疾病基因克隆的策略及主要方法
疾病基因克隆的策略及主要方法
申海鹰周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042）
摘要疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略——定位克隆策略、功能克隆策略——及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。
关键词基因；定位克隆；消减杂交
学科分类号Q785
Strategies and methods for cloning pathogenic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (C enter of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Milit ary Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome stu dy, while it is the disease background which decides the selection of the strategies. Tw o strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the obje ctive gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analysis, suppressio n subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PC R), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), com parative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly.
Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive hybridization
基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类5~10万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自1911年Wilson将色盲基因定位于X染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组DNA、分子杂交以及PCR技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及mRNA差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有5000个遗传性状被定位，其中400多个为致病基因［1］。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）：
目前人类基因克隆的主要策略有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过RFLP、微卫星D NA等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛
选。后者是根据致病基因的可能功能，检测Genbank中的基因功能区域，将含有接近功能域的基因用于致病的突变检测。
1. 定位克隆（positional cloning）策略
其基本思路是通过连锁分析（linkage analysis）原理进行基因定位。若多态标记与待定基因距离较远，则它们在向子代传递时会发生自由分离，呈“连锁平衡”；反之，则不发生自由分离，而呈现“共分离（co segregation）”现象，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。两基因间连锁程度以遗传距离表示：1厘摩(cM)=1%重组率，即1000kb。D NA标记的选择经历了从致病基因→ABO、HLA多态位点→RFLP→微卫星DNA的发展过程。微卫星DNA（microsatellite DNA），是一种遍布于真核基因组的短重复序列、长度2~10bp之间、按孟德尔方式遗传、呈高度多态，能进行PCR扩增。除DNA标记的进展外，基因定位也得益于连锁分析方法和理论的改进，目前主要有：家系连锁分析、等位基因共占法及人群相关性分析等。
1.1家系连锁分析（family-based linkage analysis）法
是以二代或二代以上的家系材料为基础，观察标记位点与疾病致病基因位点在家系内是否呈共分离，并计算出遗传距离及连锁程度。目前最常用的方法是优势对数计分（Lods）法，Lod值代表两位点连锁的机率与不呈连锁的机率比的对数值，>3肯定连锁，<－2否定连锁，介于1与－2之间则需增加家系材料。该法优点在于对连锁的判断能力强，能确定连锁程度，适于呈孟德尔遗传、外显率高、纯一的单基因突变病分析［2］，如糖尿病中的一种亚型MODY及少数呈多代多发患者的IDDM及NIDDM家系。缺点是需要完整的系谱材料，结果受遗传模型设定的影响，对遗传参数如基因频率、基因传递率、外显率及表型模拟率等依赖较大，故对一些复杂多基因疾病进行家系连锁分析很难获得满意结果［3］。
1.2等位基因共占（allele sharing method）法
基于观察受累同胞或家系成员间标记位点等位基因的共占情况［4］，即来源于同一祖先的致病基因由受累的亲属共占的机率大于随机分布的机率，包括受累同胞对（Affected sib pair, ASP）分析及家系成员（APM）分析。在ASP中，当标记位点与疾病无连锁时，双亲的标记位点等位基因随机分配给子代；若存在连锁，则受累同胞间共有等位基因机率将高于连锁时的预期值。A PM是ASP的延伸，通过观察家系内所有患病成员标记位点等位基因的共有情况，来提高每个家系的信息量。原则上，若具备双亲样本材料，可据此判定受累同胞的相同等位基因片段是否同源，即传递一致性（identical-by-descent, IBD）分析；若无双亲资料，则只能通过同胞间等位基因比较来推测其是否共有，即状态一致性（identical-by-state, IBS）分析。若双亲均为纯合子以致判断困难者，可经统计处理用最大拟然实验估测出最可能的传递情况［5］。
