转基因材料的检测
转基因材料的检测
—转病毒复制酶基因“华农1号”番木瓜的PCR检测
摘要：本实验采用定性的一次PCR反应分析方法，根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出四对特异的PCR扩增引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R，两对非特异性的PCR扩增引物Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R，然后以华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品的DNA为模板，为模板进行PCR扩增，电泳结果显示野生型木瓜都没有扩增出条带，转基因木瓜都扩增出条带，待测样品除了NPT1-F与NPT1-R没有扩增出条带，其他都有，可以确定待测样品为转基因产品。关键词：转基因；PCR定性检测；转病毒复制酶基因；华农1号
转基因作物从1996年在全球开始进入商品化生产，经过12年的发展,其种植的面积从当年的170万hm2扩大到2007年的1.14亿hm2 [1]，为保护消费者的知情权和选择权，多个国家和地区强制要求对含有一定阈值以上转基因成分的产品进行标识，如欧盟规定转基因成分含量标识的阈值是0.9%[2]，韩国为3.0%[3], 日本是5%[4]等，而美国和加拿大则采用了推荐而非强制的标识制度。我国也从2002年3月开始,要求对大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5种作物的17种产品进行标识[5]，为了适应对转基因产品的标识要求，已经建立了一系列的检测方法，
以基于其中外源DNA检测的聚合酶链式反应PCR应用最广泛[6]。
转基因材料的检测主要是针对选择性标记和报告基因、转入基因、启动子和终止子等方面的检测，是当前转基因产品检测的重要手段。如椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因材料/食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。
早在20世纪初科学家就发现了病毒具有交互保护作用，近年来，科研工作者也利用这一原理开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的发展。抗病毒基因多数来自于病毒本身的基因，病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因等，并已经在番木瓜上获得成功转化[7]。
本实验根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出几个适用于检测转基因材料的引物对，然后以野生型番木瓜和转基因番木瓜“华农1号”以及待测样品DNA为模板进行PCR扩增，鉴别待测样品是否为转基因材料。
1 材料与方法
1.1 材料
华农1号
野生型木瓜
待检测样品
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
1.2.1.1 称取0.5 g的植物叶片，搁置于研钵中，加入液氮，捣碎叶片。
1.2.1.2 加入650 μl预热的DNA提取缓冲液，用力振荡1-2分钟，放入65℃水浴锅保温45分钟以上，其间，每隔15分钟用手轻微振荡3-4次。
1.2.1.3 从水浴锅中取出样品管，加入650 μl预冷的24:1的氯仿:异戊醇，盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5-10分钟。
1.2.1.4 10,000 rpm下离心10分钟。
1.2.1.5 用移液枪缓慢吸取上清液约500-700 μl至一个新的1.5 ml离心管中。
1.2.1.6 上清液中加入2/3体积的预冷异丙醇，约330-470 μl。轻轻上下摇动离心管，注意观察DNA将从溶液中析出。
1.2.1.7 在8000 rpm条件下离心5分钟。
1.2.1.8 倒掉上清液，保留DNA沉淀于管底。
1.2.1.9 加入70%乙醇600 μl洗涤沉淀，5000 rpm条件下离心去上清液。再重复洗涤沉淀一次。
1.2.1.10 室温下干燥DNA沉淀，在见到无色胶状物附在管壁时，加入80-100μl无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。
1.2.1.11 用分光光度计检测所提取DNA的质量和浓度。
1.2.2 PCR反应
1.2.2.1 按表1加入PCR各反应成分于0.2ml的PCR反应管中。
表1：PCR反应MASTER MIX成分
试剂 1 Mix 4 Mix
