西北农林科技大学-生物技术综合大实验

生物技术综合大实验——原核系统表达的

绿色荧光蛋白的纯化

宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新

（西北农林科技大学）

摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。

关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析

—

1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发

现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。

2.材料和方法

2.1.pGFP质粒克隆及提取

质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。

2.2.转化

取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。

2.3.筛选重组子及扩大培养

<

将平板放置紫外灯下检测，标记，挑取绿色荧光单菌落，于5mlLB（amp）培养基中37°C、150rpm震荡培养7小时——吸取2ml菌液，置于200mlLB（amp/ara）培养基中，37°C、150rpm振荡培养过夜。本组的平板并无可视菌落，所以挑去

他组菌落

2.4.收菌破碎

收集菌液200ml于250ml离心管，共4管，5000xg离心10min，弃上清——每管30ml溶解缓冲液（50mM Tris-HCl，1mmol/L EDTA）重悬沉淀，将4管合并为1

管——每管加入60μl溶菌酶，混匀

将离心管置于冰上，超声波破碎仪探头插入离心管，探头离底部约1cm且不触离心管壁——900w，超声3s，静止3s，共8min，重复3次——7500xg离心15min，在紫外灯下观察沉淀（留样）和上清（留样），取上清备用。

2.5.盐析

取上清定容至80ml——取10ml做预实验——用溶解缓冲液稀释至100ml——分装

至10只试管，每管10ml——称取不同浓度梯度(NH4)2SO4（见下表），室温静置

15min——各取1ml于离心管，7500rpm离心15min——在紫外灯下观察GFP沉淀情况，可看出，第五管（(NH4)2SO4含量50%）时出现沉淀（杂蛋白），第八管（(NH4)2SO4含量80%）沉淀量最大（GFP）——在剩余70ml上清中加入(NH4)2SO4（含量50%），室温静置30min——7500rpm离心15min，取上清——加入 g(NH4)2SO4（含量80%），

2.6.疏水层析

配制平衡缓冲液：2mol/ml(NH4)2SO4/TE,

/

start buffer A：ml(NH4)2SO4/TE,

洗脱缓冲液B：10mM Tris，1mM EDTA，

将沉淀好的GFP用10ml 平衡缓冲液溶解，9000rpm离心10min，移上清液至另一大离心管备用。

连接仪器，蒸馏水洗柱，确保仪器运行正常——填装柱材（Phenyl Sephadex CL 4B），用3倍体积（约120ml）的平衡缓冲液平衡柱子（转速29转/分）——将含GFP的上清液上柱，3倍体积（约120ml）洗脱缓冲液洗脱（转速60转/分）——紫外灯观察GFP 运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集——收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用离子交换层析的start buffer A（20mM Tris-HCl，）透析过夜。

2.7.阴离子柱层析

配制 start buffer A：20mM Tris-HCl，

洗脱缓冲液B：20mM Tris-HCl，（含1M NaCl）

]

将疏水作用层析的透析袋用PEG10000浓缩——start buffer A洗柱——填装柱材

（DEAE Sephadex A 50），用3倍体积（约120ml）的start buffer A平衡柱子（转速30转/分）——将含GFP的浓缩液上柱，3倍体积（约120ml）start buffer A 及洗脱缓冲液B梯度洗脱（转速60转/分）——紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集——收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用凝胶过滤层析的缓冲液（20mM Tris-HCl，）透析过夜。

2.8.凝胶过滤层析

配制缓冲液：20mM Tris-HCl，

将离子交换层析的透析袋用PEG10000浓缩——缓冲液洗柱——填装柱材（Sephadex G-75），用3倍体积（约120ml）的缓冲平衡柱子——将含GFP的浓缩液上柱，缓冲液洗脱——紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集——收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用PEG10000浓缩——浓缩好的液体收集备用。

2.9.SDS凝胶电泳检测

3.实验结果

GFP用硫酸盐最佳沉淀点的选择

收集硫酸铵浓度在50%~80%的蛋白质沉淀。

3.1.(

3.2.3级层析图谱

疏水层析图谱

收集紫外荧光显色较亮的四管，对照图中区域大约如箭头所示（陡升由于调高了敏感度）

离子交换柱层析

收集紫外荧光显色较亮的3管，对照图中区域大约如箭头所示

凝胶过滤层析

；

图中所显示区域未收集，在所示时间外有一管带微弱荧光，收集。

3.3.*

3.4.SDS-page电泳图

3.5.

