活体电穿孔法介绍
活体电穿孔法介绍
1、什么是活体电穿孔
活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。
活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。
2、活体电穿孔的法的特点
活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:
首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。
在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。
其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。
此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。
但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。
由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月。
3、活体电穿孔法与其他活体基因导入方法的比较
到目前为止,非病毒载体的活体基因导入方法有直接注射法、脂质体法、基因枪法、电穿孔法等。每一种方法都有其各自的特殊性,因此很难将这几种方法进行简单的比较。
直接注射法：可将外源基因直接注射到靶位点或血管中,但此种方法不适合以肌肉作为靶器官,它的外源基因表达效率极低,仅为电穿孔法的百分之一。
脂质体法：活体基因转移法中脂质体法更适宜较大面积组织的基因导入,但无法避免DNA浓度变低,在出血的情况下会使本来不高的DNA浓度更加降低,往往造成基因导入效率低。
基因枪法：适合于DNA较易接触到的质地较坚韧的组织如皮肤,而视网膜、胚胎和禽类
的胚盘等组织会由于机械刺激和出血造成器质性损伤或发育停滞,因而不能用基因枪法完成。DNA包裹的金属颗粒从基因枪发出到达组织表面大多只几百微米的距离,较深层的组织不易操作, 表达效率也较低。
Muramatsu报道在材料一致的情况下,电穿孔法的基因导入和表达效率明显高于其它方法,而且电穿孔法适合多种组织的操作[3 ] 。
4 活体电穿孔法施加条件的研究
波型的选择
在电穿孔过程中方波较指数衰减波更能获得较高的基因表达。同时方波只要要求控制电压和时间，十分直观，而指数衰减波需要控制的电压、电容、电阻等参数，这样的条件摸索过程中，方波较指数衰减波更易得到高表达。
电压
电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。电压过低或过高都会影响外源基因的表达。电压过低时,无法造成细胞膜表面状态的改变,因而外源D不能进入细胞内。电压过高时,局部组织积聚过多热量,造成细胞的死亡或组织失去功能,即使外源基因导入细胞,也无法进行正常的表达。哺乳动物常用的活体电压大多为20～100VPcm ,最高电压在250～750VPcm。
电穿孔次数和时间
有试验证明,皮肤的电阻在每一次电穿孔后都有所降低，说明电穿孔使皮下组织形成孔道,且其大小随电穿孔而变大,经过电穿孔的处理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊内表达。但电穿孔次数不能过多,否则会对局部的细胞组织造成不可逆的损害,基本应在10 次以内,
每组电穿孔时间应在20～100msec 。
能量的测算
电穿孔过程中能量的测算公式为: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表电穿孔时导入的能量,V 代表施加的电压,T 代表电穿孔延续的时间,R 代表作用组织的电阻。试验证明在导入能量一定的情况下外源基因转移效率也相近。在此原则基础上可根据不同的组织器官选择不同的电压和电穿孔时间。
温度
由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热,因此操作过程中,DNA 转染试剂应保持4 ℃,同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低,Muramatsu 证明温度较低的情况下,外源基因的转移表达效率会有明显的提高。此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA 的流失,这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。
DNA 的状态和浓度
很多试验都证明线状DNA 较环状DNA 在活体电穿孔法瞬时表达系统的建立中效果较好[12 ] 。DNA 的浓度应在1～40mgPml 范围内。
DNA 溶液组分
DNA溶液中不应含有不能分解成离子的组分,如甘露糖醇、蔗糖等。这些大分子存在时会降低基因的转移效率。
5、活体电穿孔法在不同组织上的应用
肌肉组织
在肌肉组织中最初进行外源基因活体导入是采用电穿孔法。选择肌肉组织作为靶组织是因为肌肉组织在体内所占比例很大,约占40 % ,而且外源基因可在肌肉中长期表达、分泌,在基因治疗中经常会用到。此外,外源基因也不会因肌细胞的分裂而丢失。
皮肤
皮肤组织相对于其他组织较难进行电穿孔法的基因导入,因为皮肤比较薄,电阻相对低,要求电流较高。但如果电流过大,会严重影响基因的表达,因此应适当降低电流和电压,延长电穿孔的时间。另外,由于皮肤组织含有的脂肪细胞分布不均,会干扰电穿孔的作用,因此只推荐用镊状电极,且应将动物被毛刮净后操作。虽然外源基因在皮肤中表达的时间较肌肉中短,但可利用活体电穿孔法对很多皮肤疾病进行治疗。
肝脏
由于肝脏的生理代谢十分旺盛,因此外源基因在肝脏中的表达时间往往很短暂,而且表达产物的水平也较低。为减少出血,可从小静脉注入，然后在肝脏上施加电场,能显著增强基因的表达。
睾丸
相对于其他的转基因方法,活体电穿孔法可使外源基因在睾丸中产生大量和持久的表达。此外,很多研究人员希望利用活体电穿孔法将外源基因导入精子, 进而通过授精得到转基因
动物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手术法将动物人为造成隐睾,大部分体细胞和分化了的精母细胞减少,这样使外源基因导入精原细胞的几率增加。Ryoki 等[14 ] 将基因与病毒诱导的整合酶基因共转染,可在精原细胞中检测到外源基因的表达,且病毒诱导的双基因共转染较单基因整合效率更高。但目前用这种方法获得转基因动物还较难。
禽类输卵管