体积（μl）
体积（μl）
10×PCR buffer 1 4
25 mM MgCl2 _ _
5 mM dNTPs mixture 0.4 1.6
10 nmol Primer 1 1 4
10 nmol Primer 2 1 4
20-100 ng/ul Template DNA 2 _
Taq DNA polymerase 0.1 0.4
ddH2O 4.5 18
Total 10 32
1.2.2.2 混匀表1的反应液后，然后分装到3个标记转基因、非转基因、待测的PCR管，每管10 μl，分别再加入对应的DNA 2 μl，然后稍作离心，进行PCR。
1.2.2.3 将反应管置于PCR仪中，按表2的反应程序进行PCR扩增
表2 PCR反应的变温程序
阶段循环次数温度持续时间
1194℃5min
23594℃45s 54℃45s 72℃1min
3172℃7min
44℃保温
1.2.2.4 制备1.5%的琼脂糖凝胶
1.2.2.5 反应结束后，在反应产物加入2ul 6×Loading Buffer，用微量移液枪小心加入样品槽中，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
1.2.2.6 加完样后，合上电泳槽盖立即接通电源，进行电泳，100 V，20 min。电泳结束后，紫外观察并拍照。
1.3 PCR定性分析的引物
表3 PCR定性分析的引物
（本实验使用的是1,3,4,6,7,8号引物进行PCR扩增[8-9]）
基因名称编号引物名称引物序列5’-3’产物大小
CaMV35s启动子1
35S-F GCTCCTACAAATGCCATCA
195 bp，邵碧英等,2002;阮小蕾等,2010 35S-R GATAGTGGGATTGTGCGTCA
Nos启动子/终止子2
Nos1-F ATCGTTCAAACATTTGGCA
165 bp Nos1-R ATTGCGGGACTCTAATCATA
3
Nos2-F GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
阮小蕾等,2010 Nos2-R TTATCCTAGTTTGCGCGCTA
NPT II基因4
NPT1-F AGGCTATTCGGCTATGACTGG
600 bp，邵碧英等,2002 NPT1-R GCGGTCCGCCACACCCAGCCG
5
NPT2-F ATGATTGAACAAGATGGATTG
—
NPT2-R TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
RP基因6
HN1F GCTGAGTGGCTCCTTCAACGT
753 bp
HN1R CGACAAGTTGAGTTCGTGGGA
7
HN2F TGACTCCCTTAATTCTCCGCT
298 bp，姜大刚等,2009 HN2R TGACGAGTACAAGGAGACGCC
8
HN3F GTGGTTCATGTCACATCGAG
150 bp,阮小蕾等,2010 HN3R AATACACCAGTAGCTCAGGC
9
HN4F ATTGACGAGTACAAGGAGACGC
285 bp
HN4R CTCCGCTCATGATCAGATTGT
2 结果与分析
2.1结果
由图1可看出，使用引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R、Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R（即引物对1,4,6,7,3,8）这六对引物组合进行华农1号转基因木瓜、野生型木瓜及待测样品DNA的PCR扩增，作为阳性对照的转基因木瓜都扩增出条带，作为阴性对照的野生型木瓜都没有扩增出条带，而待测样品在只有4号引物没有扩增出条带。而我小组华农1号转基因木瓜与待测样品DNA都扩增出条带，野生型木瓜没有扩增出条带，且华农1号转基因木瓜扩增的条带较待测样品亮，而不同的引物之间扩增的片段碱基对数有所不同。
图1 PCR扩增电泳图
（从右往左，每对引物对应的三个DNA样分别是华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品）
2.2分析
实验结果显示，作为阴性对照的野生型木瓜都没扩增出条带，作为阳性对照的华农1号转基因木瓜都扩增出条带，这与理论相符，野生型木瓜不含这些CaMV35s启动子，Nos启动子/终止子等基因片段故不能扩增出相应的任何片段，而转基因木瓜含这些基因。且待测样品扩增出的条带与华农1号转基因木瓜相对应的条带片段大小基本一致，说明本实验的待测样品为转基因产品。就待测样品而言，4号引物能特异性扩增待测样片段，而实验结果显示没有条带，可能实验操作的失误。我小组的实验结果表示实验成功，而华农1号转基因木瓜扩增的条带较待测样品亮，说明8引物扩增出的华农1号转基因木瓜的量比较多。而不同的引物之间扩增的片段碱基对数有所不同，这是特异性引物之间的片段长短不同，故扩增的片段大小不一。
