冰冻切片弹性纤维ELASTIC马森MASSON染色试剂
冰冻切片弹性纤维（ELASTIC）马森（MASSON）染色试剂盒产品说明书
（中文版）
主要用途
冰冻切片弹性纤维（ELASTIC）马森（MASSON）染色试剂是一种旨在使用标准化的化学脱蜡方法和伟郝夫（Verhoeff）苏木素以及三色染料（trichrome），分析和区分冰冻组织切片中的弹性纤维的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统方法、成功实验证明的。广泛用于结缔组织、肌肉组织和纤维蛋白的研究等。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。
技术背景
弹性纤维（elastic fiber），又称为黄色纤维（yellow fiber），是固有结缔组织（Connective tissue proper）细胞外基质的成分之一，由平滑肌细胞和成纤维细胞产生弹力蛋白质（elastin）、原纤维蛋白（fibrillin；FBN）等构成。弹性纤维具有可伸展性。存在于皮肤、肺、动脉、静脉、弹力软骨、牙周韧带（periodontal ligament）、脂肪组织中。弹性纤维缺失导致皮肤松弛症（cutis laxa）、威廉姆斯综合征（Williams Syndrome）等疾病。基于摩罗利（mallory）首次应用三色系统的方法，马森（masson）进行了改良，在三色复合染料体系中，使用苯胺篮（aniline blue）替代绿篮。同时使用伟郝夫（Verhoeff）苏木素选择性染色弹性纤维，三色复合染料帮助区别其它包括肌肉、胶原纤维、纤维蛋白（fibrin）等组织成分。马森方法操作复杂，可以细致区分多种组织成分。
产品内容
清理液（Reagent A）200毫升
固着液（Reagent B）10毫升
韦格液（Reagent C）100毫升
祛色液（Reagent D）20毫升
岑克液（Reagent E）100毫升
范氏液（Reagent F）10毫升
比氏液（Reagent G）10毫升
酸性液（Reagent H）10毫升
染色液（Reagent I）10毫升
修正液（Reagent J）10毫升
脱水液A（Reagent K）10毫升
脱水液B（Reagent L）10毫升
透明液（Reagent M）10毫升
产品说明书1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避免光照；试剂具有腐蚀性，注意安全；有效保证6月
用户自备
小型玻璃染色缸：用于组织或切片处理的容器
培养箱或烘箱：用于样品反应孵育
微波炉：用于样品反应孵育处理
中性树脂：用于切片封片
光学显微镜：用于切片染色后观察分析
实验步骤
一、样品固着处理
1．准备好5微米厚的冰冻切片
2．小心加上200微升清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面
3．室温下孵育2分钟
4．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
5．小心加上200微升固着液（Reagent B）在切片上，铺满整个切片样品表面
6．室温下孵育5分钟
7．小心移去切片上的固着液（Reagent B）
8．小心加上200微升清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面
9．室温下孵育2分钟
10．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
二、样本染色处理
操作一：标准染色
1．小心加入1毫升韦格液（Reagent C）在切片上，铺满整个切片样品表面
2．放进60℃恒温培养箱孵育60分钟
3．小心移去韦格液（Reagent C）
4．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
5．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
6．小心加入200微升祛色液（Reagent D）在切片上，铺满整个切片样品表面
7．室温下孵育5分钟
8．小心移去祛色液（Reagent D）
9．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
10．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
11．小心加入1毫升岑克液（Reagent E）在切片上，铺满整个切片样品表面
12．放进60℃恒温培养箱孵育60分钟
13．小心移去岑克液（Reagent E）
14．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
15．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
16．小心加入200微升范氏液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
17．室温下孵育30分钟
18．小心移去范氏液（Reagent F）
19．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
20．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
21．小心加入200微升祛色液（Reagent D）在切片上，铺满整个切片样品表面
22．室温下孵育5分钟
23．小心移去祛色液（Reagent D）
24．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
25．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
26．小心加入200微升比氏液（Reagent G）在切片上，铺满整个切片样品表面
27．室温下孵育5分钟（注意：可以延长至15分钟，增强染色效果）
28．小心移去比氏液（Reagent G）
29．小心加入200微升清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面
30．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
31．重复实验步骤29至30二次
32．小心加入200微升酸性液（Reagent H）在切片上，铺满整个切片样品表面（注意：可以孵育15分钟，增强染色效果）
33．小心移去切片上的酸性液（Reagent H）
