TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１

）＊通讯作者文章编号：１

００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６Ｔ

ＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

王　红１，

２，３，蒋　莉４，王　岩５，许振凯６，王威平６，方　航１，２，３，孙　鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１．

南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１；

５．

吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０；

９．

肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的　为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠，

提供稳定的动物模型。方法　取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃ

ｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃ

ｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果　杂交后分别获得肢芽

干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组

比较，上述３种转基因小鼠ｐ－

Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论　本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高，

有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。

关键词：基因敲除小鼠；骨发育；Ｔ

ＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇ

ｅｎｉｃ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ　Ｌｉ４，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ５，ｅｔ　ａｌ．（１．Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆ

ｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ　

ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇ　ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　

Ｊｉ　Ｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　

Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ

ｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ａｂｏｕｔ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏ－ｖｉｄｅ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　

ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ　ｈｅａｌｔｈｙ　

ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙ

ｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　

ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　

ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ　ｏｂｔａｉｎ　８ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ．Ａｎｄ　ｐ

－Ｓ６ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐ

ｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｂｙ　

Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ　ｓｈｏｗ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｈａｖｅ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　

ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　

ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ　

ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇ

ｎ，２０１９，２３：１２３９） 结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　

ｃｏｍ－ｐ

ｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐ

ａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼—

９３２１—中国实验诊断学　２０１９年７月　第２３卷　第７期

Dicer1转基因小鼠模型的建立

2008年8月 第16卷　第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16　N o.4 研究报告 Dicer 1转基因小鼠模型的建立 郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1 , 吕相川1,张梅英1,王禄增 1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳　110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳　110001) 【摘要】　目的　建立Dicer 1转基因小鼠模型。方法　构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。结果　显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论　成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。 【关键词】　Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠 【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203 Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse Model ZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1 , LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(https://www.wendangku.net/doc/9011370394.html,boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ; 21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China ) 【Abstract 】　Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA. 【K ey w ords 】　Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice [基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。 [作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与 基因敲除。E -mail :zhihongzheng @1631com [通讯作者]王禄增。E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是 2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码 蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表 达。其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA 剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。 DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶, DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。1　材料方法 111　Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以

转基因小鼠的制备

转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与

基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16

基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

基因敲除大鼠模型成功建立

2010-8-24 9:53:35 Nature：基因敲除大鼠模型成功建立 8月11日，Nature在线发表了华裔科学家应其龙研究组的 最新研究成果。他们首次成功的获得了基因敲除大鼠，这是世界上第二种完成基因敲除的动物模型，该研究为进一步分析人类疾病提供了一种新的平台。 小鼠基因敲除技术是研究许多新基因的重要工具，因此这项研究成果也获得了诺贝尔奖，但是这一技术至今还未在第二种动物中实现过，而作为与小鼠同样应用广泛的模式动物：大鼠，迄今为止，科学家们还不能从遗传操作的角度在这种动物中敲除，或者添加某种基因。但是由于大鼠在很多方面更接近于人类，因此如果能实现这种模式动物的基因敲除，将有利于未来创建更有效的动物模型，用于人类疾病的研究。正如钱其军教授说的那样，“由于大鼠在很多方面更接近于人类, 因此大鼠的基因敲除模型将会广泛应用于各种研究。” 要想获得大鼠基因敲除模型，势必会遇到许多技术难题，其中的关键就在于建立能生殖传代的大鼠的胚胎干细胞株，同时也需寻找最佳受体的囊胚。研究人员首先需要对动物进行遗传工程操作，这要求科学家能将干细胞（比如生殖细胞）培养成完整的动物个体，而该研究组在之前的研究中就积累