3.讨论
本实验对转基因产品的检测是采用的通用元件筛选PCR检测，而通用元件筛选PCR检测主要以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩增片段，例如CaMV35S 启动子、 FMV35S 启动子、 NOS 终止子、 7S 3’终止子等通用元件以及 NptII 、 Hpt 、 Pat 、 GUS 、 aad 等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因产品的研究与生产中，从而大大降低了筛选PCR 检测的特异性，只能用于转基因产品检测的初步筛选。因此可以通过基因特异性PCR(Gene-specific PCR) 检测、构建特异性 PCR(Construct-specific PCR)检
测、品系特异性 PCR(Event-specific PCR)检测等方式来提高筛选PCR检测的特异性。另外，也可以通过基于蛋白质的转基因产品来对转基因产品进行检测，例如酶联免疫吸附法、侧向流动免疫测定法等。
通过本实验，我学会了比较简单的转基因产品的检测，同时也对转基因产品进行深入了解。而且通过近三周的分子实验掌握了比较基本的分子实验。尽管实验有失败（逆转录PCR四只管只有一只扩增出条带),但是我认识到对待科学实验要持严谨的态度，不能草率了事。最后，感谢老师在实验过程给予我的指导及同学的帮助。
参考文献
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性检测[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）, 2010, 36 (6) ：626—629
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收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定 宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定 检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因 报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交 证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #
《转基因食品安全性分析》阅读附答案
《转基因食品安全性分析》阅读附答案 阅读下面的文字，完成9—11题。（9分） 转基因食品就是指应用现代份子生物技术，把动植物的基因加以扭转，再制造出具有新特点的食品种类。其优点显著，但转基因食品存在良多不容忽视的存在的或潜伏的危害性。 新基因的转入，打破了原来生物基因的“管理体制”，使一些发生毒素的默然基因开启，发生有毒物资。有资料证实，转基因食品可能致使生物体系统失调、引发癌症并传递给下一代，此进程可能需要30年或更长的时间。人为转入外源基因极有可能使原有的基因发生缺失和错码等突变。美国出产的一种耐除草剂转基因大豆的抗癌成份异黄酮就比一般大豆低12％～14％。 全球约有2％的人群对某些食品发生过敏性反映。1996年美国先锋种子公司将巴西坚果某基因转入大豆中，结果对巴西坚果过敏的人群也对该大豆过敏，该大豆种子终究没有被批准商业化出产。人们在食用了这类改进食品后，食品会在人体内将抗药性基因传给致病细菌，使人体发生抗药性。在英国，做过切除大肠组织手术的志愿者，食用过用转基因大豆做成的汉堡包以后，在其小肠肠道的细菌中检测到了转基因DNA的残留物。而转基因食品对人体健康的严重影响，可能需要经由较长期才能逐步表现和检测出来。 良多转基因生物拥有较强的生存能力或抗逆性，这样的生物一旦进入环境中，将会取代原来的作物，造成物种灭绝，但这类问题可能要经由许多年后才能浮现出来。如一些盐碱、池沼、雨林及有寄生虫的地区，之前本来不适合农业种植，这些地区都被用来种植农作物，