该法优点是：①不受遗传模式等遗传参数影响，为非参数分析法；②对系谱材料要求低，只需一代或二代的家系内患病成员资料，而不需非患病成员资料；③可进行定量性状研究［6］；④可研究两个不相连锁位点对疾病的联合作用，以解决复杂病易感基因间的相互关系；⑤对遗传异质性容许度大；⑥在候选基因研究中可应用间距较远（～20cM）的标记，故特别适合多基因遗传病及参数情况多数未明的复杂病研究。采用此法已发现在染色体6p24-22区域存在起很小效应的精神分裂症致病基因。缺点在于：①对连锁的判别效能弱于家系连锁分析，不能确定连锁程度；
②检出力低于相关分析；③若家系中双亲均为患者的机率较高时，因易感基因可由双亲传递给子代，会影响分析正确性。
1.3人群相关分析（association analysis）法
原理是在一定人群中设置患者组和对照组，在可能的候选致病基因附近选择遗传标记，通过观察标记位点与致病基因位点间存在连锁不平衡现象，得到某一遗传标记和引起疾病基因关联的相对危险度，又称连锁不平衡定位（linkage disequilibrium mapping, LDM）法［7］。显然，标记位点与致病基因越近，且突变率越低，杂合度越高，则用标记检测致病基因位点的机率越高。L DM法假设在人群中某一致病基因起源于同一远祖，经过若干代的传递，那些与致病基因紧密连锁的基因或DNA标记被一起分配到不同的患病个体。研究那些表面上无亲缘关系的患者是否有相同的DNA标记的等位基因，根据该DNA标记可以得到待研究基因在染色体上的定位。LDM
法适合在人口流动极小，相对同源的人群中进行。该类人群遗传背景及环境相近，但患者间亲缘关系远（较家系分析而言），故其连锁不平衡作用大，此时定位基因所需遗传标记及研究的患者数较一般人群相关性分析少。
其优点有：①无亲缘关系患者样本容易随机采集，并完全符合群体中疾病的临床谱；②为非参数分析；③检出力高于家系连锁分析，在复杂病研究中不但可以检出主效基因，而且可以检出相对风险率小于5.0的次效基因；④检出的相关位点与致病突变的距离多在1cM以内，而家系连锁分析则为2～10cM；⑤可提示相关位点或基因的传递方式及效应性质（致病或保护作用），并可由亚组分析发现疾病的遗传异质性。但相关分析亦有缺点：在种群组成差异的两组间，会因标记位点等位基因频率及易感基因频率差异导致假阳性结果，即群体分层（population stratificati on）现象。对此，一些新的研究方法如：患者家系对照者分析（affected family-based control, AFBAC）、单倍型相对风险率分析（haplotype relative risk, HRR）以及倍受推崇的家系传递连锁不平衡检验（transmission disequilibrium test, TDT）得以应用。
TDT法是在家系内进行相关分析［8］，观察双亲（至少一个为杂合子）是否有某种等位基因传递给患者的频率明显增高，而呈现连锁不平衡。TDT有以下优点：①可完全消除种族分层引起的误差；②可用于分析父、母在基因传递上的差异，如遗传印记（imprinting）的影响；③可分析相关位点参与发病程度及基因间相互关系，TDT法的应用解决了胰岛素基因是否与IDDM相关的长期争论。但TDT也有不足：①中老年发病的患者不易取得其双亲标本；②疾病异质性将明显降低其检出力，可按疾病病理性状分成亚组或直接研究该性状的相关位点，将有助于解析疾病的易感位点；③部分疾病因外显不全而发病晚，对照群体内可存在部分易感基因聚集但尚未发病的个体，以致影响检出力，可用高龄个体为对照来改善；④距候选基因较远的标记（>100kb），不能用于TDT分析。
1.4 cDNA筛选
染色体定位只是定位克隆的第一步。由于cDNA筛选、确认的困难，使其成为定位克隆策略的“瓶颈”所在。目前获得基因序列的方法大致有［9］：①对<500kb的关键部位进行直接测序；②比较基因组作图和测序；③基因结构特征分析，有关的信息可以从https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html,/ xREFdb/中得到；④cDNA捕获，并采用突变检测体系进一步验证疾病相关基因，主要有CpG岛捕捉层析法、外显子捕捉法、直接筛选PCR法等方法。cDNA筛选往往涉及到能够获得合适的标本（如存在缺失、无义突变等），有时甚至出现已获得该基因的cDNA全序列，因未发现在患者
中的突变而无法确认的现象。
2. 消减杂交（subtractive hybridization）策略
消减杂交原理是将不同个体或不同细胞来源，即通常所指的样本（tester, T）方和参照（driver, D）方的DNA或mRNA进行杂交，两者之间的差异，如缺失或特异表达的部分，因不能形成杂交体而被筛选出来［10］。该类方法有：差示反转录PCR、代表性差异分析、S1富集法、抑制性消减杂交、基因组错配扫描、比较基因组杂交及差异消减杂交等。
2.1消减杂交（subtractive hybridization, SH）法和抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）法
消减杂交法包括消减gDNA及消减cDNA文库。消减gDNA文库是将两种来源的DNA杂交，以分离较大片段的染色体缺失。Kunkel等将DMD（Duchenne muscular dystrophy）基因克隆成功，是该方法第一次在疾病基因克隆中发挥作用。消减cDNA文库法是筛选某种特异表达的cD NA片段。上述两种消减杂交法缺点在于缺乏有效的富集手段，不能获得较小的DNA缺失片段或表达量较低的mRNA。
SSH法原理是［11］：先将T方与D方mRNA逆转录成cDNA，然后用限制性内切酶将两者切割为小片段。把T方均分为二后分别连接不同的接头，与过量的D方cDNA进行不充分杂交，然后混合两份杂交样品，再与新加入的变性D方cDNA进行第二次消减杂交，杂交后完全补平末端，加入合适引物接头（接头1与接头2引物）进行PCR扩增获取目的片段。该技术避免了SH中分离单双链DNA的步骤，且因每一mRNA逆转录成的cDNA可经酶切为一个以上的片段，故检测效率较高，二轮杂交和二轮PCR可扩增大量的特异表达片段，能分离出T方上调表达的基因，具有假阳性少、重复性强的优点［12］。其缺点是：①所需起始材料较多（mRNA需数微克）；②较多依赖于PCR技术中酶切后与接头的连接效率；③不能同时进行数个材料或不同处理材料之间的比较。