了这方面的许多经验，其研究组一直以来都从事胚胎干细胞研究，曾发表多篇Nature，Cell文章，比如曾在Nature文章中证实干细胞移植主要原因可能是细胞融合而不是分化，这是干细胞开创性进展之一。 在最新的这项研究中，研究人员在大鼠中成功的敲除了一种p53抑癌基因，这个基因可以说是癌症研究中的明星基因，对它的研究已经从一种抑癌基因，发展到几十种抑癌基因群体，从一条单一细胞通路，发展成多种细胞信号网络。因此p53敲除大鼠模型的建立对于未来分析癌症机理，信号网络具有重要的意义。 那么为什么研究人员会选择了p53作为敲除基因？钱教授在回答这一问题的时候说，“P53基因是目前研究最多的基因之一，如P53基因突变与肿瘤发生有关，小鼠的P53基因敲除可发生肉瘤，而并非发生类似于人类癌症，而且P53基因小鼠肉瘤的发生率也较低。在大鼠中进行P53基因敲除是否会发生类似于人类癌症组织值得关注。” 在敲除基因操作方面，小鼠和大鼠有何区别？钱教授表示这两者并无明显的区别，那么也就是说在未来的应用方面，大鼠基因敲除技术很可能会像小鼠基因敲除技术一样，成为一种新型分子生物学技术，被广泛应用到生物学领域中的各个方面！（生物谷https://www.wendangku.net/doc/9011370394.html,）

转基因小鼠的方法概述

转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日

老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法

（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.

基因敲除技术的原理、方法和应用

基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

如何进行小鼠肿瘤模型的建立及鉴定教程文件

如何进行小鼠肿瘤模型的建立及鉴定 实验肿瘤学的需要导致肿瘤动物模型的产生,借以研究人类肿瘤的病因、发生、发展以及治疗和预防。肿瘤动物模型可来自于动物的自发肿瘤、诱发肿瘤和移植性肿瘤。 一前两者由于对动物品系要求严格、实验周期较长或缺少实验一致性而较少使用。移植性肿瘤动物模型具有特性明确、生长一致性好、实验周期短、瘤株分布广泛、可反复复制等优点,在肿瘤研究中占有重要地位。可移植性肿瘤,是把动物或人的肿瘤移植到同系、同种或异种动物,经传代后,组织类型和生长特性已趋稳定,并能在受体动物中继续传代,又称为可移植性肿瘤细胞。二可移植性肿瘤移植于同系或同种动物,称为同种移植,是国内外最常用的肿瘤动物模型复制方法之一。同种移植的优点是,可供选择使用的细胞系或细胞株多,许多细胞系在世界范围分布广泛,并且这些细胞的生物学特性已经比较明确,一般都有明确的背景资料,使一群动物同时接种同样量的瘤细胞,生长速度一致、个体差异较小,成活率高,易于对照观察,这些都是便于科研成果相互比较和交流的有利因素 三在接种过程中，应把握注射深度，否则易造成内脏损伤。接种后三天即开始观察有无肿瘤形成。本实验具有周期短、制作方便、成功率比较高、较好重复性和稳定性的明显优势，是一种较为理想的肿瘤实验动物模型，值得推广。 肝癌肿瘤模型建立： 抗肿瘤药物及制剂的药效学评价，可通过建立小鼠荷瘤数据模型，探索肿瘤生长的本质及其发生发展的规律，探究其抗肿瘤效果。 方法：小鼠右腋下注射H22肿瘤细胞，注射部位发生癌变，小鼠肿瘤生长明显，切片结果证明实验成功，模型构建完成，使小鼠荷瘤，观察肿瘤生长，记录体重数据并建立动物模型。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1动物及分组：取20只昆明鼠随机分成A组（10只），B组（5只），C组对照组（5只），编号饲养。 1.1.2试剂：无菌水，生理盐水，台酚蓝，2%冰醋酸，甲醛，乙醇，二甲苯，石蜡等。 1.1.3仪器：离心机，显微镜，计数板，电子称，超净工作台，温箱，切片机等。 1.2实验方法 1.2.1模型建立：取H22肿瘤细胞，3000转离心分钟，再用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，取40微升细胞悬液加入10微升0.4%台酚蓝染色并镜检计数，制成浓 度为3*106个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2毫升。 1.2.2：细胞计数：细胞计数液2%冰醋酸溶液。 取50微升细胞悬液加入450微升的细胞计数液中计数。 1.3记录： 接种完成后,逐日观察接种部位有无感染,肿瘤生长后有无自然消退,用游标卡尺，每周测量肿瘤长径a和短径b ,并计算平均直径,即r = (a + b) /2，每天称量小鼠体重和肿瘤并记录，绘制曲线。 1.4制备组织切片： a处死小鼠，将肿瘤组织切成1*1*0.4cm的小块。 b将切块的组织置于螺口瓶中，加入40%甲醛固定，过夜。