34．小心加上200微升染色液（Reagent I）在切片上，铺满整个切片样品表面
35．室温下孵育5分钟，避免光照（注意：可以延长至15分钟，增强染色效果）
36．小心移去切片上的染色液（Reagent I）
37．小心加上200微升修正液（Reagent J）在切片上，铺满整个切片样品表面
38．室温下孵育2分钟
39．小心移去切片上的修正液（Reagent J）
40．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
41．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
42．（选择步骤）小心加上200微升脱水液A（Reagent K）在切片上，铺满整个切片样品表面（注意：如果比氏液（Reagent G）染色过深，建议使用由此步骤开始的选择步骤，并快速操作）43．（选择步骤）小心移去切片上的脱水液A（Reagent K）
44．（选择步骤）小心加上200微升脱水液B（Reagent L）在切片上，铺满整个切片样品表面
45．（选择步骤）小心移去切片上的脱水液B（Reagent L）
46．（选择步骤）小心加上200微升透明液（Reagent M）在切片上，铺满整个切片样品表面
47．（选择步骤）小心移去切片上的透明液（Reagent M）
48．放上盖玻片或封片（中性树脂）
49．即刻在一般光学显微镜下观察：
弹性纤维――呈现黑色
细胞核――呈现黑色
细胞质――呈现红色
肌纤维――呈现红色
角蛋白――呈现红色
胶原纤维――呈现蓝色
操作二：热处理染色
1．准备3个50毫升烧杯或小型染色缸，分别加入50毫升清理液（Reagent A）、韦格液（Reagent C）和岑克液（Reagent E）
2．小心放进上述固着处理的切片到50毫升韦格液（Reagent C）小型染色缸里
3．放进微波炉（600瓦）加热45秒
4．小心移去切片上的韦格液（Reagent C）
5．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
6．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
7．小心加入200微升祛色液（Reagent D）在切片上，铺满整个切片样品表面
8．室温下孵育5分钟
9．小心移去祛色液（Reagent D）
10．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
11．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
12．小心将切片置入50毫升岑克液（Reagent E）小型染色缸里
13．放进微波炉（600瓦）加热60秒
14．小心移去岑克液（Reagent E）
15．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
16．小心移去切片上的清理液（Reagent A）
17．小心加入200微升范氏液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
18．室温下孵育30分钟
19．小心移去范氏液（Reagent F）
20．室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
TUNEL染色-冰冻切片-(TMR Red)
TUNEL染色（TMR Red） 一、实验原理： 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca 2和Mg2依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。 二、相关试剂： 1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution 2、标记液：vial 2: Label Solution 3、固定液：4%多聚甲醛 4、清理液：PBS（pH 7.4） 5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制 三、其他设备： 1、湿盒 2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal） 四、染色步骤： 1、标本预处理： （1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）； （2）PBS清洗30min； （3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液： （1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）； （2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。 3、标记： （1）PBS清洗3min，3次； （2）吸干样品周围的液体； （3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液； （4）湿盒中避光孵育60min，注意避光； （5）PBS清洗3min，3次； （6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用
冰冻切片实验方案和HE染色
2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤） 冰冻切片操作方法及步骤： 1取材：(昆明小鼠各个组织或器官) 取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 2包埋： 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。 小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。 3修平： 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。 4切片： 调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 5调防卷板： 制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。 冰冻切片时的注意事项： 1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 5 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 6 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时； （7） PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光 附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压， pH7.2-7.4 （2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存