2.2 差示反转录PCR（differential display reverse-transcription PCR，DD-RT-PCR）法和差异消减显示（differential subtraction display, DSD）法
DD-RT-PCR法［13］是比较不同组织或不同状态下mRNA表达的差异，原理为：利用真核细胞mRNAs结尾处polyA结构，设计一套（12条）3’端象T12MN样引物，在5’端再设计20条(10-mer)随机顺序的引物，可使不同长度的基因得到扩增。在测序胶上切下差异片段进行PCR扩增并进一步分析。该法简便、高效、易行、实验周期短（仅需一周），同时可以比较大批样本，对样品的要求较低，可检测低丰度的mRNA。不足的是：①部分已获的cDNA片段不一定是产生某一性状或疾病的原因，而可能是该疾病或性状发生后的表达产物；②信噪比过低，可出现非特异扩增，假阳性条带多；③工作量大、无法定量研究；④扩增的条带往往是3’UTR区的一段短序列，所含信息量少，常造成筛选困难。
DSD法［14］是在DD-RT-PDR呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与D方相应范围的条带，回收的D方差异条带用非生物素标记的引物与dNTPs进行PCR扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有α-32PdATP的dNTPs进行扩增，再重复差异显示，回收差异条带并克隆。此技术的最大优势是所获差异条带Northern杂交重现性好、假阳性
少、敏感性强，可获得长片段，对起始材料要求少，可获得低丰度差异表达基因。缺点是步骤繁琐、工作量大、周期长、更多依赖于PCR技术。
2.3代表性差异分析（representational difference analysis, DRA）法和S1核酸酶介导的缺失基因探针富集法
RDA法包括基因组DNA（gDNA）代表性差异分析和cDNA代表性差异分析［15］。其原理是：T方和D方cDNA在进行差示分析前，采用不同的限制性内切酶酶切，将两者PCR扩增后液相杂交，除去共有部分（称为消减富集）。只有T方DNA中仅有的序列能与自身复性形成3’末端突出的粘性末端，再加入TaqDNA多聚酶，那些自身变性的5’端带有接头的双链DNA的3’端被补平。并以其为PCR引物的结合点，富集T方中特有序列（称为动力学富集）。该法优点是：①假阳性少，不会产生象DD-RT-PCR那样模凌两可的结果，从而降低了随后分析的难度；②cD NA RDA可用于非polyA结尾的mRNA的检测，且可选择性扩增T中的单拷贝序列；③在复杂性状相关基因定位中，可应用RDA法构建染色体区域连锁图，为连锁分析提供条件，同时也可以将这些片段作为侯选基因筛查的探针。
S1富集法［16］的原理近似与RDA法，所不同的是用同一种限制性内切酶酶切D方和T方D NA，将寡核苷酸引物连接到填平了末端的T方DNA片段上，液相杂交后以S1核酸酶降解单链，T中仅有的DNA形成的平头末端双链不被降解，而得以扩增富集。这两种方法可成功富集<50k b的片段，将仅在样本中存在的DNA片段富集105~106倍。
上述两法的缺点是所需的起始材料较多、周期较长，不能用于点突变、小的缺失或插入、转录末端片段及缺乏合适酶切位点的基因检测，因为往往不清楚什么情况下某一器官或组织会发生基因重组，也不知道组织中基因嵌合的程度，故可能难以达到预期目的。另外，酶切结果也可使cD NA的信息量丢失。
2.4基因组错配扫描（genomic mismatch scanning, GMS）法
GMS采用与RDA相反的思路［17］，目的是从遗传背景有差异，但遗传性状相同的远亲受累亲属中筛选出那些可能包含有导致这一性状的基因相同的DNA片段（IBD序列）。GMS操作过程是先将两个血亲个体gDNA用限制性内切酶切割，其中一个以DAM甲基化酶处理后与另一个血亲gDNA等量混合杂交，形成同源和异源双链，用Dpn1和Mbo1等酶去除两条链都被甲基化和两条链都未被甲基化的双链DNA分子，再用MutHLS酶去除来自不同基因组但不精确配对的杂交双链；将筛选到的IBD序列作为探针，与列阵排布的全基因组克隆进行杂交，即可将其迅速定位。GMS法优点在于对多基因引起的疾病，如肿瘤、糖尿病等更为有效，GMS相当于用极限密度的DNA多态标记（以人群每300bp有一个碱基变异计算，人基因组3×109中大约包括10 7潜在的多态标记）进行连锁作图，因而能迅速检测受累亲属对中的IBD序列［18］，这为复杂性状相关基因的分离和定位开辟了一个新的途径。其缺点是该法所获取的DNA量较少，另外人类基因组中存在的大量重复顺序会影响杂交的有效性和特异性。
2.5比较基因组杂交（comparative genome hybridization, CGH）法
是一种将消减杂交、荧光染色体原位杂交（fluorescence in situ hybridization FISH）相结合，用于检测待测组织DNA顺序拷贝数目的变化（缺失、扩增、复制），并将这些异常在染色体上
定位的方法［19］。将不同基因组DNA分别用不同颜色（绿、红）的荧光标记后，等比例一同与染色体杂交，扫描不同染色体上两种颜色的比率变化，来判断该处存在缺失或扩增。CGH法是消减杂交策略各方法中唯一不能直接获得基因片段的方法，其优点是CGH在一次实验中即可对整个基因组进行检测，节省了操作步骤，并能将检测出的异常DNA序列在染色体上定位，便于进一步筛选相关基因。其缺点是不能显示染色体易位、倒位及其他不改变DNA拷贝数目的异常，并且该法的稳定性和重复性有待于提高。
2.6 DNA微阵列杂交系统
新近DNA微阵列（DNA micro arrays）又称DNA芯片（DNA chips）技术的发展［20］，使研究者可以从感兴趣的文库中随机选择克隆。这种平行分析与DNA测序相结合可以高效地进行人类基因组表达分析和探寻未知基因。该系统在概念与功能上与中期染色体FISH相似，但有3点重要区别：①DNA芯片靶单元不受组成成分限制，可以使中期YAC克隆，或显微切割的染色体单体，也可使单个CDNA克隆和寡核苷酸，故更具灵活性；②DNA芯片比FISH法更容易识别和定量分析；③该系统具有更好的一致性和连续性，可以进行自动化制作、杂交和数据分析。
