特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑体外联合抗白念珠菌的作用
文章编号:1001-8689(2005)09-0568-04
特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑体外联合抗白念珠菌的作用
江惟苏 陈荣 谭升顺*
陈庆秀
(西安交通大学第二医院, 西安710004)
摘要: 目的 探讨特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑体外联合抗白念珠菌的作用。方法 采用微量液体稀释法测定特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑对生殖器部位分离的36株白念珠菌药敏试验,应用棋盘微量稀释法测定特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑对36株白念珠菌的联合药敏试验。结果 白念珠菌菌株对氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬耐药株分别为3株(8.33%)、4株(11.11%)、6株(16.67%)。特比萘芬和氟康唑联用M I C 几何平均数较其单独应用均显著降低(t =3.590,P <0.05;t =3.252,P <0.05),15株有协同作用(42%),18株有相加作用(50%),3株无关作用(8%);特比萘芬和伊曲康唑联用后的M IC 几何平均数较其单独应用均显著降低(t =3.849,P <0.001;t =2.409,P <0.05),表现为协同作用有14株(39%),相加作用的有17株(47%),无关作用的有5株(14%);均未发现拮抗作用。结论 特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑联合应用对大部分白念珠菌能产生协同作用和相加作用,提示特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑联合应用能增强抗白念珠菌的作用。
关键词: 白念珠菌; 氟康唑; 伊曲康唑; 特比萘芬中图分类号:R379.4 文献标识码:A
In vitro interaction of terbinafine with fluconazole or
itraconazole against Candida albicans
Jiang W ei-su, Chen Rong , Tan Sheng -shun and Chen Qing -x iu
(T he Second Hospital of Xi ′an Jiaoto ng U niv ersity, Xi ′an 710004)
ABSTRACT Objective To inv estig ate the inter action betw een terbinafine and fluconazole or itr aconazole
against Candida albicans . M ethods T he minimum inhibitory concentrations (M IC )o f 36clinical iso lates of Candid a albicans from g enital locus w as determined by br oth m icrodilution method recom mended by N CCLS.A checkerbo ar d micro dilution method w as used to study the in vitr o interaction of terbinafine w ith fluconazole or itraconazole . Results T he incidence of Candida albicans resistant isolates w ere 8.33%(fluco nazo le ),11.11%(itraconazole)and 16.67%(terbinalfine).The geometric mean MIC of terbinafine co mbinated w ith fluconazole w as significantly low er than that o f the single ag ent (t =3.590,P <0.05;t =3.25,P <0.05).Fo rty-tw o percent (15/36)of interactions w er e synerg y,fifty per cent (18/36)additive,and eig ht percent (3/36)indifferent .T er binafine in combination w ith itr aconazole significantly r educed the geometric mean MIC than the single ag ent (t =3.849,P <0.001;t =2.409,P <0.05).39%(14/36)o f interactio ns w ere synergy ,47%(17/36)w ere additive,and 14%(5/36)w er e indiffer ent.A ntagonism w as not observed in any drug co mbinatio n . Conclusio ns T he combination of terbinafine w ith either fluconazole or itraconazole can pr oduce sy nerg ism and /o r additio n in most strains of Candida albicans in vitr o .