对禽类输卵管活体电穿孔的研究很少,但这一方法却有很广阔的发展前景。因为输卵管腺体细胞具有很强的分泌功能,可以将大量蛋白分泌到鸡蛋中。也可以利用此瞬时表达系统检测含卵清蛋白启动子的载体功能。Park 等用活体电穿孔法以荧光素基因导入鸡输卵管上皮,检测到荧光素活性约4500RLUPmg 组织[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽类胚盘
这三种组织都是很脆弱的,如果实施基因枪法,会使靶组织因强烈的机械损伤而失去功能或直接导致发育停滞。Sakamoto 将血纤蛋白溶酶原激活因子基因导入眼睛中,有效抑制了眼睛在淤伤后血纤蛋白的反应。哺乳动物胚胎的电穿孔操作包括离体和子宫内操作。禽类胚胎基本是在蛋壳中进行电穿孔的,而且表达快速,Momose 等报道电穿孔施加后215 小时在鸡胚中就可以检测到外源基因的表达,这在使用病毒载体时也是不可能的。当电场被限定在一个很小的范围内时,基因可以定点表达, 这是活体电穿孔法的又一优点,Katahira 等[17 ] 证实可将外源基因导入鸡胚大脑、心脏和一些微小组织(如中胚层,间充质和体节) 中进行表达。
6、活体电穿孔法进行基因治疗及外源基因表达的调控
6．1 活体电穿孔法在基因治疗方面的应用
原来在基因治疗中利用活体电穿孔法将抗体或化疗药物导入肿瘤中,促进抗体和化疗药
物的运送来进行治疗,现在则以特异的外源基因替代了抗体的应用,简化操作步骤同时降低了费用。
首先,在皮肤瘤和脑瘤的治疗中,电穿孔法可有效地将药物基因导入治疗部位。电穿孔法导入人单核细胞趋化物蛋白基因到大鼠脑瘤后,该蛋白在肿瘤的局部表达,同时在基因导入的部位可观察到巨噬细胞和白细胞的聚集。
同时有科学家从另一角度研究电穿孔对治疗肿瘤方面的作用,利用高电场强度的陡脉冲促使肿瘤细胞发生不可逆性电击穿而最终死亡,这种方法很适于局部组织肿瘤的治疗。
此外,活体电穿孔法还可以参与癌症的治疗,通过活体电穿孔法将基因导入机体后,导入组织可成为分泌抗体等物质的临时分泌器官,以抵抗癌细胞的侵蚀或代偿由于癌细胞的侵蚀而造成的机体多种生理机能的丧失。
除了可以利用活体电穿孔法对肿瘤进行局部治疗外,还可以治疗机体的内分泌系统和免疫系统的疾病。可在机体局部以活体电穿孔法导入编码分泌型蛋白的基因,这种重组的治疗蛋白可以随着血液循环分布到全身各种组织和细胞进行治疗。如在活体电穿孔骨骼肌导入EPO 基因后,可通过红细胞比容值检测到EPO 基因表达产物的增加。Yasui 等在小鼠体内检测到活体电穿孔法导入的胃泌素基因的表达产物和人的单克隆抗体。
在不远的将来,研究人员可以选择机体的一种组织的某个位置作为活体电穿孔的靶位点,将治疗基因从该位点导入进而表达,因此又可以把这个特殊的组织当作机体的一个人造的内分泌或免疫组织,对病人进行相应的治疗。活体电穿孔法可对系统疾病产生作用并且安全有效。将不同类型的耐药基因同时导入造血细胞,以扩大耐药范围和进行体内选择是基因治疗的重要策略,这类载体基因片段大多较长,进行传统基因导入有一定的难度。有报道可以用活体电穿孔法将醛脱氢酶基因和多药耐药基因共转移并在PA317 细胞中获得高效表达,转导率达98 % ,测定药物蛋白表达较常规方法增高4 倍。此外电穿孔法有很高的经皮促渗作用,可进行很多经皮给药的治疗。
6．2 基因治疗中外源基因表达的调控
研究人员大都不希望导入的外源基因过度表达,尤其在基因治疗中,我们希望外源基因表达的诱导和抑制能够得到控制。目前这方面的研究主要包括两个方面:效应元件调节和生理活动调节。效应元件的作用,例如类固醇类激素诱导的效应元件中,在卵清蛋白启动子5′远端019kb 处有一个雌激素效应元件,将具有此元件的基因导入成年母鸡后,在其皮下注射糖皮质激素和雌激素,便可诱导外源基因的高效表达,表达量较未经激素诱导的对照组增加10 倍。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养 2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用 3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时 8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天 9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12.离心,弃上清液
13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散 15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
lipo2000转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection
电穿孔系统技术参数
多功能电穿孔系统 1、工作条件： 电源：100 – 120 VAC or 220 – 240 VAC, 50/60 Hz. 功率：最大240W 室温：0 - 35?C, 相对湿度：0 – 95%, (non-condensing) 2、总则用于原核和真核细胞电转化 3、详细技术指标及规格： 3.1 系统配置：带有方波输出功能的主机、原核细胞组件及哺乳动物细胞组件，0.1/0.2/0.4cm电激转 化杯。该细胞转化仪用于原核细胞、真菌以及哺乳动物细胞的电击转化试验，包括外源DNA导入和细胞融合等。 技术要求和参数： *（1）系统输出波形：指数衰减和方波两种输出，适合不同应用需要。 （2）输出电压：10 – 3,000伏，最小调节量1伏。 *（3）电容容量：10 – 500伏：25 – 3275 μF以25 μF 递增，适合哺乳动物细胞需要。 500 – 3000伏：10, 25, 50 μF三种调节，适应原核细胞要求。 （4）电阻（并联）：50 – 1,000 Ω以50 Ω递增，及无限大设置 *（5）样品电阻：在10 – 2,500 V时，最小20 Ω 在2,500 – 3,000 V时，最小600 Ω （6）方波放电时间：10 – 500 V档位: 持续时间0.05 – 10 ms时，以0.05 ms递增， 持续时间10 – 100 ms时，以1 ms 递增，