从而使本来糊口在这里的生物的栖息地受到损坏，造成生态系统失衡，终究致使物种退化、减少乃至灭绝。 转基因生物将增强目标害虫的抗性。专家正告，如果这类拥有转基因抗性的害虫变成拥有抵抗性的超级害虫，就需要喷洒更多的农药，而这将会对农田和自然生态环境造成更大的危害。因为转基因作物特性良好，良多人选择种植转基因作物，使某些作物的多样性大大下降。维持生物多样性是减少生物遭遇疫病侵袭的首要方式。1864年的爱尔兰土豆枯死病，造成100多万人死亡，数百人流离失所，缘由就是当地人只种植两个土豆品种。 转基因作物可能将其抗性基因杂交传递给其野生亲缘种，从而使本是杂草的野生亲缘种变成无敌杂草。基因漂移的进程很难人为节制，其后果也难以预测。在加拿大，被用于实验的油菜，只拥有抗草甘膦、抗草胺膦和抗咪唑啉酮功能中的一种功能，后来发现了同时具有这三种功能的油菜，说明这三种油菜之间发生了杂交，这类油菜对周围植物造成了很大影响。 （选自朱世明《转基因食品安全性分析》，有改动） 9. 以下不能说明“转基因食品对人体的危害”这一观点的一项是（） A.转基因食品可能在30年或更长的时间，引发癌症并传递给下一代。 B.美国出产的一种耐除草剂转基因大豆的抗癌成份异黄酮比一般大豆低12%～14%。 C.拥有较强的生存能力或抗逆性的转基因生物，将致使物种退化，减少乃至灭绝。 D.转基因食品会发生过敏原，而全球约有2%的人群对某些食品发生过敏反映。 10.以下说法相符原文意思的一项是（）
转基因产品检测技术和标准物质研制
转基因生物新品种培育重大专项 转基因产品检测标准物质研制（2008ZX08012－003） 赴日本交流转基因产品检测标准物质 研制技术考察报告 沈平厉建萌 二〇一〇年十二月
赴日本交流转基因产品检测标准物质研制技术 考察报告 2010年11月15日至11月20日，根据转基因产品检测标准物质研制课题预算书的安排，我们赴日本就转基因产品检测标准物质研制、产品成分检测技术、转基因生物安全管理以及转基因水稻研发等内容进行了考察。通过听取日方专家报告、面对面交流、实地考察实验室和基地等方式，我们对日本转基因产品检测标准物质研制、转基因生物安全管理等方面有了深刻的认识，我们发现日本转基因生物标准物质研制定位明确，要求异常严格，设施配套齐全；着力加强非法释放转基因产品的转基因检测技术方法研制；在转基因生物安全管理上采取关口前移，严进宽出的做法，有许多成功的经验和做法供我们借鉴。现将有关情况报告如下： 一、考察目的 为推进转基因生物新品种培育重大专项《转基因产品检测标准物质研制》课题的研究进程，解决课题研究过程中遇到的难题，根据课题预算书的要求，特组织课题核心技术研究人员赴日进行转基因标准物质研制交流，旨在了解日本转基因产品检测标准物质的研究进展、设备条件和质量控制体系，以及转基因水稻实验室监管体系，探讨转基因生物标准物质研制和应用中的关键技术难点，如标准物质的量值确定、可替代性验证、不确定度分析、配套标准物质应用的转基因产品检测新技术方法等。
二、考察内容 （一）转基因产品检测标准物质研制 11月19日下午，听取了日本农林水产省食品综合研究所Kazumi kitta博士关于标准物质研制、检测方法研制和评价的专题报告，就拷贝数与重量比的换算、原材料的提供等内容进行了交流，实地考察了转基因检测标准物质研制实验室的结构布局。 日本农林水产省下属的食品综合研究所是日本唯一开展转基因植物标准内物质研制的单位。该所配备了一流的专业设备和标准物质研制实施环境，建有专业的转基因标准物质制备实验室。仅仅标准物质的制备实验室就分为五个部分，分别是阴性样品粉碎室、阳性样品粉碎室、标准物质混合式、储存室、称量分装室。每个功能实验室都有严格的环境质量控制措施，例如仪器专用、实验试剂专用、实验服专用、实验人员权限设置等，从而确保标准物质的制备质量。在原材料方面，该所研制标准物质的所需的转基因原材料，均由研发者提供给日本政府，再转给检测机构。 食品综合研究所主要开展基体和质粒标准物质研制工作，基体标准物质一共3种，分别是转基因大豆GTS40-3-2，转基因玉米MON810和GA21；质粒标准物质主要分为2类，分别是转基因大豆和转基因玉米质粒标准物质。在日本，转基因生物标准物质的管理评价体系和我国完全不一样，其研制的标准物质不需要通过专门的管理机构进行评定和审批，但是研制标准物质机构必须具备标准物质制
综述：转基因生物和食品存在的安全性问题、检测和评价研究_百度
80年代初,美国最早对转基因生物进行研究。首例转基因生物 (Genetically Modified Organism, GMO 于 1983年问世, 转基因作物 (1986批准进行田间试验,延熟保鲜番茄(1993(Calgene 公司生产在美国批准上市,开创了转基因植物商业应用的先例。 6年来,其发展更为迅速, 超出人们预料。 1998年全球转基因作物和种植面积达 2780万公顷, 1999年增至 3990万公顷,增长 44%。 1995-1998年全球转基因作物的销售额由 0.75亿美元猛增至 12-15亿美元。 4年间增加了 20倍。迄今,美国已批准 50种转基因植物产品商业化, 1/4的耕地种植的是转基因作物,其中转基因抗除草剂大豆占美国大豆总面积的 55%, 转基因玉米占总面积的 30%。美国市场上已有近 4000种食品来自转基因化生物。