自左向右箭头所指条带依次是1他组三级纯化产物 2 本组三级纯化微弱荧光样品 3 离子交换纯化产物， 4离子交换层析传出+wash ，5 Maker ，6 疏水层析产物浓缩产物， 7 疏水层析产物，8 疏水层析wash， 9 细胞破碎后上清，10 细胞破碎液体（可靠性较高的1，2，3，9,10标示泳道，蓝色箭头位置推测为目标条带）

4.分析与讨论

4.1.本组的重组子平板次日早晨检查时并没有可视菌落出现，继续培养，到下午是可看到

2到3个绿色的重组子群落，分析可能是1.转化后菌株过于脆弱 2.可能氨苄涂抹过多 3.涂布器使用时未控制好温度

4.2.在用硫酸盐沉淀的时候，，我总是主张直接用最大浓度硫酸盐直接沉淀，应该是有问

题的，GFP有明显的荧光信号，很容易在盐析粗提的时候去除溶解性相差较大的杂蛋白。

4.3.细胞破碎后收集的液体有十分明亮的荧光，GFP的疏水性较强，可与柱材上疏水基团

结合，在盐离子浓度降低时解离，疏水层析结果如图，推测前几个峰出现时洗掉了数个杂带，可惜SDS电泳时失误，并不能看出哪些条带被洗掉。在装自装柱时，由于我并不熟练，导致柱子上盖胶条不紧，以及忘记初始化自动收集装置（阀门就没开），使得在平衡柱子的时候不停漏液，耽误了进度，也浪费了柱子

4.4.离子交换柱有十分好的纯化效果，目的蛋白区域有极高的吸收峰，局部浓度可能过高，

下次要减缓流速，因为无法测量当时离子浓度，并不能给蛋白解离离子浓度区域给出建议，从电泳图上看，第三道，目标蛋白十分清晰，在上方存在数个杂蛋白（5个）4.5.—

4.6.凝胶过滤层析时，出现了数个失误 1 改变柱子压力位置，2 转速过大（压力过大），

3柱子填充过多，吸出一部分重装填，导致凝胶分层（后期大量蛋白卡在分界面） 4 与组员没有商讨好实验方案，导致中途实验进程不顺利，5 出现下方爆管，凝胶及蛋白漏出，重装填后不能洗出。

电泳图上出现大量抖峰，是管内出现气泡所致，原因可能如下1 从下方给予负压，且流速过大 2 下方的管口漏气（一侧缝隙我们添加了液体，并未漏泄，接口处可能漏液），3 凝胶的缝隙中本身有空气，4，buffer并未排气，在负压条件下溶解的空气被析出 4 压强过低出现真空泡

由于出现了大量蛋白卡在分界面上，且前期从电泳图上看到分离出约两种杂蛋白，我们采取了倒出胶体重新装柱，重新洗脱的方法，所以紫外吸收图谱并未记录。

4.7.凝胶电泳的分离胶是我配的，一块水封时候用力过大，出现了凹面，并未有多余，所

以只好自用，对点样结果的的美观性有影响，组员点样的时候可能出现失误，使得

5,6,7,8与位置不符合，可能未点上。从前三个泳道分析，小韦组结果十分好，目标条带及其明亮，可能我们组拿的并不是波峰管，所以上方有微弱杂带。我们的离子交换柱结果较好，凝胶柱图谱上显示两个杂蛋白，在电泳图上的确比离子柱少两个杂带，图上红色所示，层析依旧是有作用的。泳道4，推测是离子交换柱的穿出和wash液，目标条带区域有浅色痕迹，可能是蛋白与柱体结合不紧密，依旧有少量渗漏。

5.参考文献

陈鹏生物技术综合大实验西北农林科技大学生物技术大实验

邓超等绿色荧光蛋白及其应用中国生物工程杂志

赵仲麟等内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化河南农业大学学报

!