KEY WORDS Candida albicans ; Terbinafine; Fluconazole; Itraconazole 收稿日期:2005-01-27
作者简介:江惟苏,男,生于1964年,博士,副教授。主要从事皮肤性病学研究。现在中山大学东华医院皮肤科工作。
白念珠菌是一种临床上常见的条件致病性真菌,属真菌界半知菌亚门-芽孢菌纲-隐球酵母目-念珠菌属。免疫力正常的机体内一般很少出现临床症状,但当机体菌群失调、免疫功能下降或免疫力丧失,其感染率
和发病率可迅速升高[1],造成抗真菌药物的广泛应用,真菌耐药问题日趋严重。目前临床上使用的抗真菌药物选择性差,普遍存在较大的毒副作用、抗真菌谱较窄
和易产生耐药性等缺点,绝大部分真菌对目前临床上
常用的抗真菌药物都能产生耐药性,因此,如何合理利用现有的有限的毒副作用小、抗真菌效果好的药物提高真菌病的治愈率、减少耐药性真菌的产生,是抗真菌研究的一个重要方向。为此,我们进特行了特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑体外联合抗白念珠菌的作用的研究,现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
36株白念珠菌于2001年10月至2003年1月从我院皮肤科门诊和赣南医学院附属医院皮肤科门诊的不同患者的临床标本中分离获得,经形态学、SDA培养、生化鉴定及PCR证实为白念珠菌,并按分离时间前后依次编号,其中来自泌尿生殖道27株,包皮龟头9株;患者年龄(17～64)岁,平均年龄30岁。
1.2 白念珠菌A TCC标准株
YO109(AT CC7661509)为标准敏感株;YO119 (AT CC7661519)为标准耐药株,均来自中国医学科院皮肤病研究所。
1.3 参照菌株
近平滑念珠菌AT CC22019,来自中国医学科学院皮肤病研究所。
1.4 抗真菌药物
特比萘芬(T BNF)原粉来自北京诺华制药公司,批号040120,纯度99.9%;氟康唑(FCZ)原粉来自上海三维制药公司,批号20031206,纯度99.8%;伊曲康唑(IT RZ)原粉来自四川倍特制药公司,批号20040801,纯度99.6%。
1.5 主要试剂及培养基
RPMI1640粉为美国Gibco公司产品,吗啡啉丙磺酸(M OPS)粉购自Sig ma公司,二甲基亚砜(DM SO)由Merck公司生产。沙堡葡萄糖琼脂培养基和RPMI1640液体培养基自配。
1.6 体外抗真菌药物敏感试验
参照美国国家临床实验标准化委员会推荐的M27-A方案进行微量液体稀释法进行实验[2]。
(1)药物贮存液的配制 特比萘芬、伊曲康唑溶于二甲基亚砜溶液中,质量浓度分别为12800和1600 g/m l,氟康唑用双蒸水溶解,制成质量浓度为1280 g/m l贮存液,-20℃贮存备用。
(2)药物应用液的制备 单用药敏试验将药物贮存液用RPMI1640液体培养基稀释,特比萘芬的起始质量浓度为256 g/ml,氟康唑为256 g/ml,伊曲康唑为16 g/m l,再倍比稀释,使特比萘芬终质量浓度为0.50～256 g/m l,氟康唑终质量浓度为0.50～256 g/m l,伊曲康唑为0.03～16 g/ml。联合药敏试验特比萘芬的起始质量浓度为64 g/m l,氟康唑为64 g/ ml,伊曲康唑为4 g/m l,再倍比稀释,使特比萘芬、氟康唑终质量浓度为0.5～64 g/m l,伊曲康唑为0.03～4 g/m l。
(3)单用药敏反应板的制备 将上述倍比稀释药液由高到低不同的药物浓度依次加入到96孔细胞培养板中,每行第1～10孔加药液100 l,第11孔加入RPMI1640培养液(不含药物)100 l作为阳性对照孔,第12孔加入RPM I1640培养液200 l(不含药液)作为阴性空白对照孔,特比萘芬起始浓度为256 g/m l,终末浓度为0.50 g/ml,氟康唑的起始浓度为256 g/m,终末浓度均为0.50 g/m l,伊曲康唑起始浓度为16 g/ ml,终末浓度为0.03 g/ml。制备的药敏板密封后置-20℃冰箱贮存备用。