3. 两类策略的联系
上述两种策略虽然主导思想有所不同，但可以相互补充，有些过程也是两者共有的，例如cDNA 的筛查已经成为这两类方法共同的限速途径。表达序列标志（expressed sequence tags, EST）正是这两类方法之间的桥梁。一些消减杂交的手段可用于定位克隆，反之亦然。如GMS可用于连锁不平衡分析，而通过连锁分析将致病基因初略定位后，可以将该片段染色体进行显微切割，与正常片段进行消减杂交，以获得特异的缺失DNA片段。随着人类基因组计划的进展，将逐渐使连锁图、物理图及EST图密度和精度提高，也将给基因的定位、克隆带来深远的影响。方法上，定位克隆将省略建立contig寻找cDNA的工作；消减杂交则会省略定位和获得全长DNA的步骤。
但是，将5~10万个基因定位及克隆终究是一项艰巨的工程，我们相信新技术、新方法的不断应用和完善，必将大力推进人类功能基因组学的研究进程。
参考文献
1. Tom S, Andrew P.R. Identifying human disease genes. Human Molecular Genetics. Ox ford U.K. Bios Scientific Publisher Ltd.1996:367-99
2. Rust S, Walter M, Funke H, et al. Assignment of Tangier disease to chromosome 9q3 1 by a graphical linkage exclusion strategy. Nat Genet, 1998 Sep 20:196-198
3. Badner JA, Gershon ES, Goldin LR. Optimal ascertainment strategies to detect linkage to common disease alleles. Am J Hum Genet, 1998 Sep 63:3880-3888
4. Holmans P. Affected sib-pair methods for detecting linkage to dichotomous traits: revi ew of the methodology. Hum Biol, 1998 Dec, 70:6, 1025-40
5. Davies JL, Kawaguchi Y, Bennett ST, et al. A genome-wide search for human type 1-diabetes susceptibility genes. Nature, 1994,371(6493): 130-6
6. Gu C, Rao DC. A linkage strategy for detection of human quantitative-trait loci.Ⅰ.Gen eralized relative risk ratios and power of sib pair with extreme trait values. Am J Hum Genet, 1997,61:1,200-10
7. Schibler L, Cribiu EP, Oustry-Vaiman A, et al. Fine mapping suggests that the goat P olled Intersex Syndrome and the human Blepharophimosis Ptosis Epicanthus Syndrome map to a 100-kb homologous region. Genome Res 2000 Mar;10(3):311-8
8. Bevan S, Popat S, Houlston RS. Relative power of linkage and transmission disequilibr ium test strategies to detect non-HLA linked celiac disease susceptibility genes. Gut, 199 9,45:5,668-71
9. Boehm T. Positional cloning and gene identification. Methods, 1998,14:152-158
10. Zhu F, Yan W, Zhao ZL, et al. Improved PCR-based subtractive hybridization strateg y for cloning differentially expressed genes. Biotechniques 2000 Aug;29(2):310-3
11. Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a m ethod for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996 Jun, 93:12, 6025-30
12. Zylka MJ; Reppert SM. Discovery of a putative heme-binding protein family (SOUL/H BP) by two-tissue suppression subtractive hybridization and database searches. Brain Res Mol Brain Res, 1999 Dec, 74:1-2, 175-81
13. Verkoczy LK; Berinstein NL. Isolation of genes negatively or positively co-expressed with human recombination activating gene 1 (RAG1) by differential display PCR (DD RT-PCR). Nucleic Acids Res, 1998 Oct, 26:19, 4497-507