可设1 – 10 次脉冲重复，0.1 – 10 sec 间隔 500 – 3,000 V档位: 持续时间0.05 – 5 ms时，以0.05 ms递增， 可设1 – 2 次脉冲重复，5 sec 最小间隔 （7）主机： 输出波形：指数衰减和方波两种输出波形 输出电压; 200 – 3,000伏 放电容量：10, 25, 50 μF，三档调节 样品电阻：最小20 Ω，在10 – 2,500 V档位， 最小600 Ω，在2,500 – 3,000 V档位， 方波放电时间：持续时间0.05 – 5 ms时，以0.05 ms递增， 可设1 – 2 次脉冲重复，5 sec 最小间隔 *实验方法预存：24种程序预设，方便用户优化自己的实验条件 用户自定义方法储存：最多144个程序方便用户储存自己的实验方法。 脉冲波形检测：实时监测并显示脉冲波形。 （8）原核细胞系统 *输出波形：指数衰减或方波 输出电压; 200 – 3,000伏 放电容量：10, 25, 50 μF *样品电阻：在10 – 2,500 V ，20 Ω最小 在2,500 – 3,000 V，600 Ω最小 *方波放电时间：持续时间0.05 – 5 ms以0.05 ms递增， 1 – 2 次脉冲，5 sec 最小间隔
ECM830多功能型细胞电穿孔 细胞转基因活体导入系统 简介 ...
ECM830多功能型细胞电穿孔 细胞转基因活体导入系统 简介： ECM830可以满足所有体外和体内电穿孔研究的需要，并可对预处理的动、植物细胞进行融合。该型号具有精细的电压调节，可监控所有参数，可调整脉冲间隙，这些细节是其优异品质的内在保证。特别需要指出的是，配合BTX 提供的专用附件，可以轻松进行诸如活体转基因和导入蛋白，多肽及其他药物的研究和治疗。 应用： ?哺乳动物细胞转染 ?体外／体内／离体／卵内实验 ?核移植 ?植物组织和原生质体的转染 ?细菌和酵母的转化 可靠性： 方形波技术保证了更高的效率和哺乳动物细胞存活率。 通用性： 利用BTX多种专业电极和新型的BTX MOS多孔板电穿孔仪，可以将仪器运用到各种电穿孔领域。 监控仪选配 新的VIP 3000可以允许用户监控和记录下电穿孔过程中的主要电参数。利用选配的通讯模块，就可以把数据下载到电脑上或在打印机上打印出来。 多孔板电穿孔仪 新的MOS-多孔优化系统利用BTX-ECM电源发生器可为研究人员提供先进的多孔技术。 ECM830是为体外和体内电穿孔设计的方形波电穿系统。BTX方形波技术为研究者提供了更高的细胞转染率和存活率。ECM830应用范围广泛，包括了哺乳动物细胞和植物细胞转染，胚胎操作，核转移以及细菌和酵母转化。ECM830的主要特点包括了：5至3000伏的电压范围；精确的电压调进，10微秒至10秒的脉冲范围，可控制的脉冲间隔，电弧淬灭功能（arc Quenching）可显示真实电压及脉冲波长数字显示屏。更为客户提供了两年的质量保证。 ECM830主机可和BTX的各种专业及配件结合使用，使分子或药物的体外／体内导入实验更加得心应手。 技术规格 操作状态：启动后内部自检 界面：数字用户界面 输入：110V／220V通用 充电时间：最大5sec(没有延迟) 电压范围：5－500V电压模式／1V分辨率 505－3000V高电压模式／5V分辨率 波长范围：10μsec─999μsec低电压模式／1μsec分辨率
电转染操作流程
Neon TM 电转染一般流程 1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达 到70-90%。 2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500μl ，放于37℃培养箱预热。（注：使用 其他孔数培养板或者100μl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml 的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750μl 胰酶消化3min ，加入750μl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。 4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。 5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。 6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。轻轻 吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低） 7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA 和 接种体积见下表1）。 8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。 9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。 10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10μl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。 11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。 12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。 13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。 14．实验结束后，倒掉移液器中E 液，关闭电转仪。 注意：1．加R 液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（2.0×107）。 2．加入质粒体积=加入质粒的量/质粒浓度。 3．加入细胞悬液体积=需加细胞数量/细胞悬液浓度。 4．每个枪头最多只能用2次。 5．Neon TM 管装入的3ml 电解缓冲液E 可用10次电转化。 6．Neon TM 管中加入3ml 电解缓冲液，用10μl 枪头时加E 液,100μl 枪头时用E2液。 表1 NeonTM 枪头 平板培养基的体积 细胞数量（个） 规格 每孔表面积(cm2) DNA(μg) 10μl 100μl 96孔 0.3 0.2-0.3 √ 100μl 1-3×104 48孔 0.7 0.3-0.7 √ 250μl 5-7.5×104 24孔 2 0.5-1.5 √ 500μl 0.5-1.5×105 12孔 4 0.5-3.0 √ 1.0ml 1-3×105 6孔 10 2.0-4.0 √ √ 2.0ml 0.5-1×106 60mm 20 4.0-8.0 √ 5ml 2-4×106 10CM 60 8.0-16 √ 10ml 4-8×106
细胞电转染系统技术参数