冰冻切片实步骤
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶,往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时,影响较小,冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率)成反比,即冰晶形成的数量愈多则愈小,对组织结构影响愈严重。因此,应尽量降低冰晶的数量。Fiｓh认为冰冻开始时,冰晶成核率较慢,以后逐渐增加，其临界温度为-3３。C，从-3０。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 (1)速冻,使组织温度骤降，缩短从-３３。C43。C的时间,减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精)法：将15０－２00ｍｌ丙酮(酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰,直至饱和呈粘稠状,再加干冰不再昌泡时,温度可达-７0℃C，用一小烧杯(50－100ml)内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮(纯酒精)饱和液内,至异戊烷温度达-7０℃时即可使用。将组织(大小为1cm×0.8ｃｍ×0.5cm）投入异戊烷内速冻３０-6０s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约２cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-2０s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入－80℃冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2)将组织置于20%-30%蔗糖溶液1~３天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类: ①恒慢冰冻切片机（Cｒｙasｔat）：为较理想的冰冻切片机,型号很多，但其基本结构是将切片机置于-3０℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至2-4μｍ，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜,温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的ＣＯ2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中,温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8~15μm,不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内,或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2.石蜡切片其优点是组织结构保存良好,在病理和回顾性研究中有较大的实用价值,能切连续薄片,组织结构清晰,抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行,以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于２cｍ×１.5cｍ×0.2cｍ,使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下,以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋)。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表 1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇４℃ 3～4h ２ 80%乙醇 4℃３～4ｈ 3 ９0%乙醇4℃2~３h 4 95％乙醇Ⅰ４℃ 2~３h 5 95%乙醇Ⅱ４℃ 1～2ｈ ６ 100%乙醇Ⅰ４℃ 1.5ｈ
冰冻切片免疫组化步骤
冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS 冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。
孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。
冰冻切片弹性纤维ELASTIC马森MASSON染色试剂
冰冻切片弹性纤维（ELASTIC）马森（MASSON）染色试剂盒产品说明书 （中文版） 主要用途 冰冻切片弹性纤维（ELASTIC）马森（MASSON）染色试剂是一种旨在使用标准化的化学脱蜡方法和伟郝夫（Verhoeff）苏木素以及三色染料（trichrome），分析和区分冰冻组织切片中的弹性纤维的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统方法、成功实验证明的。广泛用于结缔组织、肌肉组织和纤维蛋白的研究等。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。 技术背景 弹性纤维（elastic fiber），又称为黄色纤维（yellow fiber），是固有结缔组织（Connective tissue proper）细胞外基质的成分之一，由平滑肌细胞和成纤维细胞产生弹力蛋白质（elastin）、原纤维蛋白（fibrillin；FBN）等构成。弹性纤维具有可伸展性。存在于皮肤、肺、动脉、静脉、弹力软骨、牙周韧带（periodontal ligament）、脂肪组织中。