14. Pardinas JR; Combates NJ; Prouty SM; et al. Differential subtraction display: a unifie
d approach for isolation of cDNAs from differentially expressed genes. Anal Biochem, 19
98 Mar, 257:2, 161-8
15. Ying SY; Lin S . High-performance subtractive hybridization of cDNAs by covalent bo nding between specific complementary nucleotides. Biotechniques, 1999 May, 26:5, 966-8, 970-2, 979 passim
16. Zhu S, Wu M. Enrichment of DNA fragment for deleted sequences in human genom
e with nuclease S1 digestion and PCR amplification. Nucl Arids Res.1994,22:12,2428-9
17. Cheung VG; Nelson SF. Genomic mismatch scanning identifies human genomic DNA
shared identical by descent. Genomics, 1998 Jan, 47:1, 1-6
18. Morrow BJ; Graham JE; Curtiss R . Genomic subtractive hybridization and selective c apture of transcribed sequences identify a novel Salmonella typhimurium fimbrial operon and putative transcriptional regulator that are absent from the Salmonella typhi genome. Infect Immun, 1999 Oct, 67:10, 5106-16
19. Helou K, Lu XC, Montelius-Alatalo K, et al. A dual-color FISH framework map for th
e characterization o
f the Sai1 tumor suppression region on rat chromosome 5. Genes Ch romosomes Cancer 2000 Apr;27(4):362-72
20. Zeschnigk M, Horsthemke B, Lohmann D. Detection of homozygous deletions in tum ors by hybridization of representational difference analysis (RDA) products to chromosom e-specific YAC clone arrays. Nucleic Acids Res 1999 Nov 1;27(21):e30
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
整个基因克隆实验流程完整
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
基因克隆步骤
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
整个基因克隆实验流程(完整)
整个基因克隆实验流程(完 整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研 钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个 新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室 温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，
基因组拷贝数变异及其突变机理与人类疾病
HEREDITAS (Beijing) 2011年8月, 33(8): 857―869 ISSN 0253-9772 https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html, 综 述 收稿日期: 2011?04?07; 修回日期: 2011?06?03 基金项目:国家自然科学基金项目(编号: 30890034, 31000552), 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(编号: NCET-09-0322)和上海市浦江人才 计划项目(编号: 10PJ1400300)资助 作者简介:杜仁骞, 在读博士研究生, 研究方向: 基因组拷贝数变异。E-mail: renqian.du@https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html, 通讯作者:张锋, 博士, 副教授, 博士生导师, 研究方向: 人类遗传学和医学遗传学。E-mail: feng.fudan@https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00857 基因组拷贝数变异及其突变机理与人类疾病 杜仁骞1,2, 金力1,2,3, 张锋1,2 1. 复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室, 上海200433; 2. 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室, 上海200433; 3. 