参考文献

生物技术综合大实验

2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化

1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地

亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。

生物技术大实验考试复习题

生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

生物技术应用中心实验室建设方案

生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激

励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。

生物技术实验解析

实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。

关于生物技术综合实验报告

关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，

核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； ② Trizol试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75％乙醇； ⑤ TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液 3. 仪器

西北农林科技大学-生物技术综合大实验

生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <

《生物技术综合实验》教学大纲

《生物技术综合实验》实验课程教学大纲 课程名称(中文) 生物技术综合实验 课程名称(英文) Comprehensive Experiments of Biotechnology 课程编号33101105 课程类型专业必修课 教材名称《生物技术综合实验指南》（陆勇军等）自编教材 是否独立设课是√否 学时学分:总学时 108 总学分 3 实验学时108实验学分3 开出时间：四年级第十学期 适用专业生物技术专业、生物技术及应用专业、逸仙班 先修课程《生物化学》、《生物技术学》、《微生物学》、《遗传学》 备注：课程类型分为公共必修课、公共选修课、专业必修课、专业选修课 一、课程简介及基本要求 本课程是一门综合性实验课程。要求学生在掌握生物化学、生物技术学、微生物学和生物化学技术原理等的基础上，学习和掌握生物技术实验的基本原理和技术，主要包括基因工程常规操作（如从生物材料中提取功能基因、再把该基因克隆到载体DNA上。然后转化至细菌或酵母中进行表达等）技术及一系列生物大分子的提取（包括从微生物、动物或植物材料中提取）、分离、纯化的方法和技术。了解并掌握各种常规生化仪器及发酵器材的使用和保养；培养和训练学生具有良好的科研素质、有较强的分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。 二、课程目的及要求 1.通过实验综合运用各门理论课相关知识，并加深理解。 2.培养学生实事求是的科学品德、团结合作的科学工作精神、善于思考和分析、解 决问题的能力，全面提升他们的科研素质，为今后独立从事生物技术及相关学科 领域的研究奠定基础。 3.要求学生课前做好预习，熟悉每个单元实验的原理和方法，也可根据自己的理解 和兴趣，设计相关研究实验。

2020年(生物科技行业)生化及分子生物学大实验

（生物科技行业）生化及分子生物学大实验

实验20质粒DNA的提取和鉴定 教学内容提要及时间分配： 1、实验原理讲解：8分钟 碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的俩条链不会完全分离。当用pH 值4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物,通过离心，染色体DNA和不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物壹起沉淀下来而被除去，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀，再用RNase除去RNA，即可获得较纯净的质粒DNA。 2、实验试剂和器材6分钟 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（从10%SDS

母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。 溶液Ⅲ：5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。 3mol/L醋酸钠(pH5.2)：800mL水中溶解408.1gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。 STE缓冲液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。 TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 3、实验步骤讲解：6分钟 将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100μg/mL Amp）上，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基(含有100μg/mL Amp)中，37℃振荡培养14~16小时。 取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中，室温12,000r/min离心1分钟。 加入500μLSTE，涡旋打匀，室温12,000r/min离心1分钟。 弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。 加入100μL溶液Ⅰ重悬菌体，涡旋振荡，冰浴5分钟。 加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速轻柔颠倒5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟。 加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧，管口朝下，轻柔振荡5~10次，冰浴5~10分钟，12,000r/min离心10分钟。 取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡20秒。

