保持不变，但是随着储存温度提高和储存时间延长，样品的淀粉酶值和蛋白质含量迅速降低。在储存过程中，天然蜂蜜淀粉酶值的变化与其蛋白质的变化密切相关，蛋白质在储存过程中降解可能是天然蜂蜜淀粉酶值降低的直接原因。与天然蜂蜜相反，掺假蜂蜜的淀粉酶值和蛋白质含量基本不受储存温度及时间的影响，这与假蜂蜜中添加的工业淀粉酶(诺维信耐温淀粉酶)的耐高温特性密切相关。通过跟踪测定蜂蜜的淀粉酶值变化可以判断蜂蜜产品是否掺假，同时也可以判定天然蜂蜜产品的新鲜程度 二、旋光法在检验蜂蜜中掺入糖类的应用【2】 由于不同种类的蜂蜜都有相对稳定的旋光度，一般为左旋。当掺入不同糖类后，蜂蜜的旋光度会发生变化，并随掺糖浓度的不同而有规律的变化，掺人蔗糖的蜂蜜，随着掺糖量的增加，其旋光度向右旋变化，掺入果糖或转化糖后，其变化趋势相反。通过测定其旋光度，判定蜂蜜的真伪以及掺假的浓度，但是蜂蜜样品pH及测定温度均会影响测定值的准确性。因此，测定过程中应控制合适的温度及pH，并使用醋酸铅作为澄清剂，沉淀蛋白质等大分子物质。 三、色谱分析法在蜂蜜品质鉴别中的应用 采用气相色谱、气液色谱、高压液相色谱、反向高效液相色谱、毛细管气相色谱等方法分析测定蜂蜜中的杀虫剂、杀螨剂、蜜蜂驱避剂及其代谢产物的残留
α–淀粉酶活力测定
α–淀粉酶活力测定 ----目视碘比色法 一实验目的 1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。 2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。 二、实验原理 比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。 酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。 淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。 碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。 三、实验操作 1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。 2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。
3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。 4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。 5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。 6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。 四、酶活性计算 实验注意事项： （1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。 （2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。 （3）应时间大约在10-15分钟。 （4）稀释倍数1250倍。
淀粉酶活性的测定
淀粉酶活性的测定 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。植物中有α–淀粉酶和β–淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。通过本实验掌握淀粉酶的提取和测定方法。 一、原理 α–淀粉酶和β–淀粉酶，各有其一定的特性，如β–淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α–淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70℃维持15 min以钝化β–淀粉酶，便可测定α–淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理，钝化α–淀粉酶，以求出β–淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5–二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 萌发的小麦（芽长1 cm左右）。 （二）试剂 1. 1％淀粉：称取1.0g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH 5.6的柠檬酸缓冲液中。 2. 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01 g，溶解后稀释至l000 mL；B液：称取柠檬酸钠29.41 g，溶解后稀释至1000 mL。取A液55 mL与B液145 mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。 3. 3, 5–二硝基水杨酸溶液：精确称取3, 5–二硝基水杨酸1 g溶于20 mL 2 mol/L氢氧化钠中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100 mL，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。 4. 麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100 g溶于少量蒸馏水中，仔细移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 （三）仪器设备 小台秤，研钵，容量瓶100 mL，具塞刻度试管，试管，刻度吸管l mL 2 mL 10 mL，离心机，恒温水浴，分光光度计。 三、实验步骤 1. 酶液的提取称取1.0 g萌发的小麦种子，置研钵中加2 mL蒸馏水和少量石英砂，研磨成匀浆后转入离心管中，用7mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10 min，将上清液倒入50mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上速淀粉酶原液5mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。2．麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表35–1加入试剂： 表35–1 制作麦芽糖标准曲线配方表 试剂管号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
淀粉酶活性测定实验报告
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α-淀粉酶、萌动种子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。
本实验的目的在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和测定方法。 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。 三、材料、试剂与仪器 实验材料：
高效液相色谱_二极管阵列检测法检测蜂蜜中外源性_淀粉酶残留量