复旦大学生物医学研究院, 上海200032 摘要: 拷贝数变异(Copy number variation, CNV)是由基因组发生重排而导致的, 一般指长度为1 kb 以上的基因 组大片段的拷贝数增加或者减少, 主要表现为亚显微水平的缺失和重复。CNV 是基因组结构变异(Structural variation, SV)的重要组成部分。CNV 位点的突变率远高于SNP(Single nucleotide polymorphism), 是人类疾病的重要致病因素之一。目前, 用来进行全基因组范围的CNV 研究的方法有: 基于芯片的比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)、SNP 分型芯片技术和新一代测序技术。CNV 的形成机制有多种, 并可分为DNA 重组和DNA 错误复制两大类。CNV 可以导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见疾病, 同时与复杂疾病也相关。其致病的可能机制有基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。对CNV 的深入研究, 可以使我们对人类基因组的构成、个体间的遗传差异、以及遗传致病因素有新的认识。 关键词: 拷贝数变异; 突变机理; 疾病; 人类基因组 Copy number variations in the human genome: their mutational mechanisms and roles in diseases DU Ren-Qian 1,2, JIN Li 1,2,3, ZHANG Feng 1,2 1. MOE Key Laboratory of Contemporary Anthropology , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433, China ; 2. State Key Laboratory of Genetic Engineering , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433, China ; 3. Institutes of Biomedical Sciences , Fudan University , Shanghai 200032, China Abstract: Copy number variation (CNV) is the main type of structure variation (SV) caused by genomic rearrangement, which mainly includes deletion and duplication of sub-microscopic but large (>1 kb) genomic segments. CNV has been recognized as one of the main genetic factors underlying human diseases. The mutation rate (per locus) of CNV is much higher than that of single nucleotide polymorphism (SNP). The genome-wide assays for CNV study include array-based comparative genomic hybridization (aCGH), SNP genotyping microarrays, and next-generation sequencing techniques. Various molecular mechanisms are involved in CNV formation, which can be divided into two main categories, DNA re-combination-based and DNA replication-based mechanisms. CNVs can be associated with Mendelian diseases, sporadic diseases, and susceptibility to complex diseases. CNVs can convey clinical phenotypes by gene dosage, gene disruption, gene fusion, and position effects. Further studies on CNVs will shed new light on human genome structure, genetic varia-tions between individuals, and missing heritability of human diseases. Keywords: copy number variation; mutational mechanism; diseases; human genome
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
山羊基因克隆实验方案设计
山羊基因克隆实验方案设计 第五组 1. 提取DNA 2. DNA检测（电泳） 3. 目的DNA片段基因扩增（PCR） 4. DNA检测（电泳） 5. 目的基因片段与载体连接 6. 大肠杆菌感受态细胞的制备 7. 导入受体细胞与蓝白斑筛选 8. 阳性克隆鉴定 9. DNA测序 一、DNA提取 【实验目的】 指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。 【实验原理】 组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。 【实验步骤】 1. ＜30 mg组织，用眼科剪剪碎，加入200 TL buffer＋20 μL PK，55℃水浴1-3 h。 2. 加入220 μL buffer BL，振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液变清亮。 3. 10000 r离心2 min，移上清液至新离心管。 4. 加220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，可能会出现絮状沉淀。 5. 将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000 r离心30 s，弃废液。 6. 向吸附柱加入500 μL WB，12000 r离心30 s，弃废液。 7. 向吸附柱加入500 μL wash buffer，12000 r 离心30 s，弃废液，空滤一次。 8. 将吸附柱转入干净离心管，加入50 μL TE，放置5 min，12000 r离心2 min，备检。 二、DNA电泳检测 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼
脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。 【仪器与试剂】 琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）、凝胶槽、电泳仪 【实验步骤】 1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。 2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。 3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。 4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。 5．DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。 6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。 7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA 带之间）。 8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 三、目的DNA片段基因扩增（PCR） 方案1：遗传学实验31，PCR扩增基因片段 方案2： 【实验目的】 了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。【实验原理】 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/a010420535.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
疾病基因克隆的策略及主要方法
疾病基因克隆的策略及主要方法 申海鹰周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042） 摘要疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略——定位克隆策略、功能克隆策略——及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。 关键词基因；定位克隆；消减杂交 学科分类号Q785 Strategies and methods for cloning pathogenic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (C enter of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Milit ary Medical University, Chongqing 400042) Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome stu dy, while it is the disease background which decides the selection of the strategies. Tw o strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the obje ctive gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analysis, suppressio n subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PC R), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), com parative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly. Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive hybridization 基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类5~10万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自1911年Wilson将色盲基因定位于X染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组DNA、分子杂交以及PCR技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及mRNA差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有5000个遗传性状被定位，其中400多个为致病基因［1］。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）： 目前人类基因克隆的主要策略有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过RFLP、微卫星D NA等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