《生物技术大实验》试题

2011级生物化学与分子生物学专业硕士研究生 《生物技术大实验》期末考试 1、请介绍第三代核酸测序技术。 答: 第三代核酸测序技术的基本原理:基于纳米孔的单分子读取技术，英国牛津纳米孔公司成功研发出第三代基因测序技术。该测序技术读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。 当前，基因测序工作费时且昂贵，测序时，分子必须进行多次复制(这一步被称为扩增)，同时进行荧光示踪标记，这一过程会带来错误，因此，一个基因要被测序多次才能得到值得信赖的结果。此外，购买和操作测序仪器的费用也不菲，目前，测定一个完整的基因组需要上万美元。 在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠被称为核酸外切酶的蛋白质以一次一个碱基的速度通过小孔。这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在大约70天左右测定一个完整的基因序列。 第三代核酸测序技术优点:纳米孔技术不需要荧光标记物并且很可能不需要进行扩增，能直接并快速“读”出DNA，同时足够廉价，使进行大量重复实验成为可能。纳米孔公司已经研发出包含几百个纳米孔的芯片，该芯片可以用在一台机器上，快速且廉价地给大量DNA进行排序。 基因测序于上世纪70年代由弗雷德-桑格尔发明，他因此获得了诺贝尔奖，第一份人类基因草图于2001年绘制成功，花费了40亿美元。 第三代核酸测序技术展望:纳米孔公司总裁戈登-桑赫纳说，该技术预示了基因测序领域的一个跳跃变化，花费不到1000美元就可以完成一个基因测序。借助该技术，在未来5年内，测序费用将有可能降至500美元。到那时，基因测序可以成为英国国民健康保险制度的一部分，民营保险公司也支付得起。该技术也可以让医生使用DNA 来预测并且预防诸如心脏病、糖尿病等疾病，更加有效地开药。 世界著名基因测序公司Illumina的总裁杰伊-弗拉特利称，10年后，每一个新生婴儿都会被“配备”完整的基因排序，费用不超过5000美元。

川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： <研究背景> 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。

1.材料 甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ① 无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； ② Trizol试剂； ③ 氯仿； ④ 异丙醇、75％乙醇； ⑤ TBE缓冲液； ⑥ 上样缓冲液（6×） 3. 仪器 高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP管架 四、实验方法 1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解； 2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min 使其自然分相； 3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min； 4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底； 5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清； 6. 室温放置10 min晾干沉淀； 7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存； 8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。

生物技术大实验

生物技术大实验陆挺王大慧汪成富 苏州大学生命科学学院 二零零七年六月

前言 脂类被广泛地定义为能溶于有机溶剂的一类生物分子【1】。甘油脂类是指主链中含有甘油的脂类。主要的甘油脂类包括三酰基甘油和各种磷脂。由脂肪酸和甘油组成的三酰基甘油可在动物的脂肪组织，植物种子或果实中大量储藏。脂肪酸是三酰基甘油的主要成分，其作为能量被储存在三酰基甘油中。虽然在肝脏和肠内也发现三酰基甘油，但是发现它们主要存在脂肪组织中。 磷酸甘油酯(简称磷脂)，是另一种含有磷酸基的甘油脂类。这类脂类的共同特点是它们都是具有亲水性和疏水性的兼性分子，水解以后都产生磷酸和脂肪酸。可见，脂肪酸也是磷脂的主要成分。在真核和原核细胞的生物膜（包括细胞膜，细胞器膜）中，磷脂是主要的结构脂类。磷脂双层可构成两相界面，是各种分子的通透性屏障。磷脂组成的变化对细胞膜的流动性，膜蛋白的活性等细胞生理功能由重要的调节的作用。【2】 溶血磷脂是一类重要的磷脂。其中，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid ,LPA）是目前已知的结构最简单的甘油磷脂。它的系统命名为1或2－脂酰－甘油－3－磷酸（1 or 2-acyl sn-glycerol-3-phosphate）。 溶血磷脂酸在体内的信号转导途径中起着重要的作用，被称为多功能“磷脂信使”。通过活化特定的G蛋白受体，LPA调控着多种细胞反应，如有丝分裂的发生、细胞粘附、细胞骨架重排、离子转运、细胞分化、平滑肌收缩以及细胞调亡等等【3】。LPA存在于多种生物体体液中，如血清、血浆、眼球的水状体等。多种类型的细胞均可产生LPA，并通过自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外影响靶细胞的功能。机体可由如下途径释放LPA：1）血小板在凝血酶刺激激活后可迅速产生和释放LPA；2）哺乳类的成纤维细胞在肽类生长因子刺激下可迅速产生LPA并释放到细胞外间质；3）人的脂肪细胞可产生LPA，并刺激前脂肪细胞的增殖[4]；4）在卵巢癌患者的腹水及血浆中可检测到增高的LPA[5]，其来源尚不清楚，但有可能是肿瘤细胞产生的；5）某些炎症细胞、内皮细胞、神经细胞及受损的细胞也可产生LPA[6] 多方面研究表明，LPA的产生同多种病生理状态密切相关。LPA是促使肿瘤细胞生长和浸润的一个强有力的因子[7，8]，它在包括癌症、肥胖以及动脉硬化等疾病中起着重要的作用，近年来，越来越多的证据显示LPA与人卵巢癌及其他人恶性肿瘤的病理生理学关系密切[9，10]。当前，LPA已经被用作卵巢癌检测的一个重要的分子指标[10，11]。