细胞电转染系统招标参数 1．工作条件 1.1.环境温度：10-35℃ 1.2.相对湿度：20-80% 1.3.工作电压：220V 50Hz 2.技术指标 *2. 1 用途：用于基因转染实验，适用于各种贴壁细胞和悬浮细胞、包括难转染的血液系统细胞和干细胞等 2. 2 系统原理：综合应用电穿孔方法及细胞特异性的电极液，通过调整优化电转参数，可直接将多种转染物导入细胞中，可实现瞬转和稳转两种技术方式。 *2.3转染物：质粒DNA、RNA等； 2.4 实验操作：针对各种细胞有优化好的实验条件数据库，无需优化； *2.5 能提供配套的转染试剂耗材； 2.6 耗材一次性无菌设计，细胞不与仪器接触，无需清洗仪器； 2.7 电极材料：使用高分子聚合物电极材料，非金属电极； 2.8 转染体系：可进行100ul体系、20ul体系2种规格转染； 2.9 仪器内置2个100ul电极杯孔位，16个板条孔位； 2.10 操作界面：触摸屏操作； 2.11 仪器升级：可通过USB接口与电脑连接进行软件的升级和数据的传送，软件可免费从网站下载更新； 2.12 有实验数据支持：外源基因可直接入核。转染速度快，最快转染GFP 2小时后即可观察到蛋白的表达情况； 2.13 仪器未来可添加模块以实现贴壁细胞直接转染（如神经元、血管内皮细胞等）； 2.14仪器未来可添加模块以实现高通量转染（96孔转染）； 2.15仪器未来可添加模块以实现大体积转染（1mL和20mL）； 2.16该仪器具有专用配套试剂、耗材； *3. 仪器配置要求 3.1细胞电转染主机：一台（含转染系统核心模块和系统配套X模块） 3.2微生物电转化仪：一台（可用于细菌和酵母菌的电转化） 3.3配套凝胶成像：一台（用于ECL、ECL Plus、Western、Northern、Southern等样品的发光成像和分析，用于电化学发光、生物芯片发光检测、植物活体成像、菌落活体成像等检测，CCD相机冷却温度：≤-65℃提供FLI厂家证明文件，标配F0.80镜头，无需改装校正光圈即可达到F0.8，上下双层样品台设计，可兼容拍摄样品厚度0.01mm - 10cm，可自由选择曝光识别区域，实现精确自动曝光） 3.4 配套试剂：试剂包95个（100μl 体系可做24反应，首批提供60个其他按用户需求
大肠杆菌电转化
大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法 实验步骤： 1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养。 2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。 3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。 4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。 5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。 6、细胞在4℃5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天）。 7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。 9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。 10、离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。 11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。 12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80℃保存。 转化方法: 1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。
2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。 3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。 4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。 5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。 6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。 7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。 8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法 （一）脂质体转染 一、实验试剂及器材 Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM?减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。 二、实验步骤 1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染； 2. 使用Opti-MEM?减血清培养基稀释Lipofectamine? 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM?培养基为125 μL× 2，Lipofectamine? 3000为 3.75和7.5 μL）； 3. 在每管已稀释的Lipofectamine? 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）； 4. 室温孵育5分钟； 5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中； 6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。 三、注意事项 1. 在无血清培养基（如Opti-MEM?减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine? 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）； 2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；