据国际有关方面的预测, 到2010年, 全世界的转基因食物的种植面积将增至 6000万公顷,市场总收入将达到 3万亿美元,其种子收入将达到 1200亿美元。因而可以毫不夸张地说, 转基因食品的新时代已经到来。随着 GMO 的发展, 近来在全球范围内引起一场转基因生物、食品安全性的争论。支持和反对两派争锋相对,势不两立。为此,有关转基因生物安全成为历次缔约国大会、国际和区域性组织、民间团体等讨论的重要议题之一。本文就有关转基因生物和食品存在的安全性问题、检测和评价研究综述如下。 一、转基因食品的安全性 GMO系一种或几种植物或动物乃至人类的基因植入某一种生物, 从而表现出本身自然不能拥有的由转入基因带来的新特性,达到改善其产品的品质、提高营养成份、增加其抗病、虫、害、增加产量、抗逆转、延长货架期等。转基因食品(Gene Food系以转基因生物为原料,加工为人类所食用的产品。转基因食品是一项新技术。 1,转基因技术本身的主要不足 (1,不精确的技术:基因技术将一异源基因从一生物转入另一生物,虽然其 DNA 可以精确地切割, 但不能将新基因准确地植入另一生物中, 从而影响这一生物其它基因的基本功能。科学家无法预见植物基因化后产生新的, 未知的蛋白质, 也不能完全准确的预见对受体影响的结果表现为不成熟性。
转基因食品快速检测试纸的检测原理
转基因食品快速检测试纸的检测原理 一、转基因食品快速检测试纸简介概述： 托普云农转基因食品快速检测试纸用于快速检测种子或植物叶片等样品中的转基BtCry1Ab/1Ac，灵敏度为1%，整个检测过程只需要10-15分钟，适用于各类企业及检测机构。 大多数转基因植物有可能在耕种、收割、运输、储存与加工过程同时混入食品，不管是要对转基因食品贴示标签，亦或是对转基因与非转基因原料分别进行输送，转基因食品的原料和食品检测都是必不可少的；还有，要区别开来转基因和非转基因食品，对转基因食品进行进行标识，而食品中转基因含量的多少加以限制，更加需要有效准确的基因检测设备与良好的检测技术。 跟随着每个国家转基因标识制度纷纷相继建立和老百姓对转基因产品高度关注度的提高，老百姓对转基因技术的认知度与准确性相继提出了更加严格性的要求，而因此各个转基因检测技术与转基因检测设备更成为了大家研究的热点和探讨的话题，最近十几年来国外的科学研究一直处于前沿，为了促进我国转基因作物相关科技技术研发、推广发展，托普云农也致力于让老百姓对转基因检测技术的现状以及未来发展趋势有较为清晰和全面的认知了解！ 托普云农专业检测团队采用PCR技术，从分子水平检测农产品、加工原料、成品中的转基因成分，为食品生产加工和流通企业、检测机构、研究院所提供全面快速、简便经济的专业基因检测服务。为您食品的安全保驾护航！ 二、转基因食品快速检测试纸仅需30秒转基因现真身 在实验室里，托普云农工作人员演示转基因快速检测的过程。桌上的两个纸袋中，分别装有转基因和非转基因稻谷。工作人员各取数粒研磨成粉，分别装入两只试管，滴入缓冲液静置，待固体物质沉底后，取出2张转基因检测试纸分别蘸取上面的清液。30秒后，试纸呈现出不同的标记。 其中1张上、下两条检测线均呈现紫红色，为转基因样本，另外一张仅下检测线呈现紫红色，为非转基因。“试纸样式、检测原理、使用方法与早孕试纸类似。”试纸应用双抗体夹心免疫层析原理，如果样本中存在转基因抗原，与试纸上的转基因抗体结合就会使上、下检测线同时显色。 三、转基因食品快速检测试纸快速检测意义不凡 农业部印发《2015年农业转基因生物安全监管工作方案》，其中提到对水稻、玉米等进行重点监管，建议利用试纸条等快速检测方法，降低成本，扩大监测范
转基因食品的检测方法材料
生命科学前沿讲座论文 转基因食品的检测方法 姓名：陈继款 系别：生命科学学院 专业：生物信息学 年级：2008级 学号：080567011 指导老师：薛李春 总成绩： 2010年07月02日
转基因食品的检测方法 自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。因此转基因产品的检测就显得尤为重要。转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。 1核酸水平 主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 1．1定性检测 1．1．1聚合酶链式反应(PCR) 1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。 1．1．2多重PCR 多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。多重PCR可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。V．T．Forte等利用其设计的多重PCR方法对转基因大豆和Bt玉米样品进行实际检测，结果表明该方法能够准确的检测食品中是否含有转基因成分，其检测结果可以精确到2％～0．1％的范围。Permingeat等仅用两