《生物技术综合实验》教学大纲

《生物技术综合实验》教学大纲 课程编号： 课程名称：生物技术综合实验 实验学时：80 一、本实验课的性质、任务与目的 生物技术综合实验技术已成为实验技能综合训练和培养不可缺少的一部分。本课程训练学生实际综合能力培养和操作。要求学生充分掌握多种技术的应用，提高学生在综合实验技术方面的动手能力，为参加科研实践打下坚实的基础。 二、本实验课所依据的课程基本理论 《生物化学》、《微生物学》、《分子生物学》、《基因工程》、《酶工程》和《下游加工技术》等生物技术专业的专业基础课和专业课。 三、实验类型与要求 1. 实验类型：总体为综合型。设计为目标明确、逻辑性强和连贯性好的大实验，即以纤维素酶基因的克隆和表达为主线，将多门课程所涉及的实验内容串联成综合性大实验，达到实验前后连贯，步步论证，提高良好的综合实验技术能力和水平。 2. 实验要求：必修 四、实验项目与实验学时分配

五、考核方式与评分办法 实际操作和实验报告分别占50％和50％。 六、本实验课配套教材或实验指导书 实验指导书：生物技术综合实验 参考书： 1．魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，2007 2．朱旭芬. 基因工程实验指导。北京：高等教育出版社，2006 3．周俊宜.分子生物学基本技能和策略.北京：科学出版社,2003 4. [美]J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南.北京：科学出版社,2005 5. 刘箭。分子生物学及基因工程实验教程。北京：科学出版社,2008 七、实验报告要求 实验报告的内容包括：实验名称、日期、目的、实验原理、实验仪器设备与材料、实验步骤，实验结果及分析讨论。 每次实验结束时应将原始记录交给指导教师签字。 八、其它 教研室：生物技术教研室执笔人：阚劲松系主任审核签名：