3. Lipofectamine? 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine? 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染； 4. Lipofectamine? 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。 附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：
电沉积法制备泡沫铁
电沉积法制备泡沫铁 作者张凤鑫 摘要——以聚氨酯泡沫为基体，经预处理，化学沉积、电沉积和焚烧及热还原工艺制备了均匀分布三维网状孔结构的、高空隙率（>95%）且具有一定拉伸强度的泡沫铁材料。通过生物显微镜观察了制备过程各步骤产品的形貌。 关键词电沉积制备泡沫铁 ABSTRACT A novel method for preparing very porous foamy iron was proposed , in which the polyurethane foam as substrate was processed by pret reatment , electrodeposition and roasting-reduction . The foamy iron presents a three-dimensional network structure with high porosity , uniformity , mechanica l strength and tenacity . KEY WORDS Electrodeposition , Manufacturing , 一. 前言 发泡金属又称泡沫金属，是一种新型的功能材料，从结构上可分为多泡性发泡金属和通透性发泡金属两种，前者含有大量独立存在的气泡，而后者则以连续畅通的三维多孔结构为主。由于结构不同，性质也有很大的差异，具有不同的用途。 发泡金属的制备方法有很多种[1]，包括有铸造法，粉末冶金法、烧结法、沉积法和高压浸透法，气相蒸发沉积法等。 本实验是采用电沉积法制备发泡金属铁，是指在通电条件下，溶液中的金属离子沉积在基体上的电镀过程。所谓的电镀过程，它是一
Bio-rad Gene Pulser Xcell电穿孔系统(中文)
Bio-rad Gene Pulser Xcell电穿孔系统 一Gene Pulser Xcell电穿孔系统介绍 电穿孔的过程中可以有2种波型来控制外界电压的变化，Gene Pulser Xcell可以提供2种波型，即指数波和方波。 1.Exponential Decay Wave（指数波） 所谓指数波的方式，就是将已经充电到指定电压的电容进行快速的放电，放电的方式是以指数的形式进行的（如上面的slide显示）。该种方式的电穿孔取决于2个参数，电场强度(kV/cm)和时间常数(ms)。在实验过程中，采用具体的电击杯调整电压即可调整不同的电场强度。此外，电容和电阻的具体值也可以在Gene Pulser Xcell的界面上进行设置。
?电容器充电到预定的电压(V0)放电后，即向样品释放脉冲，细胞表面的电压随时间按指数方式下降的 ?电容器的电压值达到峰值释放脉冲后迅速的衰减 ?电场强度E (V/cm) 是用来描述电击杯外界电场环境的一个参数（E=V/d ） ?脉冲时间是一般用时间常数来进行衡量(~37% of V0，V0/e) ?脉冲的时间是由电阻和电容的大小所决定的 备注：PC module作用 PC（Parallel Capacitor）模块的本质就是在放电回路中在样品上并联一套电阻。在放电回路中设置PC模块的目的：如果实验样品具有很高的电阻值，那么脉冲就需要维持相当长的时间，这样对细胞是会有损伤的，长时间的电场作用会导致细胞的裂解。并联了PC模块后对样品而言电击是的电压并没有变化，但是PC 模块起到了分流的作用，可以使得脉冲的时间常数大大减小，可有效的维持细胞的活性。并联了PC模块后，时间常数取决于该模块的电阻，电阻越小，那么放电的时间也就越短。 2. Square Wave（方波） 对于某些细胞而言，采用指数波进行实验特别容易导致细胞的死亡。对于这种细胞而言，采用方波的形式来进行电穿孔既可以进行有效的转染，又可以很好的保护细胞，维持细胞的活性。方波的形式通常用以下的参数来进行描述：电压、脉冲时间、脉冲次数和脉冲间的间隔时间。上述所有的参数都可以在Gene Pulser Xcell的操作界面上方便的设置。在实验结束后，Gene Pulser Xcell还可以显示实验中这些参数的具体值。 方波的本质和指数波是一样的，区别在于电压还没有下降为0的时候，电容器的放电已经被截止了。所有的方波都会有电压的细微下降，以其始的电压值的百分比计算。一般下降率不超过5%。
活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo ...
活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。 活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。 2、活体电穿孔的法的特点 活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面: 首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。 在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。 其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的Y AC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。 此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。 但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。 由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在 1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月。
电沉积方法制备纳米晶Ni_W合金工艺研究