第5卷 第10期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 10 2014年10月 Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014 基金项目: 国家科技支撑计划项目(2012BAK17B10)、江苏省“333工程”科研项目(BRA2013276)、江苏出入境检验检疫局科研项目(2011KJ40) Fund : Supported by the National Key Technology Support Program (2012BAK17B10), the Research Program of 333 Engineering in Jiangsu Province (2010CBB02301) and the Technology Program of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau (2011KJ40) *通讯作者: 费晓庆, 工程师, 主要研究方向为食品检测和食品掺假鉴定研究。E-mail: dii01208@https://www.wendangku.net/doc/3f1169717.html, *Corresponding author: FEI Xiao-Qing, Engineer, Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, No. 99, Zhonghua Road, Nanjing 210001, China. E-mail: dii01208@https://www.wendangku.net/doc/3f1169717.html, 高效液相色谱-二极管阵列检测法检测蜂蜜 中外源性γ-淀粉酶残留量 费晓庆1*, 谭梦茹2, 张 睿1, 沈崇钰1, 吴 斌1, 丁 涛1, 杨功俊2 (1. 江苏出入境检验检疫局食品实验室, 南京 210001; 2. 中国药科大学药学院, 南京 211198) 摘 要: 目的 利用高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)测定蜂蜜中外源性γ-淀粉酶残留量。 方法 选取对硝基苯-β-D -麦芽三糖作为γ-淀粉酶的酶解底物, 于55 ℃和pH 4.50的0.10 mol/L 乙酸钠缓冲液中反应90 min 。采用C 18柱分离底物和酶解产物对硝基苯-β-D -葡萄糖, 流动相为乙腈/水(15:85, v :v )。通过测定酶解产物的含量来确定γ-淀粉酶残留量。结果 本方法的线性范围为1~50 U/kg, 定量限为1 U/kg, 回收率在94.0%~107.2%之间, 相对标准偏差在3.2%~5.1%之间。采用本方法对市售蜂蜜和淀粉类糖浆共58个样本进行考察, γ-淀粉酶检出率为79.3%。采用本方法测定一个掺入5%淀粉类糖浆的蜂蜜, 测得γ-淀粉酶残留量为3.6 U/kg 。结论 本方法能够有效地从酶学的角度快速鉴定蜂蜜中淀粉类糖浆的掺假。 关键词: γ-淀粉酶残留量; 蜂蜜掺假鉴定; 高效液相色谱-二极管阵列检测法 Determination of the exogenous γ-amylase residue in honey by high perfor-mance liquid chromatography-diode array detector FEI Xiao-Qing 1*, TAN Meng-Ru 2, ZHANG Rui 1, SHEN Chong-Yu 1, WU Bin 1, DING Tao 1, GONG Jun-Yang 2 (1. Laboratory of Food , Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau , Nanjing 210001, China ; 2. College of Pharmacy , China Pharmaceutical University , Nanjing 211198, China ) ABSTRACT: Objective To develop a new method for determination of exogenous γ-amylase activity in honey using high performance liquid chromatography-diode array detector (HPLC-DAD). Methods 4-nitrophenyl beta-D -maltotriose was chosen as the substrate of γ-amylase. This enzymatic reaction was under the condition of 55 ℃ and 0.10 mol/L sodium acetate-acetic acid buffer solution (pH 4.50) for 90 min. Sub-strate and enzymatic hydrolysate 4-nitrophenyl beta-D -gulcose were separated by high performance liquid chromatography on a C 18 column. Isocratic elution was employed with a mobile phase consisting of acetoni-trile/water (15:85, v :v ). By identifying the content of enzymatic hydrolysate at 310 nm, the residue of γ-amylase in honey could be determined. Results The method showed a good linearity between the concentration and peak area with the correlation coefficient over than 0.999. The linear range of γ-amylase was 1~50 U/kg with
生化实验--淀粉酶活性测定标准实验报告
实验二：酶活力测定方法的研究 一．研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。本实验选取萌发的禾谷类种子为材料，通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。 二．实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α淀粉酶和β淀粉酶，β淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化[1]。本实验的设计利用β淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β淀粉酶钝化而测定α淀粉酶的酶活性[1]。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性，拟将总活性与α淀粉酶的活性的差值看作β淀粉酶的活性，再做进一步分析。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 三．材料、试剂与仪器 材料： 萌发的小麦种子 试剂： ①1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）； ②pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）
B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml 混匀即可； ③3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M 氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）； ④麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml 容量瓶中定容）； ⑤0.4M NaOH 仪器： 722光栅分光光度计(编号990695) DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) 离心机(TDL-40B) 配平天平药物天平电热锅 100ml容量瓶50ml容量瓶移液管试管研钵烧杯洗瓶 四．实验方法 本实验按照下列表格的中的操作步骤进行：