弹性纤维缺失导致皮肤松弛症（cutis laxa）、威廉姆斯综合征（Williams Syndrome）等疾病。基于摩罗利（mallory）首次应用三色系统的方法，马森（masson）进行了改良，在三色复合染料体系中，使用苯胺篮（aniline blue）替代绿篮。同时使用伟郝夫（Verhoeff）苏木素选择性染色弹性纤维，三色复合染料帮助区别其它包括肌肉、胶原纤维、纤维蛋白（fibrin）等组织成分。马森方法操作复杂，可以细致区分多种组织成分。 产品内容 清理液（Reagent A）200毫升 固着液（Reagent B）10毫升 韦格液（Reagent C）100毫升 祛色液（Reagent D）20毫升 岑克液（Reagent E）100毫升 范氏液（Reagent F）10毫升 比氏液（Reagent G）10毫升 酸性液（Reagent H）10毫升 染色液（Reagent I）10毫升 修正液（Reagent J）10毫升 脱水液A（Reagent K）10毫升 脱水液B（Reagent L）10毫升 透明液（Reagent M）10毫升 产品说明书1份 保存方式 保存在4℃冰箱里，避免光照；试剂具有腐蚀性，注意安全；有效保证6月 用户自备 小型玻璃染色缸：用于组织或切片处理的容器 培养箱或烘箱：用于样品反应孵育 微波炉：用于样品反应孵育处理 中性树脂：用于切片封片 光学显微镜：用于切片染色后观察分析 实验步骤 一、样品固着处理 1．准备好5微米厚的冰冻切片 2．小心加上200微升清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面 3．室温下孵育2分钟
冰冻切片实验技术
实验技术：组织切片的制备 点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考， 谢绝转载，否则责任自负 组织切片的制备 二）切片方法-细节注意 1 切片方法的选择 光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。 1.1 冰冻切片 是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约 1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内， 进行短暂预固定干燥后贮存于低温。 【目的】 组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。 【原理】 苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。苏木素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细胞浆染呈红色，常用作胞浆染色。 【材料】 1.试剂和溶液
冰冻切片技术经验总结
冰冻切片制作技巧 1.从锋利的刀片开始 我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片，当片子的质量开始下降时，我会立刻更换刀片。某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝，因此，经常更换刀片显得很有必要，有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。 2.坐着还是站着 我切片时总是坐在一张凳子上。要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作，从而精细地控制显微厚薄程度的片子。切片时俯身弯腰，颈部过伸的姿势有些不妥，要尽量处于放松和舒适的姿势以便能最大程度控制你的左手。 3.刷子 我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先学会使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到台子上。冷冻的片子会自发的卷缩并从刷子上脱离下来，因此，我使用一把有硬毛、夹取面宽的刷子。我发现来自中国的野猪毛十分坚硬，非常管用。你可以花3美元从工艺店买一把1/4英寸长的#2号扁平无色的刷子，把毛削成一个角度。由于是个有角的头端，加上握持刷子成一定的角度，这样刷子与组织接触时就会象扫帚一样的平。我不能理解为什么有人使用脆弱的骆驼毛刷子，组织片很容易从这些柔软的毛上掉下来。 4.握持刷子 左手象拿笔一样握持刷子，将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方)，这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。我把刷子削成一个角度，大致与左手握持刷子的角度相同，这样使刷子平着接触组织的1/4。 5.摇柄的旋转 以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，且要毫不犹豫。我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动摇柄。依我的经验看来，这种动作增加了起始切片假象的可能，会使片子的厚度不均匀，也增加了处理脂肪类组织的难度。我切片时，象前面所说的那样手握刷子，以一种连续的动作抓取组织，这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。 6.刷子的移动 组织块移向刀片时刷子也要同步地向下移动，当组织块刚好接触刀片时刷子轻轻停在其底部2mm处并迅速抽离。正是刷子的向下移动使你能连续地抓取组织，当开始的几毫米组织穿过刀片时便有自发卷曲的现象，这时，运动中的刷子立刻粘住其游离的边缘部分并水平地拖向切片者。刷子的运动路径是一个朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，连续不断。但要注意有时候把组织压向台面时会使组织粘在台面上，可能会导致碎片，应尽量避免。当然预先将组织包埋起来可以使刷子不用接触到组织，切片也容易多了。 7.贴片 可以从切片机的台面上也可直接从组织块面粘贴组织片，我一般采用前者。片子切好后，手
冰冻切片的制备