V o.l 38 No .2 A pr .2009 SURFACE TECHNOLOGY 电沉积方法制备纳米晶N i W 合金工艺研究 吴化1 ,韩双1 ,吴一 2 (1.长春工业大学材料科学与工程学院,吉林长春130012;2.空军航空大学基础部,吉林长春130022) [摘 要] 为了进一步优化镀液成分和工艺参数,为制备W 含量可在较大范围内变化的块状纳米晶N i W 合金提供依据,采用不含任何氨根离子(NH +4)的镀液通过电沉积方法制备纳米晶N i W 合金镀层。采用XRD 、SEM 和EDS 对镀层的结构、形貌和成分进行观察和分析。结果表明:电沉积过程中电流密度、电源类型、p H 值及搅拌方式对镀层的W 含量都会产生较大的影响。试验中所得到的N i W 合金镀层的W 含量为2.15%~30.31%(质量分数),其结构均为W 溶于N i 晶格所形成的置换式固溶体,平均晶粒尺寸为14~19n m;随着镀层中W 含量的增加,镀层的显微硬度也随之逐渐提高。 [关键词] N i W 合金;纳米晶;电沉积[中图分类号]TQ 153.2 [文献标识码]A [文章编号]1001-3660(2009)02-0065-05 Study on Process Cond iti ons of E lectrodepositi on of N anocrystalli ne N i W A ll oys WU H ua 1 ,HAN Shuang 1 ,WU Yi 2 (1.Depart m ent o fM aterial Sc i e nce and Eng i n eeri n g ,Changchun Un iversity of Techno logy ,Changchun 130012,Ch i n a ; 2.Depart m ent of Foundation ,The A ir Force A v i a ti o n Un iversity ,Changchun 130022,Ch i n a) [A bstract] I n order to opti m ize the bath co m positi o n and process para m eters ,a lso to provide a basis for prepar i n g bulk nanocrystalline N i W all o ys w ith w ide content range ofW,plati n g bath w ithout any for m s o fNH + 4w as utilized to synthesize nanocrystalli n e N i W coa ti n g .XRD (X ray d iffracti o n),SE M (scann i n g electr on m icroscope)and EDS(en er gy dispersi v e spectroscopy)w ere used to characterize the structure ,surface m orphology and co m positi o n o f t h e coating .The resu lt sho w s that current density ,po w er type ,p H value and ag itati o n conditi o n have si g nificant effect on theW con tent of the coati n g .The W content o f the N i W coati n g obta i n ed is 2.15% 30.31%(m ass fraction).The N i W coati n g is a disp lace m ent solid solution m ade up o f so l v entN i and so l u teW,w ith the average gra i n size of 14~19n m.W it h the i n creasi n g of the W conten,t t h e m icrohardness o f the coati n g also increases . [Key w ords] N i W a ll o ys ;Nanocr ystalli n e ;E lectrodepositi o n [收稿日期]2008-11-19 [作者简介]吴化(1957-),男,吉林长春人,教授,博士,研究方向为材料表面改性、材料强韧化。 0 引 言 N i W 合金具有较高的熔点和硬度及较好的耐磨性和耐蚀性,且抗高温氧化,易脱膜,不粘着,对环境没有污染,因此作为镀铬层的替代镀层被广泛应用于轴承、气缸、活塞和铸造模具、热锻模具等的表面强化[1 4]。此外,N i W 电沉积层还可作为功能性镀层应用于微电子系统、微电子机械系统和超大规模集成电路(U LSI)中[5]。 随着纳米材料成为材料领域内的研究热点,电沉积方法作为制备纳米材料的基本方法之一,具有投入少,生产率高,受形状和尺寸的限制较小,可制备出接近于完全致密的纳米材料以及便于由实验室研究向工业化大规模生产转化等优点,逐渐成为大量制备纳米材料的最有前途的方法之一 [6] 。在常规电沉 积方法制备N i W 合金工艺的基础上,通过加入添加剂或适当控制温度、电流密度和p H 值等工艺参数,便可以制备出纳米晶 N i W 合金[7]。纳米晶N i W 合金除具有常规N i W 合金的优点 外,还兼具纳米材料的很多特性,具有更为广泛的应用前景,特别是由于N i W 合金本身的特点,还可以作为模型用于研究纳米金属材料的变形机理[8]。 由于在还原过程中存在电化学阻力,W 无法单独从钨盐的水溶液中沉积出来。但在铁族金属Fe 、Co 和N i 的存在下,W 很容易从其含氧阴络离子(即钨酸阴离子)中与N i 、Co 等共同析出,形成具有良好外观及优异性能的二元或三元合金镀层[9]。用于进行N i W 合金电沉积的镀液通常采用柠檬酸(盐)体系、酒石酸盐络合剂体系、焦磷酸盐体系、酸性体系和氨基磺酸盐体系[10 14]。在这些镀液体系中,常添加氨水或氨盐来调节镀液的p H 值以及提高法拉第效率。但需要注意的是,NH +4本身作为一种络合剂,也可以与镍离子形成二元络合物: N i 2++n NH 3 [N i(NH 3)n ]2+ (1) 其中,n =2~6。 研究表明,在N i W 合金电沉积的过程中,W 仅能从钨酸根离子与镍离子及柠檬酸根离子形成的三元络合物[(N i)(HWO 4)(C it)]2-或[(N i)(H 2W O 4)(C it)]-中沉积出来(络离子所带电荷数与镀液的p H 值有关),而N i 除了可从上述2种 65
