电穿孔转染质粒DNA

质粒的构建：

1. 酶切反应

按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10×缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA 已稳定内切酶活性。

2. DNA片断的回收

欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃10分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。再用BufferB洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。

3. DNA片断3凹端的补平

于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul,加水至19ul。然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。待补平反应结束后，于65℃水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20℃保存备用。

4. DNA片断3凸端的补平

于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul。,加水至19ul。然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12℃温育15分钟，于75℃加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。

5. 载体的脱磷酸化：

载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10×CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。

CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol 5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol 5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug 5kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol 5端磷酸。

反应条件：1）5突出末端：加入CIAP后于37℃反应30分钟，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，继续反应30分钟。2）5凹或平末端：加入CIAP后于37℃反应15分钟，56℃反应15分钟，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，又于37℃反应15分钟，56℃反应15分钟。

反应结束后，加300ulCIAP反应终止液（10mM Tris-Cl pH 7.5,1mM EDTA pH7.5,200mM NaCl,0.5%SDS）,依次用酚、酚/氯仿和氯仿抽提，加0.5倍体积7M醋酸铵，2倍体积酒精沉淀，室温晾干，溶于适量TE缓冲液中。

6. 连接反应

用适当的内切酶酶解载体和插入片断，DNA片断回收后电泳检查比较二者的浓度，按载体：插入片断1：4-6的比例将二者加入到连接反应体系中，加入10×连接缓冲液1ul,补水至10ul,取出1ul 作连接前对照，然后加入1单位的T4DNA连接酶（平末端连接加入5单位的T4DNA 连接酶），12-14℃水浴中过夜，平末端连接在20-22℃进行。次日，转化大肠杆菌感受态细胞。

7. 感受态大肠杆菌制备

将宿主菌的单菌落接种到5ml LB培养基中，37℃振摇过夜，次日，取1/50体积的过夜菌液接种到50-100mlLB培养基中，37℃振摇，待菌液OD600 接近0.3-0.4时，于4℃4000转离心10分钟，收集菌体，取原菌液体积的1/5体积预冷的0.1M CaCl2溶液，轻轻加至菌体中，冰浴上轻轻摇动离心管，使菌体缓慢散开，冰浴静置20分钟，4℃离心，弃上清。重复上一次操作，同样条件离心收集菌体后，向菌体中加入1/50体积预冷的CaCl2,混匀，冰浴静置12小时后用于转化。感受态细胞于4℃保存一周仍可维持较高效率，或加入1/10体积的DMSO冻存于-70℃保存。

8. 转化

取新鲜制备的感受态细胞溶液100ul置于1.5ml管中，加入5-10ul连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置30分钟，然后置于42℃水浴中热休克90秒，加入0.5ml LB培养基，37℃振摇40分钟，然后接种于含氨卞青霉素的LB平板上，37℃孵箱培养10-12小时后观察菌落生长情况。或用快速转化法：取新鲜制备的感受态细胞溶液100ul置于1.5ml管中，加入5-10ul连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置5分钟，然后涂布于经37℃预热2小时的含氨卞青霉素的LB平板上，37℃孵箱培养10-12小时后观察菌落生长情况。该方法适用于质粒和粘端连接产物的转化。

9. 质粒DNA的小量制备

在1.5mlEppendorf管中，加入过夜培养的转化细菌液，12000转离心30秒，弃上清，加入100ul溶液Ⅰ（25mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA pH 8.0,50mMSucrose）震荡混匀，在加入200ul溶液Ⅱ（0.2M NaOH,1%SDS）混匀后室温变性5分钟，加入150ul溶液Ⅲ（3M KAC,pH4.6）混匀中和5分钟，12000转离心5分钟，转移上清至另一Eppendorf管中，加入1ml 无水乙醇，-20℃静置5分钟，12000转离心5分钟，70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于50ulTE缓冲液中。

10．质粒DNA的大量制备

将宿主菌的单菌落接种到含适当抗菌素的5ml LB培养基中，37℃振摇培养过夜，次日，取

0.1ml过夜菌液接种到含抗菌素的25mlLB培养基中，37℃振摇培养到OD600 接近0.6，将25ml培养物转移至含抗菌素的500mlLB培养基中，37℃振摇2.5小时（OD600约为0.4），加入2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml）, 37℃振摇培养过夜，于4℃4000转离心10分钟，收集菌体，用20ml含溶菌酶（5mg/ml）的溶液Ⅰ（25mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA pH 8.0,50mMSucrose）悬浮细菌，室温静置5分钟，加入新鲜配置的溶液Ⅱ（0.2M NaOH,1%SDS）40ml，冰上混匀变性10分钟，加入30ml溶液Ⅲ（3M KAC,pH4.6）中和10分钟。4℃12000转离心20分钟，转移上清至另一管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置30分钟，室温12000转离心15分钟，用70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于8mlTE缓冲液中