(4)联合药敏反应板制备 采用棋盘滴定法[3,4]将不同质量浓度的两种联用的药物各50 l加入96孔细胞培养板第1～8孔中,第9孔加入RPM I1640培养液(不含药物)100 l作为阳性对照孔,第10孔加入RPMI1640培养液200 l(不含药液)作为阴性空白对照孔。每次配制药敏板时均制备质控菌药敏板。制备的药敏板密封后置-20℃冰箱贮存备用。
(5)菌液制备 受试的白念珠菌菌株及AT CC标准株分别在沙氏培养基上转种二次,均于35℃培养24h,以确保其纯度和生长活力。选择5个直径大于1mm的菌落用0.85%盐水制成悬液,血细胞计数板计数后浓度调整至(1～5)×106CFU/m l,然后用RPMI1640作1∶50稀释,再用RPM I1640作1∶20稀释,得到备用菌液浓度为(1～5)×103CFU/ml。
(6)菌液接种 将贮存备用冷冻的药敏反应板取出按4℃、室温各放置1h,融化后,分别依次加入备用菌液100 l于药敏反应板的药敏孔和阳性对照孔。此时联合药敏反应板中第1～8孔中特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑的质量浓度依次均稀释了4倍,将接种好的药敏板置35℃恒温箱培养48h。
(7)MIC值的判定及药敏判定 培养48h后,与生长阳性对照孔及阴性空白对照孔进行比较,用视觉法判定终点[2～4]。特比萘芬[5]M IC≥32 g/m l为耐药菌株(R),8～16 g/ml为剂量依赖敏感菌株,≤4 g/ml为敏感菌株(S);氟康唑M IC≥64 g/m l为耐药菌株(R),16～32 g/ml为剂量依赖敏感菌株,≤8 g/m l为敏感菌株(S);伊曲康唑MIC≥1 g/m l为耐药菌株(R),0.25～0.50 g/m l为剂量依赖敏感菌株,≤0.125 g/ml为敏感菌株。
(8)FIC值 观察结果后计算FIC值,FIC值为联合用药时各药的最低抑菌浓度分别除以各药的MIC 值的商之和[3,4],联合用药药效果评价标准[3]:(a)FIC ≤0.5时两药有显著的协同效应;(b)FIC>0.5且≤1.0时两药有相同作用;(c)FIC> 1.0且≤2.0时为两药无关;(d)FIC> 2.0时两药有拮抗效应。
(9)统计处理 采用SPSS10.0软件对实验数据进行统计处理(t检验)。
2 结果
2.1 特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑对36株白念珠菌的M IC实验结果
从性病患者泌尿生殖器部位分离得到的36株白念珠菌的药敏实验中发现,对氟康唑耐药、敏感、剂量依赖的菌株分别为3株(8.33%)、29株(80.56%)、4株(11.11%);对伊曲康唑耐药、敏感、剂量依赖的菌株分别为4株(11.11%)、27株(75%)、5株(13.89%);对特比萘芬耐药、敏感、剂量依赖的菌株分别为6株(16.67%)、15株(41.67%)、15株(41.67%),结果见表1。8号菌株对特比萘芬(32 g/ml)、氟康唑(64 g/m l)、伊曲康唑(2 g/m l)均产生耐药;32号菌株对氟康唑(64 g/ml)、伊曲康唑(4 g/ml)均产生耐药; 26号菌株对伊曲康唑耐药(1 g/m l)、氟康唑(16 g/m l)为剂量依赖型;说明它们之间存在交叉耐药现象。
2.2特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑联合对白念珠菌药敏试验
特比萘芬、氟康唑单独应用M IC的范围分别为1～128和0.125～64 g/ml,M IC几何平均数分别为15.611和10.879 g/m l;联合用药后,特比萘芬、氟康唑的M IC范围分别降至为0.125～8和0.125～16 g/ ml,特比萘芬、氟康唑的M IC几何平均数分别为2.500和2.760 g/m l;特比萘芬和氟康唑联用后的
表1 特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑对临床36株
白念珠菌药敏试验结果
药 物
M IC
( g/ml)
药敏结果
(菌株数)
特比萘芬 ≥32 耐药(6)
8～16 剂量依赖(15)
≤4 敏感(15)
氟康唑 ≥64 耐药(3)
16～32 剂量依赖(4)
≤8 敏感(29)