美国伯乐电转化仪使用说明
Gene pulser xcell TM Electroporation system quick guide 产品名称: Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 产品型号: Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 产品展商: 众磊（北京）生物科技发展有限公司驻沪办 简单介绍 Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 Gene Pulser Xcell 电穿孔系统的详细介绍 【介绍】 电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术可以将核苷酸、DNA 与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。Gene Pulser Xcell 系统的设计，基于Bio-Rad 15年来在电转化技术上经验积累，它提供指数波和方波波型选择、系统配置选择及友好的用户界面。 主要特点指数波和方波波型确保所有细胞类型（原核及真核）均可获得最佳的电转化效果Bio-Rad 专利的* PulseTrac 电路和电弧保护设计，确保可重复性并保护样品模块化设计可根据研究需要选择系统用户友好的数字化界面，具有直观的编程以控制所有参数，包括附属模块的参数包括人工操作、预设规程、用户规程、一个优化规程及其它先进功能等程序选择 指数波或方波脉冲选择 Gene Pulser Xcell 系统可产生指数波和方波波型，使你选择最适合你细胞的波型与规程。指数波和方波均能有效地用于电转化及电融合。电穿孔波型对不同类型细胞的转化效率有很重要的影响。 左，指数衰变脉冲。当一个充电至电压为V 0 的电容器放电到细胞，加在细胞上的电压随时间以指数方式下降。从起始电压下降到V0 / e 所需的时间称为为时间常数τ, 一种方便的脉冲时间表达方式。 右，方波脉冲。放电到样品后截断电容器脉冲可产生方波脉冲。脉冲时间为细胞被放电的时间。所有方波设备都会产生细微的电压下降。这种电压下降称为脉冲下垂，并以起始电压的百分比计量。 PulseTrac 电路和电弧保护提供可靠的、可重复的和安全的性能Bio-Rad 独创的专利微处理器控制电路能为任何规程提供可重复的结果，无论使用何种介质，它所产生的电压值可在全世界范围内测试。PulseTrac 电路和电弧保护： ●确保电压准确地传送到电击杯 ●把CE 模块中的低压电容器精确度从20% 提升到10% ●便于电容器再校正，以保持精确的脉冲指标，修正电容器随着时间而发生的偏移 ●提供脉冲前样品电阻测量 ●当脉冲或电路中断时，可安全地自动放电降 ●低电弧危险，保护设备及样品 用户友好界面，便于编程和控制 主单元上的图形界面可控制包括任何连接的附属模块在内的所有功能。界面由一个通过功能键和字母数字键盘 操作的屏幕组成。根据屏幕提示进行简便而直观的编程。屏幕用于编程和显示储存与设定的程序、运行参数以及波型。规程包括： ●人工编程以输入或编辑方波或指数衰变脉冲的所有参数 ●辅助编程需要的时间常数 ●预设有适合常用细菌、真菌和哺乳动物细胞株的优化程序
不可逆电穿孔治疗前列腺癌的研究进展
不可逆电穿孔治疗前列腺癌的研究进展 摘要：前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤，其治疗方式有手术、放疗、化疗、内 分泌治疗及局部微创介入治疗等。传统前列腺癌根治术和放疗对癌症的控制效果 较好，但会引起侧支组织损伤且有较强的毒副作用；而局部热消融的精度不高， 易导致消融不完全。不可逆电穿孔作为一项先进的介入技术，具有消融范围精准 和消融效果良好的优点，目前已有多个国家开展相关临床研究。本文就不可逆电 穿孔消融的原理及其在前列腺癌治疗中的主要进展进行综述。 关键词：前列腺癌；不可逆电穿孔；介入治疗 前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）是最常见的男性恶性肿瘤之一，其发病率 随着年龄的增长而显著增加。在中国，PCa是继肺癌后，男性死亡率最高的癌症。PCa主要的治疗方法有外科治疗、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗及局部微创 介入治疗。前列腺近端有许多重要结构，如直肠、尿道、神经血管束等，PCa根 治术作为常规治疗方法，易对上述结构造成破坏，导致严重的并发症。以能量效 应为基础的微创介入疗法，包括冷冻消融、射频消融和微波消融等，为避免并发症，靠近血管及邻近正常组织器官的肿瘤常常消融不完全。 不可逆电穿孔（Irreversible Electroporation，IRE）是一种新的非能量消融方式，它利用强有力的电脉冲，在细胞膜上产生不可逆的穿孔，使得细胞内外物质自由 流动，从而导致细胞内物质紊乱，进而导致细胞凋亡。与热消融相比，IRE的机 制是不受能量影响的，这使得在热敏感结构附近的肿瘤也可消融完全。优化后的 脉冲参数和电极布置使治疗期间的血管和神经得以保护，利于患者的功能恢复。 这些优点使IRE在临床中得以广泛应用。 1.临床研究 2015年，Ting等[1]第一次对IRE治疗PCa的结果进行研究，他们选取了32 个未经手术治疗的中等风险的PCa患者，使用3-6个电极以5mm以上的安全距 离排列消融肿瘤。随访调查并发症，术后6个月进行MRI检查、术后7个月进行 活检，并将治疗区域内的发现细分为内野、临近区域和外野。结果显示在6个月时，泌尿、肠道及性功能未明显下降。一般身心健康评分在术后6个月时未显著 下降，且在整个随访期间保持稳定。在肿瘤方面的随访活检中，16/21（76%）的 组织学标本上未见明显疾病，8/21（38%）的组织学标本上未见癌症。综上所述，对于中早期PCa患者，局灶性IRE治疗安全可靠、并发症发生率低。 2016年，Kaite等[2]对25名经IRE治疗的PCa患者进行回顾性分析。对患者 随访至少6个月，最终随访时间的中位数为10.9个月。2例发生3级并发症包括 附睾炎和尿路感染。14例发生2级及以下的并发症，主要包括血尿、尿路感染等。25例患者中，4例（16%）在术后6个月的随访活检中发现消融区肿瘤复发。术 前泌尿功能正常的患者，在术后6个月和12个月后分别有出现12%和6%的泌尿 功能异常，术后12个月时只有1名患者出现勃起功能障碍，2个病人（8%）出 现尿失禁。结果证明了IRE治疗局限性PCa是可行和安全的。 2016年，Massimo等[3]报告了一项关于不可逆电穿孔治疗局灶性PCa的前瞻 性研究，主要目的是确定病灶的副作用，次要目标包括确定特定领域的不良反应 概况、早期疾病控制率和三叉神经痛发生率。在研究过程中，16名患者完成了所 有的临床试验和12个月的随访。所有16名男性患者在术后12个月时均无漏尿。