食品中转基因成分检测
食品中转基因成分检测 第4章 DNA提取和纯化 M.Somma
目录 第４章 DNA提取和纯化 引言 3 提取方法 4 纯化方法 4 CTAB提取和纯化方法 6 分光光度计测定DNA含量9 分光光度计测定DNA的原理9 核酸浓度测定10 实验12 参考文献16
引言 在所有重组DNA技术和大多数分子生物学研究中，核酸的提取和纯化是实验的第一步。核酸提取方法研究的目的，是为了从不同来源的材料中获得高纯度的核酸，以便于利用聚合酶链式反应 (Polymerase Chian Reaction, PCR) 进行转基因品系的特异性分析。核酸的质量和纯度是PCR分析的关键因素之一。获取高纯度的核酸，避免抑制污染物，需要选择合适的DNA提取方法。表1列出了在PCR检测中可能抑制反应效率的污染物。为了防止由于样品中PCR抑制物的存在导致出现假阴性结果，强烈推荐设置一个对照实验以测试PCR抑制作用。基于此目的，一般采用植物特异性(真核或叶绿体) 或种属特异性的PCR检测。 表1. PCR反应过程中的一些抑制物 抑制物抑制浓度 SDS > 0.005% 苯酚> 0.2% 乙醇> 1% 异丙醇> 1% 乙酸钠> 5 mM 氯化钠> 25 mM EDTA > 0.5 mM 血色素> 1 mg/ml 肝磷脂> 0.15 i.m/ml 尿素> 20 mM 反应混合物> 15% 目前有许多种核酸提取和纯化技术，一般基于以下准则来选择最适宜的提取纯化技术：z目标核酸 z来源生物 z起始材料(组织、叶片、种子、加工过的材料等) z对结果的要求(产量、纯度、纯化所需时间等等) z下游应用 (PCR、克隆、标记、印迹、RT-PCR、cDNA合成等等)
转基因食品法律法规教学文案
转基因食品法律法规
国务院颁布的《农业转基因生物安全管理条例》及其三个配套的管理办法，即《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》。这些法规已明确规定，发放安全证书需要进行环境安全与食用安全检测，并对含有转基因成分的产品进行强制性标识。《农业转基因生物标识管理办法》规定:列入农业转基因生物标识目录的农业转基因生物，必须进行标识。该办法第六条规定了标识的标注方法：转基因动植物（含种子、种畜禽、水产苗种）和微生物，转基因动植物、微生物产品，含有转基因动植物、微生物或者其产品成份的种子、种畜禽、水产苗种、农药、兽药、肥料和添加剂等产品，直接标注转基因某某0；转基因农产品的直接加工品，标注为转基因某某，加工品（制成品）或者加工原料为转基因某某0；用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成份的产品加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测不出转基因成份的产品，标注为本产品为转基因某某加工制成，但本产品中已不再含有转基因成份或者标注本产品加工原料中有转基因某某，但本产品中已不再含有转基因成份。 （二）我国转基因食品安全法律规制的缺陷
纵观我国食品安全的现状，从2008年的“毒奶粉”事件，到今年的“地沟油”事件和“龙虾门”事件，食品安全问题始终十分突出。下面对我国食品安全法律规制的缺陷进行分析： 1、现有立法层次不高。国际上以美国、日本等为代表的很多国家都是针对转基因食品安全进行专门立法，而我国对于转基因生物技术颁布的多是行政法规和部门规章。这些法规大多从本部门的职责角度出发，对转基因技术及其产品进行管理，具有临时性和应急性，难以从整个生物安全角度出发，对转基因生物技术及其产品安全的监督管理作出全面系统规定。 制定专门的转基因食品安全法 我国的转基因食品安全立法与国外（如美国、欧盟、日本）的差距主要表现在我国缺乏转基因食品安全的专门立法。虽然有关转基因食品安全的有关规定可散见于《农业转基因生物安全管理条例》等，但适用于转基因食品安全的一些特殊规定，如转基因食品的检测标准，就与转基因生物安全有所不同。而且这种分散的部门法规在执行中也存在很大的阻力。笔者建议由我国立法机关制定专门的转基因食品安全法，将现行的《转基因食品卫生管理办法》从转基因食品安全角度进行修改和完善，成为对转基因食品安全的有关问题，作出专门规定的转基因食品安全法。在制定专门的转基因食品安全法时要注意借鉴国外的立法模式，建立完善的转基因食品安全评价、监控及标识制度，以有效保证转基因食品的安全。
转基因材料的检测