课程H1402018生物技术综合大实验一考试大纲

课程编号H 生物技术综合大实验（一）考试大纲 一、课程基本信息 二、考试目的与要求 1．旨在通过本课程的学习，培养本科生创新意识和提高他们综合运用前期的理论和实验知识独立地分析问题与解决问题的能力、科研能力和团队精神，为培养基础厚、知识新、素质高、能力强的创新型和研究型人才打下良好的基础。 2．了解教师的教学效果，如实评价考试质量好坏，借此发现教师教学方面存在的问题，改进教学工作，有利于提高教学质量。 3．总结教学成功经验，对照教学大纲要求，查漏补缺，改进教学方法。 三、考试方式 1．生物技术综合大实验（一）考核采取实验理论和操作面试两种考核形式进行。 2．实验理论考试将以闭卷笔试形式进行，可较全面地考察学生对实验基本操作和基本技能的掌握情况。3．实验操作面试，采取分组选题、同时面试，让学生在规定的时间内完成面试内容，教师根据学生面试结果，评定成绩。 四、考试命题原则 1．期末考试试卷满分为100分，其中理论知识部分和操作部分各占50分。考试时间笔试部分110 分钟，实验操作面试根据所需时间确定。 2．操作面试成绩登记在学生试卷答题上，综合评出期末考试成绩。 3．考试内容的选择主要遵循两个原则：一是综合性强，力求包括常用的微生物实验基本操作；二是应有一定量和质的要求，选择有一定难度的实验内容。 4．实验理论考试的题型可参考理论课的题型，并附有标准答案。 5．实验操作考试的题目教师可事先通知学生让其充分预习和准备，设计好实验方案，然后在规定的时间内完成实验内容，也可考试时临时决定或其它方式出题。 6．实验操作考试的题目，教师要制定完整的评分标准，每一步操作都要给出相应的分数。 7．考试试卷为分量及难度相当的A、B两份试卷，供期末、重修使用，补考试题由教务部分从历年试题中随机抽取。 五、总评成绩的评定原则 1．平时预习及实验报告占总评成绩的30%； 2．实验操作考试成绩占总评成绩的35%； 3．实验笔试卷面成绩占总评成绩的35%。

关于生物技术综合实验报告

关于生物技术综合实验报告 生物技术综合实验 甘薯Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y -GCS)基因的克隆和 原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH)GSH具有多种重要生理功能，抗自由基和抗氧化应激作用，保护细胞膜的完整性等。 Y -GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶，可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用，说明Y -GCS也与植物抗逆 过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快 速抽提总RNA勺试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA勺完整性。TRIzol的主要 成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，

核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8—羟基喹啉、异硫氰酸胍、B -巯基乙醇等来抑制内源和外源RNaseb %的8—羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。B -巯基乙醇的主要作用是 破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA用这种 方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA B灭菌水：加入％的DEPC处理过夜后高压灭菌； ②Trizol 试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75%乙醇； ⑤TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液 3. 仪器

生物技术综合大实验

2013-2014学年生命科学综合大实验 。 GFP分离与纯化 >

1.文献综述 $ 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu

Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger （钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。 * ~

生物技术大实验完整版

生命的基本特征：①细胞是生物的基本组成单位（病毒除外）②新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能③生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质④生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性 生物学经历的三个阶段：描述生物学阶段、实验~、创造~ 生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的 生物技术发展三个阶段：作坊式生物技术、工业化~、现代~ 生物技术内容：基因工程技术、细胞~、酶~、发酵~、蛋白质~ 细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术 蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。蛋白质工程也成为“第二代基因工程” 生物技术基本特征：①高效益②高智力③高投入④高竞争⑤高风险⑥高势能 透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度 实验室常用水的制备：①利息交换法②蒸馏法③反浸法④超纯法 消毒灭菌方法：①高压高温灭菌②干热灭菌③滤膜灭菌④化学消毒法⑤紫外线灭菌⑥抗生素灭菌消毒 核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列 二级结构：双螺旋结构 三级结构：超螺旋结构 DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程 增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升 DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象 减色效应：DNA复性时，OD260值下降 影响复性速度的因素：①溶液温度的高低②单链片段的大小③单链片段浓度④溶液离子强度的大小⑤片段内重复序列的多少 OD260的应用：OD260=1.0 相当于①50ug/ml 双链DNA ②40ug/ml 单链DNA或RNA③20 ug/ml 寡核苷酸 基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达 阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列 基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区 三个关键因素：①自由复制的DNA序列②着丝粒DNA序列③端粒DNA序列 原核生物和真核生物染色体的区别：①原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始②真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。这些蛋白具有功能或结构方面的作用。染色体DNA的数量远比原核生物多。每条染色体有多个复制起点 分离纯化核酸的总原则：①保证核酸的一级结构完整性②防止核酸的生物降解③排除其他分子的污染 真核细胞DNA制备实验基本原理：要从组织中提取DNA就必须先将组织分散成单个细胞，