转基因小鼠的方法概述

转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日

老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。

转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.wendangku.net/doc/9011370394.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医

【CN109929876A】Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910196543.8 (22)申请日 2019.03.15 (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 (72)发明人 姜力　丁亚群　东琬婷　张勤　 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 魏少伟 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/90(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (54)发明名称 Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和 应用 (57)摘要 本发明公开了Vps28基因敲除小鼠动物模型 的构建方法和应用。 本发明公开的Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法包括向受体细胞中 导入sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突 变，sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2，sgRNA1的靶序 列为序列表中序列1的第1313-1332位，sgRNA2的 靶序列为序列表中序列1的第3118-3137位。本发 明的Vps28基因突变的方法和动物模型，为研究 Vsp28基因在乳腺组织发育、泌乳以及其它生理 生化代谢过程中的作用提供了便捷、可靠、经济 的动物模型。 权利要求书2页 说明书8页序列表9页 附图3页CN 109929876 A 2019.06.25 C N 109929876 A

权　利　要　求　书1/2页CN 109929876 A 1.细胞中VPS28基因的定点突变方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向VPS28基因的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2； 所述sgRNA1的靶序列为如下A1)、A2)或A3)： A1)序列表中序列1的第1313-1332位； A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列； A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列； 所述sgRNA2的靶序列为如下B1)、B2)或B3)： B1)序列表中序列1的第3118-3137位； B2)与B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA序列； B3)在严格条件下与B1)限定的DNA序列杂交的由B1)衍生的DNA序列。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突变。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白质为如下E1)、E2)或E3)： E1)氨基酸序列是序列2的蛋白质； E2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质； E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。 4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为受精卵。 5.利用权利要求1-4中任一所述的方法制备得到的VPS28基因发生突变的细胞。 6.制备VPS28基因突变动物的方法，包括：利用权利要求1-4中任一所述的方法制备VPS28基因突变的动物细胞，利用所述VPS28基因突变的动物细胞制备VPS28基因突变动物。 7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述动物为r1)或r2)： r1)哺乳动物； r2)小鼠。 8.权利要求1-3中任一所述sgRNA。 9.成套试剂，为成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3或成套试剂4； 所述成套试剂1由权利要求1-3中任一所述sgRNA与所述Cas9蛋白质组成； 所述成套试剂2由与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料和与所述Cas9蛋白质相关的生物材料组成； 所述与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料为下述F1)至F7)中的任一种：F1)编码所述sgRNA的核酸分子； F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒； F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体； F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物； F5)含有F1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因动物细胞系； F6)含有F1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有F2)所述表达盒的转基因动物组织； 2

转基因小鼠制备实验方法

转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究

基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１ ）＊通讯作者文章编号：１ ００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６Ｔ ＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究 王　红１， ２，３，蒋　莉４，王　岩５，许振凯６，王威平６，方　航１，２，３，孙　鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１． 南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１； ５． 吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０； ９． 肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的　为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠， 提供稳定的动物模型。方法　取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃ ｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃ ｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果　杂交后分别获得肢芽 干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组 比较，上述３种转基因小鼠ｐ－ Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论　本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高， 有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。 关键词：基因敲除小鼠；骨发育；Ｔ ＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ　Ｌｉ４，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ５，ｅｔ　ａｌ．（１．Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ａｆｆ ｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇ　ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　 Ｊｉ　Ｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　 Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ａｂｏｕｔ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏ－ｖｉｄｅ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　 ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ　ｈｅａｌｔｈｙ　 ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙ ｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　 ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　 ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ　ｏｂｔａｉｎ　８ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ．Ａｎｄ　ｐ －Ｓ６ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌｉｍｂ　ｂｕｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ　ａｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｂｙ　 Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ　ｓｈｏｗ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｈａｖｅ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ　ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　 ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　 ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ　 ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇ ｎ，２０１９，２３：１２３９） 结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　 ｃｏｍ－ｐ ｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐ ａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼— ９３２１—中国实验诊断学　２０１９年７月　第２３卷　第７期