转基因材料的检测 —转病毒复制酶基因“华农1号”番木瓜的PCR检测 摘要：本实验采用定性的一次PCR反应分析方法，根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出四对特异的PCR扩增引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R，两对非特异性的PCR扩增引物Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R，然后以华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品的DNA为模板，为模板进行PCR扩增，电泳结果显示野生型木瓜都没有扩增出条带，转基因木瓜都扩增出条带，待测样品除了NPT1-F与NPT1-R没有扩增出条带，其他都有，可以确定待测样品为转基因产品。关键词：转基因；PCR定性检测；转病毒复制酶基因；华农1号 转基因作物从1996年在全球开始进入商品化生产，经过12年的发展,其种植的面积从当年的170万hm2扩大到2007年的1.14亿hm2 [1]，为保护消费者的知情权和选择权，多个国家和地区强制要求对含有一定阈值以上转基因成分的产品进行标识，如欧盟规定转基因成分含量标识的阈值是0.9%[2]，韩国为3.0%[3], 日本是5%[4]等，而美国和加拿大则采用了推荐而非强制的标识制度。我国也从2002年3月开始,要求对大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5种作物的17种产品进行标识[5]，为了适应对转基因产品的标识要求，已经建立了一系列的检测方法，
以基于其中外源DNA检测的聚合酶链式反应PCR应用最广泛[6]。 转基因材料的检测主要是针对选择性标记和报告基因、转入基因、启动子和终止子等方面的检测，是当前转基因产品检测的重要手段。如椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因材料/食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 早在20世纪初科学家就发现了病毒具有交互保护作用，近年来，科研工作者也利用这一原理开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的发展。抗病毒基因多数来自于病毒本身的基因，病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因等，并已经在番木瓜上获得成功转化[7]。 本实验根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出几个适用于检测转基因材料的引物对，然后以野生型番木瓜和转基因番木瓜“华农1号”以及待测样品DNA为模板进行PCR扩增，鉴别待测样品是否为转基因材料。 1 材料与方法 1.1 材料 华农1号 野生型木瓜 待检测样品 1.2 方法 1.2.1 DNA提取 1.2.1.1 称取0.5 g的植物叶片，搁置于研钵中，加入液氮，捣碎叶片。
转基因食品安全问题
“没有可靠证据表明转基因作物与环境问题之间存在因果关系。”报告称，“使用抗虫或抗除草剂的作物并没有减少农场中植物和昆虫整体多样性，抗虫作物的大田甚至还会有更多的昆虫多样性。” 没有证据表明大斑蝶种群数量的减少与转基因作物的种植相关。 尽管基因漂移（基因从转基因作物到野生近缘物种）已经产生，但没有实例证实这种转移对环境产生了不利影响。 转基因作物的增产潜力对发展中国家来说影响更大。一些新的作物改良技术可能会增加产量的增长率 美国国家科学院、国家工程院和国家医学院（the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine）是一家美国科学家组成的荣誉性自治、非营利组织，由美国国家科学院（National Academy of Sciences）、美国国家工程院（National Academy of Engineering）和美国国家医学院（national academy of medicine）组成。它们分别于1863年、1964年以及1970年成立。该组织在科学、技术与医学领域为美国政府提供政策建议。这份报告受美国农业部等机构的基金支持。资助者不包括从事转基因育种的孟山都、杜邦等农业生物技术公司。 朱作言是国家农业转基因生物安全委员会第一届委员会成员，也是2016年最新一届委员会的成员。中国科学院院士朱作言就转基因问题，接受专访时表示，准确地说，人们常说的转基因，是一种分子杂交，或分子杂交育种。 他进一步解释说，传统的杂交育种是两个物种、品种进行杂交，引入成千上万个基因。而转基因，或叫分子杂交育种技术，唯一的不同是用一个基因去和另一物种或品种杂交，引入的是唯一一条基因，更精准高效。 2016年7月初，全球100多位诺贝奖获得者联合发表公开信，支持转基因技术和转基因农作物，重申其安全可靠。中国科学院发布过关于支持转基因的声明，专门发布过，院士们发表的 我们在媒体上也能看到一些专家学者说转基因是安全的，但是老百姓好像不买账。 朱作言：专家越说，他越不买账。我看过相关的研究文章，一种社会人的心理，对主流的声音听不进去，越是非主流的声音，越是听得进去。 朱作言：我个人的观点是，不管政府态度怎么样，反转的态度怎么样，我们不看现在，过20年后，回过头来看，这是一场笑话。