伊曲康唑 ≥1 耐药(4)M IC几何平均数较其单独应用均显著降低(t=3.590, P<0.05;t=3.252,P<0.05),结果见表2。在联合应用中,15株有协同作用(41.67%),18株有相加作用(50%),3株无关作用(8.33%),未发现拮抗作用。特比萘芬和伊曲康唑联用后的M IC几何平均数较其单独应用均显著降低,特比萘芬从15.611 g/ml降至1.604 g/ml(t= 3.849,P<0.001);伊曲康唑从0.3374 g/ml降至0.082 g/m l(t=2.409,P<0.05),结果见表2。特比萘芬与伊曲康唑联用中,表现为协同作用有14株(38.89%),相加作用的有17株(47.22%),无关作用的有5株(13.89%),未发现拮抗作用。联合用药对耐药性念珠菌的药敏结果显示,特比萘芬与氟康唑联用,6株特比萘芬耐药株中有3株MIC 值降至敏感范围;3株氟康唑耐药株中有2株降为敏感株;特比萘芬与伊曲康唑联用后,5株特比萘芬耐药株降为敏感株;4株伊曲康唑耐药株中有2株降为敏感株;其余耐药菌株的M IC值均降至剂量依赖型范围。
表2 三种抗真菌药物单用及联用对36株白念珠菌
的M IC值范围和均值
药 物
M IC值范围
( g/ml)
M IC几何平均数
( g/ml)特比萘芬1～12815.611
氟康唑0.125～6410.879
伊曲康唑0.015～40.337
特比萘芬(+氟康唑)0.125～8 2.500
氟康唑(+特比萘芬)0.125～16 2.760
特比萘芬(+伊曲康唑)0.125～8 1.604
伊曲康唑(+特比萘芬)0.015～0.50.082
3 讨论
近年研究表明,单独应用唑类抗真菌药物可使真菌产生耐药性[6,7],特比萘芬与唑类药物联合应用可产生协同效应[3,8～10],对唑类耐药性真菌感染性疾病获得治愈[11]。本实验采用特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑联合应用进行抗白念珠菌的体外实验研究,特比萘芬与氟康唑联合应用中有15株有协同作用(41.67%), 18株有相加作用(50%),3株无关作用(8.33%),未发现拮抗作用;特比萘芬与伊曲康唑联用中表现有协同作用14株(38.89%),相加作用17株(47.22%),无关作用的有5株(13.89%),效果较好。主要原因可能是这两种药物抗真菌的作用机理不同,特比萘芬抗真菌的作用机理为高选择性抑制真菌角鲨烯环氧化酶[12],使真菌细胞膜形成受阻,起到抑菌作用;该药抑制角鲨烯环氧化酶后,其角鲨烯前体物质仍在真菌内大量积导致真菌细胞中毒死亡,从而起到杀菌作用。唑类
抗真菌作用机理抑制真菌膜中麦角固醇的细胞色素P450[13],使之失去酶活性,引起14a-甲基固醇的积聚及麦角固醇的缺失,从而起抑菌作用。因此,这两种药物通过作用于真菌生物合成的不同靶位,可产生协同效应[3,10,11],增强药物抗真菌作用的能力,提高疗效。
抗真菌药物联合应用主要有两个原因,一是阻止或延迟真菌对药物的耐药性,二是减少药物的剂量,从而降低药物的毒副作用。本实验显示,特比萘芬和氟康唑联用的M IC几何平均数较其单独应用均显著降低(P<0.05);特比萘芬和伊曲康唑联用后的M IC几何平均数较其单独应用均显著降低,特比萘芬从15.611 g/ml降至1.604 g/ml(P<0.001);伊曲康唑从0.3374 g/m l降至0.082 g/ml(P<0.05),特别是特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑联合应用产生协同效应及相加作用,抗念珠菌的有效治疗量可大大降低,减少了药物的毒副作用。本实验还显示,特比萘芬与氟康唑联用后,6株特比萘芬耐药株中,3株M IC值降至敏感范围;3株氟康唑耐药株中,2株降为敏感株;特比萘芬与伊曲康唑联用后,5株特比萘芬耐药株降为敏感株; 4株伊曲康唑耐药株中,2株降为敏感株;其余耐药菌株的M IC值均降至剂量依赖型范围。本实验结果与Barchiesi等的研究结果相似[14],说明特比萘芬与氟康唑或伊曲康唑联合应用可阻止或延迟白念珠菌耐药性菌株的产生。
参考文献
[1]韩旭东,张永信,章强强.白色念珠菌对氟康唑耐药性的诱
导和回复研究[J].中国抗生素杂志,2004,29(6):374 [2]N ational Co mmitt ee fo r Clinical Labo rat or y Standa rds.