,称取8gCSCl加至DNA溶液中，加入0.6mlEB（10mg/ml）溶液中,于20℃，45000转离心24小时，用毛细管吸出质粒DNA区带。水饱和正丁醇抽提数次去除EB，用4倍体积ddH2O稀释含CSCl的DNA溶液，再用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,-20℃静置1-2小时，于4℃15000转离心20分钟，用70%乙醇沉淀一次，室温晾干后，荣誉适量的（0.5-1ml）TE缓冲液中，电泳检查DNA质量，读取OD260与OD280，计算DNA浓度与纯度。

电穿孔转染质粒DNA

1) 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前处于对数生长期。

2) 胰酶消化收集贴壁细胞，离心收集细胞。用电转缓冲液洗细胞两次。电转缓冲液为磷酸缓冲液。

3) 弃上清，用0.5ml电转缓冲液重悬细胞，细胞浓度最好在2×106-2×107之间。细胞悬液移入0.4cm电转杯中，加入5-40ug质粒，轻弹混匀。置于冰上10分钟。

4) 电击。对大部分哺乳动物细胞，电压为250-400伏，即625-1000v/cm，电容为960uF。在此条件下，电击时间大约在30-50毫伏。不同的细胞电转的最适条件不同，细胞电击后死亡率在40%-60%左右时转染效率最高。

5) 电击结束后，将细胞置于冰上10分钟。有文献报道，电击前后置于冰上10分钟可提高转染效率。

6) 电击后，细胞移入非选择性培养基培养。培养24小时后，计数，稀释15倍以上，用选择培养基培养。2-4天换液，直至抗性克隆形成。如用于筛选单克隆，HeLa细胞电击24小时后计数，细胞用选择培养基（G418,0.5mg/ml）稀释，以1000细胞/孔的密度传于96孔板。培养10天左右，既有克隆形成。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

lipo2000转染操作步骤

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection

电穿孔系统技术参数

多功能电穿孔系统 1、工作条件： 电源：100 – 120 VAC or 220 – 240 VAC, 50/60 Hz. 功率：最大240W 室温：0 - 35?C, 相对湿度：0 – 95%, (non-condensing) 2、总则用于原核和真核细胞电转化 3、详细技术指标及规格： 3.1 系统配置：带有方波输出功能的主机、原核细胞组件及哺乳动物细胞组件，0.1/0.2/0.4cm电激转 化杯。该细胞转化仪用于原核细胞、真菌以及哺乳动物细胞的电击转化试验，包括外源DNA导入和细胞融合等。 技术要求和参数： *（1）系统输出波形：指数衰减和方波两种输出，适合不同应用需要。 （2）输出电压：10 – 3,000伏，最小调节量1伏。 *（3）电容容量：10 – 500伏：25 – 3275 μF以25 μF 递增，适合哺乳动物细胞需要。 500 – 3000伏：10, 25, 50 μF三种调节，适应原核细胞要求。 （4）电阻（并联）：50 – 1,000 Ω以50 Ω递增，及无限大设置 *（5）样品电阻：在10 – 2,500 V时，最小20 Ω 在2,500 – 3,000 V时，最小600 Ω （6）方波放电时间：10 – 500 V档位: 持续时间0.05 – 10 ms时，以0.05 ms递增， 持续时间10 – 100 ms时，以1 ms 递增，

可设1 – 10 次脉冲重复，0.1 – 10 sec 间隔 500 – 3,000 V档位: 持续时间0.05 – 5 ms时，以0.05 ms递增， 可设1 – 2 次脉冲重复，5 sec 最小间隔 （7）主机： 输出波形：指数衰减和方波两种输出波形 输出电压; 200 – 3,000伏 放电容量：10, 25, 50 μF，三档调节 样品电阻：最小20 Ω，在10 – 2,500 V档位， 最小600 Ω，在2,500 – 3,000 V档位， 方波放电时间：持续时间0.05 – 5 ms时，以0.05 ms递增， 可设1 – 2 次脉冲重复，5 sec 最小间隔 *实验方法预存：24种程序预设，方便用户优化自己的实验条件 用户自定义方法储存：最多144个程序方便用户储存自己的实验方法。 脉冲波形检测：实时监测并显示脉冲波形。 （8）原核细胞系统 *输出波形：指数衰减或方波 输出电压; 200 – 3,000伏 放电容量：10, 25, 50 μF *样品电阻：在10 – 2,500 V ，20 Ω最小 在2,500 – 3,000 V，600 Ω最小 *方波放电时间：持续时间0.05 – 5 ms以0.05 ms递增， 1 – 2 次脉冲，5 sec 最小间隔