《生物制药》课程实验大纲

《生物制药》课程实验大纲 编号： 课程名称：生物技术制药 英文名称：Biological Pharmaceutical Technology 实验指导书名称：生物制药实验指导书 一、学时学分 总学时：32 学分：2 实验学时：8 二、实验目的 本课程实验的目的是使学生掌握生物技术制药中的基因工程制药、抗体制药、细胞工程制药、酶工程制药、微生物工程制药的基本原理、主要方法和技术，从而使学生能够将理性知识与感性认识有机地结合起来，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识以及分析问题和解决问题的能力。同时通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力，实事求是，严肃认真的科学态度，以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。 三、实验基本原理 纯培养技术、无菌操作技术、分子生物学基本原理及技术、免疫学原理及技术、细胞工程原理及技术、蛋白质工程原理。 四、实验基本要求 在实验内容的安排上，注意使学生加深对生物制药工艺基本理论的理解。实验的难易程度适中，严谨全面。根据实验指导书完成课内实验任务，客观认真填写实验数据并进行结果分析、每次实验及时上交实验报告。 五、考核与报告 实验考核以平时实验预习报告、实验态度、实验操作及实验处理几部分组成，占

该门课程成绩30％，实验报告按实验指导书提供的统一格式进行书写。 六、主要仪器设备 CO2培养箱、20W紫外灯、红灯、血球记数板、搅拌器、高速冷冻离心机、冷冻干燥箱、真空干燥箱、高压灭菌装置、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、液氮罐、精密天平、微量加样器、烤箱、细菌过滤器、10L气升式发酵罐、摇床、显微镜（带油镜）、紫外及可见光分光光度计、电泳仪、pH计等。 七、实验项目与内容提要 八、适用专业 生物技术 九、实验地点 生物与食品工程学院实验室

四川大学-生物技术-综合试验报告-学生版

精品文档 生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表 达 学生：学号： 同实验者： <研究背景> 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧 化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑 制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。 . 精品文档 三、实验材料 1.材料 甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯18 2. 试剂

生物技术大实验-常用软膏剂基质的制备

常用软膏剂基质的制备 一、目的和要求 1．1．掌握不同类型软膏基质的制备方法。 2．2．根据药物和基质的性质，了解药物的加入方法。 3．3．了解软膏剂的质量评定方法。 二、基本概念和实验原理 软膏剂是指药物与适宜基质均匀混合制成的外用半固体剂型。基质占软膏的绝大部分，除起赋形剂的作用外，还对软膏的质量及疗效起重要作用。常用的基质有油脂性基质、乳剂型基质以及水溶性基质三类。 软膏基质的制备，可根据药物及基质的性质选用研和法、熔和法及乳化法制备。 眼用软膏剂的基质一般由凡士林、羊毛脂及液状石蜡组成。基质应纯净、均匀、细腻、对眼无刺激性，并在150℃干热灭菌1小时以上，过滤后备用。 三、仪器和材料 仪器：蒸发皿，水浴，电炉，温度计，显微镜等。 材料：硬脂酸，单硬脂酸甘油酯，白凡士林，甘油，液状石蜡，三乙醇胺，氢氧化钙，羧甲基纤维素钠，司盘80，OP乳化剂等。 四、实验内容 （一）油/水型乳剂基质 1．处方 硬脂酸 4.8g 单硬脂酸甘油酯 1.4g 液状石蜡 2.4g 白凡士林0.4g 羊毛脂 2.0g 三乙醇胺0.16g 蒸馏水加至40.0g 2．制法硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液状石蜡、白凡士林和羊毛脂为油相，置蒸发皿中，于水浴上加热至80℃左右混合熔化。另将三乙醇胺和蒸馏水置烧杯中，于水浴上亦加热至80℃左右。在等温下将水相缓缓倒入油相中，并于水浴上不断搅拌至呈乳白色半固体状，再在室温下搅拌至近冷凝。 3．用途本品为雪花膏的一种基质。 （二）水/油型乳剂基质I 1．处方 单硬脂酸甘油酯0.85g 蜂蜡50.2g 石蜡 3.75g 硬脂酸0.625g 液状石蜡20.5g 白凡士林 3.35g