冰冻切片组织的制备: 固定 将组织置于4%多聚甲醛固定液中，4℃摇床过夜。 漂洗 将固定后的标本用1X PBS漂洗三次，每次15分钟。 脱水 将组织置于30%蔗糖溶液中，4℃摇床过夜。第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全。 包埋 将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记。之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀，切忌起气泡，静止10分钟，以防切片时脱片。重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T 混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中。在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。 切片： 切片前先将切片机的箱体温度及刀头温度均设为-20℃，把包埋盒从-80℃冰箱取出置于切片机中平衡半小时左右。之后将包埋块用O.C.T固定在样品托上，然后将样品托固定在样品头上，调整合适的位置，以使样品与刀头处于平行位置。手动切片。用细毛笔将切片均匀整齐地平铺在明胶包被的载玻片上，室温下晾片30min-1h后进行免疫组化染色。 冰冻切片的快速染色法 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。 方法： 1.切片固定1分钟。 2.水洗（肉眼观察，洗净即可）。 3.染苏木素5分钟。 4.1%盐酸酒精分化。 5.于碱水中返蓝10秒。 6.伊红染色10秒。 7.脱水，透明，中性树胶封固。
浅谈怎么切好冰冻切片(转载自丁香园)
【转帖】冰冻切片技术介绍、制片技巧冰冻包埋组织固定冰冻切片免疫组化操作 各类组织实际操作技巧（连载补充）[精华] 切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。5微米以下切片不易成功。但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片 一、直接冰冻切片法 冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。 1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。目前恒冷箱切片机的品种较多。此种切片适用于科研和教学上的连续切片。要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。 2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。 3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。 4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。 二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。明胶冰冻切片正是适用于上述情况。 ⑴环保组织固定液固定后必须充分水洗，洗净。因甲醛对明胶有凝固作用，从而影响明胶溶液浸入组织内部,不宜选用含甲醛类固定液。 ⑵组织水洗后浸入12.5%明胶水溶液(以1%石碳酸水溶液配制)，于37℃温箱浸6-24h。 ⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。 ⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。 ⑸入环保组织固定液固定明胶块1-2日。 ⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。切片可保存于10%甲醛液中。 ⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。 先将果糖溶于麝香草酚饱和液，置于56℃温箱内12h，加明胶后在水浴内加温熔化，过滤后加钾矾。于100ml溶液内加甲醛2ml防腐。 三、冰冻切片粘片法 1．蛋白甘油粘片法冰冻切片粘片法基本上按石蜡切片的粘片处理，但烘烤的温度不超过40℃。待烤干后立即取出，时间过久或温度过高则切片易破碎。烤干后用70%乙醇及蒸馏水洗后即可染色。 2．Lillie明胶粘片法将切片放入1%明胶水溶液数分钟，捞出置于载玻片上，将多余液体倾去。入环保组织固定液中固定5min,水洗10min，即可染色。 3．乙醇明胶粘片法切片浸入0.1%或0.75%明胶溶液（以40%乙醇配制）数分钟，捞于载片上，经室温短时干燥，入氯仿1min ,经95%及70%乙醇洗去氯仿，再经蒸馏水洗后染色。 四、冰冻包埋液包埋切片OCT Compound 法 现在国内外有许多厂家用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘（chuck）上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。常规切片，厚度2-100微米。或者在盛标本的包埋模具内，挤出适量冰冻包埋液，放入组织块或细胞沉淀块，加包埋剂完全淹没组织块，如有气泡可用针头或吸头吸出。速冻：将盛有组织细胞和包埋液的模具，正置于切片机冷室内冰冻10分钟，至包埋液固
蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术
蜡块包埋、冰冻切片及HE染色技术 【实验目的】了解蜡块包埋切片、冰冻切片及HE染色的应用范围，了解染色的原理，掌握其操作方法。 【实验原理】 切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。 【实验仪器、材料和试剂】 （一）仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片 （二）材料：洋葱根或小鼠肝 （三）试剂：福尔马林溶液（甲醛含量为35%至40%(一般是37%)的水溶液，也加入10%—15%的甲醇防止聚合）、苏木精、伊红、无水乙醇、1%盐酸-酒精（70%酒精99ml+浓HCl 1ml）、二甲苯、石蜡、加拿大树胶 A：0.5~1% 的伊红酒精溶液： 称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。B：苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列减少) 苏木精 6 g 无水乙醇 100 ml 硫酸铝钾 150 g 蒸馏水 2000 ml 碘酸钠 1.2 g 冰醋酸 120 ml 甘油 900 ml 配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。【方法与步骤】 光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。这