R eference method for bro th dilution antifungal susceptibility testing o f y easts,Appro ved Sta ndard M27-A [S].Way ne,PA:NCCL S,1997,17(9):1
[3]M osquer a J,Sharp A,M oo re C B,et al.I n v itr o
int eraction o f ter binafine with itraco nazo le,fluco nazo le, amphot ericin B and5-flucy tosine against A sp er gillus spp.
[J].J A ntimicr ob Chemother,2002,50(2):189
[4]P erea S,Go nzalez G,A nnet te W,et al.I n v itr o a ct ivities
o f terbinafine in co mbina tio n w ith fluco nazo le, itra co nazo le,vor ico nazo le,and po sa co nazo le ag ainst clinical iso lat es of Cand id a glabr ata w ith decr eased
susceptibility to azo le[J].J Clin M icr obiol,2002,40(5): 1831
[5]王洪生,骆志成,武三卯,等.外阴阴道念珠菌病患者阴道
念珠菌对抗真菌药物的敏感性测量[J].临床皮肤科杂志, 2002,31(6):346
[6]Czaika V,T ietz H J,Schmalr eck A,et al.A ntifungal
susceptibility testing in chro nically r ecur rent v aginal candidiasis as basis for effective ther apy[J].My coses, 2000,43(Suppl2):45
[7]Evans E G.R esistance o f Candida species to antifungal
ag ent used in the tr eatment of ony cho myco sis:a rev iew o f curr ent pr oblems[J].Br J Der matol,1999,141(Suppl
56):33
[8]T e D or st hor st D T,V erw eij P E,M eis J F,et al.
Co mpar iso n of fra ct ional inhibitor y concent ration index w it h r espo nse surface mo deling for char acterizatio n o f in v itr o inter actio n of antifung als ag aint itr aco nazo le-susceptible a nd-resist ant A sp er gillus f umigatus isolates [J].A ntimicr ob A gents Chemother,2002,46(3):702
[9]W eig M,M uller F M.Sy ner g ism of vo r iconazole and
t er binafine ag ainst Candida albicans iso lat es fr om human immuno deficiency v ir us-infect ed patient s w ith o ro phar yng eal candidiasis[J].A ntimicrob A gents chemother,2001,45(3):966
[10]肖异株,李桂明.尼克霉素Z与氟康唑或特比萘芬抗白念
珠菌的体外实验[J].中华皮肤科杂志,2001,34(5):379 [11]Ghannoum M A,Elew ski B.Successful tr eatment o f
fluconazole-r esistant or ophary ng eal candidiasis by a combination o f fluco nazo le a nd ter binafine[J].Clin Diagn L ab I mmuuol,1999,6(6):921
[12]Ry der N S,W ag ner S S,Leitner I.I n vitr o activ ities o f
ter binafine against cutaneous isolates of Candida albicans and o ther pathog enic yeasts[J].A ntimicrob A gents Chemother,1998,42:1057
[13]Sheehan D J,Hitchcock C A,Sibley C M.Cur rent and
emerg ing azole ant ifung al agents[J].Clin M icrobiol,
1999,12:40
[14]Bar chiesi F,Falconi di Fr ancesco L,Compagnucci P,et
al.I n vitr o interaction of ter binafine with amphoter icin B,fluconazole and it ranconazole against clinical isolates of Candida albicans[J].J A ntimicr ob Chemother,1998,
41:59