大肠杆菌电转和文库扩增
科隆生物医学有限公司·保密 大肠杆菌基因电转化(1) (制剂范围可以放大或缩小） 感应态菌制备 培养液和制剂： -无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板 -2×LB或YT培养基500毫升 -SOC培养基 -冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升 -冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升） -预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。 方法： 1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。 2 。用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。一个小时以后，每20分钟测定OD600值。 3 。当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。 4 。转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。 5 。通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。 6 。通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。 7 。通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。 8 。通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。 9 。测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml ?OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。 10 。转移40微升的悬浮于冰冷的电穿孔杯中（0.1厘米间隙）并放电施加是否发生电弧（请参阅下文第12到18步）。如果是这样，用冰冷的10％甘油洗涤的细胞悬浮液的剩余部分再次，以确保细菌悬浮液的导电率足够低（<5毫当量）。 11 。如无电弧发生，就进行存储，分配所述40微升细胞悬浮液等份放入无菌的，冰冷的0.5 - ml离心管，并立即转移到-80 ℃的冰箱中。 12 。加入10毫微克，容积不超1-3微升DNA 到每个离心管，并在冰上孵育管60秒或以上。包括所有适当的阳性和阴性对照。质粒量为细胞体积不能达到十分之一。 13 。设置电转仪提供的电容25μF ，2.5千伏和200欧姆电阻的电脉冲。 14 。转移DNA /细胞混合物倒入冷电比色皿，并确保细菌和DNA的悬浮坐在试管的底部。干燥凝结和湿气的反应杯的外侧。将试管中的电穿孔设备。 15 。在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。12.5千伏/厘米的探测或磁场强度的时间常数应该在屏幕上显示。 16 。尽可能快的脉冲后，取出电穿孔杯，在室温下, 加入0.5 ml SOC培养基。 17 。将细胞转移到一个含有0.5毫升SOC的17 ×150毫米的聚丙烯管中，于37℃下慢转动（250转）培养1小时. 18．涂0.5hml 培养液`于抗菌素LB板上,370C下隔夜培养, 检测转化效率.
电沉积理论
金属电沉积理论 一.研究概况 在电化学中,金属的电化学沉积学是一种最古老的学科。在电场的作用下，金属的电沉积发生在电极和电解质溶液的界面上，沉积过程含有相的形成现象。 首先，在金属的电化学沉积实验的研究时间要追溯到19世纪，并且在引进能产生直流电的电源以后，电镀很快成为一种重要的技术。电镀被用来制造各种不同的装饰性和功能性的产品，尽管在开始的早期，电镀技术的发展和应用建立是在经验的基础上。 金属电沉积的基本原理就是关于成核和结晶生长的问题。1878年，Gibbs 在他的著名的不同体系的相平衡研究中，建立了成核和结晶生长的基本原理和概念。20世纪初，Volmer、Kossel、Stransko、Kaischew、Becker和Doring用统计学和分子运动模拟改进了基本原理和概念。按照这些早期的理论，成核步骤不仅要求一个新的三维晶体成核，而且完美单晶表面的层状二维生长。对于结晶理论的一个重要改进是由Avrrami提出的结晶动力学，他认为在成核和生长过程中有成核中心的重复碰撞和相互交迭。在1949年，Frank提出在低的过饱和状态下的一个单一晶面成长会呈螺旋状生长。Cabrera和Frank等考虑到在成长过程中吸附原子的表面表面扩散作用，完善了螺旋成核机理。 20世纪二三十年代，Max、Volmer等人对电化学结晶进行了更为广泛的基础研究。Erday-gruz和Volmer是第一次认识到过饱和度与过电位，稳态电流密度和由电荷转移引起的电结晶过电位之间的关系。 20世纪三四十年代，Finch和他的同事做了大量的关于多晶电化学沉积的实验，研究了决定结晶趋向与金属薄膜的组织结构的主要因素。在这一时期，Gorbunova还研究了底层金属与电解质溶液组成对电结晶过程的影响，并发现了由于有有机添加剂的吸附作用可能导致金属晶须的生长。 1945年，Kaischew对电结晶理论做了重大改进。考虑到单一晶体表面上金属原子的结合和分开的频率，可利用分子运动学模拟电化学结晶过程。这项工作对电结晶理论的发展有着重大的影响。 20世纪50年代是在电化学结晶理论与实验技术取得重大进步的阶段。Fincher等人完成在实际的电镀体系中抑制剂对电结晶成核与生长的影响的系 统研究，并按照其微观结构和形态对金属电沉积进行了分类。Piontell等人对基体的取向作用和在金属沉积系统中同向和异向的金属沉积的阴离子的特性进行了进一步的研究。 Kardos、Kaischew等人利用新的实验技术证实Volmer`s 的三维形核的正确性。 Wranglen，Vermilyea等人对结晶树枝状生长进行了深入的研究，提出了新的电化学结晶的理论模型。 20世纪60年代初，Flischman和Thirsh发展了在电结晶状态下多重成核与生长的一般理论，后来Armstrong和Harrason建立和完善了电化学多重成核及