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

siRNA说明书

产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20 C?-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。 使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻 融（尽量不超过5次）。 表120 gM储存液的配置参考 使用前须知 为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。 实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。 细胞实验方法 为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议： a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔； b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度： siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时 间为24?72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。 2. 转染步骤： 以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染 请参考表2。 1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞 密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。 2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液： a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ; b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ; c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。 注意：稀释好的Iipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构， 甚至影响siRNA-lipo2000 混合物的形成。 3）将siRNA-Iipo2000混合液加入含有细胞的400 gl培养基（v2）的培养孔中，轻轻混匀； 4）（可选）培养4?6h后，将孔中含siRNA-Iipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基； 5）（可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）；

电转染操作流程

Neon TM 电转染一般流程 1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达 到70-90%。 2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500μl ，放于37℃培养箱预热。（注：使用 其他孔数培养板或者100μl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml 的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750μl 胰酶消化3min ，加入750μl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。 4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。 5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。 6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。轻轻 吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低） 7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA 和 接种体积见下表1）。 8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。 9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。 10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10μl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。 11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。 12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。 13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。 14．实验结束后，倒掉移液器中E 液，关闭电转仪。 注意：1．加R 液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（2.0×107）。 2．加入质粒体积=加入质粒的量/质粒浓度。 3．加入细胞悬液体积=需加细胞数量/细胞悬液浓度。 4．每个枪头最多只能用2次。 5．Neon TM 管装入的3ml 电解缓冲液E 可用10次电转化。 6．Neon TM 管中加入3ml 电解缓冲液，用10μl 枪头时加E 液,100μl 枪头时用E2液。 表1 NeonTM 枪头 平板培养基的体积 细胞数量（个） 规格 每孔表面积(cm2) DNA(μg) 10μl 100μl 96孔 0.3 0.2-0.3 √ 100μl 1-3×104 48孔 0.7 0.3-0.7 √ 250μl 5-7.5×104 24孔 2 0.5-1.5 √ 500μl 0.5-1.5×105 12孔 4 0.5-3.0 √ 1.0ml 1-3×105 6孔 10 2.0-4.0 √ √ 2.0ml 0.5-1×106 60mm 20 4.0-8.0 √ 5ml 2-4×106 10CM 60 8.0-16 √ 10ml 4-8×106

基因工程原理讲义：基因克隆的质粒载体

第六讲基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月

基因克隆的质粒载体 一、导言 1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2．质粒的类型多种多样 F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的 寄主受体细胞中去。 R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒 的适宜的受体细胞中去。 Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3．质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。

二、质粒的一般特性 1．质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖 于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状

锐博siRNA产品说明书

siRNA使用说明（2009-08） 名称： 常规化学合成siRNA。 产品简介： 常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。 产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。 保存和使用： 保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上； 冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。 例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。 注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。 使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存; 整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理； 特别提示：荧光标记siRNA要求避光。 使用方法： 1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。 （siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。 2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）： (1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样， 因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液（试剂的用量和体积，请参照“实验指导”）： a. 稀释转染试剂lipofectamine2000（以下称lipo2000）：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清 的优化培养基（Opti- MEMⅠ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min； b. 稀释siRNA：用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述（b）稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000 混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。 注意：稀释好的lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。 (3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和； (4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间（24～96h）。沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h。 可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过37℃培养4～6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。 注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h后必须换成完全培养基（含血清、含抗生素），以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测：siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。 一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。 4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体（针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体）或报告基因系统检 测，检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。一般说来，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般从48h开始检测，在36、48、72、96h，甚至更长时间之后多点采样。

细胞的脂质体转染法和电穿孔法

细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法 （一）脂质体转染 一、实验试剂及器材 Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM?减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。 二、实验步骤 1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染； 2. 使用Opti-MEM?减血清培养基稀释Lipofectamine? 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM?培养基为125 μL× 2，Lipofectamine? 3000为 3.75和7.5 μL）； 3. 在每管已稀释的Lipofectamine? 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）； 4. 室温孵育5分钟； 5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中； 6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。 三、注意事项 1. 在无血清培养基（如Opti-MEM?减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine? 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）； 2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；

3. Lipofectamine? 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine? 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染； 4. Lipofectamine? 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。 附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22

Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo ...

活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。 活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。 2、活体电穿孔的法的特点 活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面: 首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。 在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。 其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的Y AC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。 此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。 但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。 由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在 1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月。

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

jetPRIME转染试剂说明

Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.wendangku.net/doc/b616760810.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11)

siRNA转染常见问题解答

siRNA转染常见问题解答 SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。 针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。 一、哪种转染试剂效果好？ 在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。 二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？ 转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。 三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？ SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比 较节省各种试剂。可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM， 50nM，80nM，100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下 来的实验。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度 不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。这里需要说明的是，以

病毒转染原理及步骤

病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化 (作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ ) 作者：单铁英苏安英唐军民 【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因 (enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体 进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den dritic Cell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体 外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48

h后表达最强。结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC 可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。电转染提供了外 源基因转染imDC的可行技术。 【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞 Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfacted into immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti on s.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified in E.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survival rate were counted.Results:Electransfection efficiency was in creased to the highest value whe n imDCs with the