两种常见的转基因食品检测技术
两种常见的转基因食品检测技术 由于转基因物质有可能在耕种、收割、运输、储存和加工过程中混入食品，对食品造成偶然污染。因此，不论是对转基因食品贴示标签，或是对转基因与非转基因原料进行分别输送，转基因原料和食品的检测都是必不可少的；另外，要区分转基因与非转基因食品，对转基因食品进行选择性标记，对食品中的转基因含量的多少加以限制，也需要准确有效的基因检测技术。从发展来看转基因食品的检测技术根据检测的直接对象可分为三类：(1)利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定；(2)针对导入外源基因表达的蛋白质的鉴定方法；(3)以导入外源基因的特定DNA序列为检测对象的检测技术。其中目前用的比较多的是PCR技术、ELISA技术（酶联免疫法）和生物芯片技术三种。 3.1免疫学检测法 是从蛋白质水平对转基因食品进行检测(即对外源蛋白质的测定可将其分为Western杂交、酶联免疫法(ELISA)、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原(antigen)抗体之间的特异反应来实现的。抗原抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应，即通常情况下，抗原只和它自己（或者具有相同抗原决定族的抗原）诱导产生的抗体发生反应。 3.1.1杂交 Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白检测方泫，它具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白。Western杂交检测的关键是抗体的制备。 3.1.2酶联免疫吸附法 ELISA(EnzymeLinkedImmuneabsorbentAssay)，此法则通过酶反应将抗原抗体反应信号放大，从而提高了检测灵敏度，而且还能产生有颜色的底物，通过仪器或肉眼识别，此法一般在酶联板上或膜上进行，检测一次需要4小时左右。 3.1.3试纸条法试纸条法(LateralFlowStrip)，此法主要将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再和带有颜色的特异抗体进行反应，就形成了带有颜色的三明治机构，并且固定在试纸条上，如果没有抗原，则没有颜色。 3.1.4快速检测试剂盒法 此法具有操作简易%使用方便的特点，但是试剂盒本身价格较昂贵，在称取样量上用量较少，代表性不能保证，这将影响到检测结果的正确性。目前见得多的产品主要是国外的，如DneasyPlantMiniKit(QIAGEN)等试剂盒）． 3.2PCR检测法 PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，它具有灵敏度较高／特异性强厂可准确定量等优点，PCR技术即“．聚合酶链反应技术”，是指模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术，它能在短时间内准确地将目的顺序大量复制，PCR的基本要素包括模板、引物、合成DNA 的原料即DNTP和DNA聚合酶．PCR即可做定性又可做定量分析。目前大多以定性检测为主，定性检测的检出范围为0.1%，但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果（即检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成分）。 3.2.1定性PCR技术 转基因食品重组DNA的基本结构包括启动动子、目的基因、终止子和标记基因，到目前为止，全世界已有30多种源基因食品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化源基因食品中绝大多数含转录启动子CaMV35、转录终止子NOS及抗生素抗性基因NPTII。这就为人们建立相应的PCR筛选检测方法提供了便利[22]迄今为止，利用定性PCR检测技术可检测如大豆、玉米、番茄、油菜等多种转基因作物. 3.2.2定量PCR技术