T 细胞斑点试验

T 细胞斑点试验( T SPOT -TB)在结核性脑膜炎早期诊断中的意义探讨

结核病（Tuberculosis，TB）被称为“白色瘟疫”，已经演变为全球性公共卫生问题，而结核性脑膜炎（Tuberculous Meningitis，TBM）在结核病中的发病率为10％-20％，是最常见、最严重的肺外结核病，死亡率为15％-30％，致残率和致死率高。其预后与早期诊断从而早期治疗有密切关系。但由于结核性脑膜炎早期临床表现及脑脊液改变特异性差，与病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎等疾病较难鉴别，目前国内外尚缺乏理想的早期诊断方法。结核性脑膜炎常用的实验室诊断方法主要有脑脊液细菌培养、脑脊液抗酸染色、脑脊液常规生化、结核抗体检测、PPD试验等，结核性脑膜炎确诊的金指标为脑脊液培养结核菌生长或脑脊液抗酸染色找到结核杆菌，但上述检测方法特异性和灵敏性尚不令人满意，给结核性脑膜炎的早期诊断带来了困难。T 细胞斑点试验（T SPOT -TB）则是利用酶联免疫斑点法（ELISPOT法）探测结核感染者的特异性T 细胞来诊断结核的一种新方法，该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在于致病性结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生的ESAT-6和CFP-10（culture filtrate protein）作为特异性抗原刺激机体T 淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-γ。根据这一原理，T SPOT -TB试验是利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存在结核感染特异性T 细胞，这些T 细胞在受到致病性结核杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-γ而设计的T 细胞免疫斑点试验。酶联免疫斑点法（ELISPOT法）检测特异性淋巴细胞筛查结核患者现已应用于欧美各国临床诊断中，而在国内仅处于试验性诊断阶段。众所周知，结核性脑膜炎的免疫学反应与肺结核等颅外结核感染并无二致，故推测该方法亦可用于结核性脑膜炎的早期诊断。目的：应用结核感染T 细胞斑点试验（T SPOT -TB）检测血液中IFN-γ分泌T 细胞，探讨此方法对早期结核性脑膜炎的诊断意义。方法：选择2007年10月至2009年4月在南昌大学第一附属医院感染科收治的30例发病<14天的结核性脑膜炎患者，以及同期收治的15例非结核颅内感染患者（包括病毒性脑膜炎5例、化脓性脑膜炎5例、新型隐球菌脑膜炎5例）。分别取抗凝全血8ml，分离提取单个核细胞，应用ELISPOT法检测血液中IFN-γ分泌T 细胞，实验结果与ELISA法检测脑脊液结核抗体结果、脑脊液抗酸染色结果、脑脊液细菌培养结果、PPD试验结果进行比较。结果：1.ELISPOT法检测血液中IFN-γ分泌细胞：结核性脑膜炎组患者共30例，阳性27例，阴性3例，阳性率90％。非结核颅内感染组患者共15例，阳性2例，阴性13例，阳性率13.3％。2.ELISA法检测脑脊液结核抗体：结核性脑膜炎组患者共30例，阳性5例，阴性25例，阳性率16.7％，非结核颅内感染组患者共15例，阳性为2例，阳性率13.3％。3.脑脊液抗酸染色：结核性脑膜炎组患者共30例，阳性4例，阴性26例，阳性率13.3％，非结核颅内感染组患者共15例，阳性为0例。4.脑脊液细菌培养：结核性脑膜炎组患者共30例，阳性0例，非结核颅内感染组患者共15例，阳性为1例，阳性率0.6％。5.PPD试验：结核性脑膜炎组患者共30例，阳性16例，阴性14例，阳性率53.3％，非结核颅内感染组患者共15例，阳性为6例，阳性率40％。ELISPOT法检测血液中IFN-γ分泌T 细胞（T spot -TB）敏感性高于ELISA 法检测脑脊液结核抗体、脑脊液抗酸染色、脑脊液细菌培养、PPD试验，具有高度敏感性，且通过与非结核颅内感染组的对比，证实其有高度特异性。结论：T 细胞斑点试验（T SPOT -TB），即ELISPOT法检测血液中IFN-γ分泌细胞，是一种有效的结核性脑膜炎早期诊断的辅助检查方法。

作者何江龙

学科专业内科学(传染病)

授予学位硕士

授予单位南昌大学医学院

导师姓名张伦理

学位年度2009

关键词

T 细胞斑点试验

结核性脑膜炎早期诊断检查方法MeSH主题词

结核(Tuberculosis)

敏感性与特异性(Sensitivity and Specificity) 感染(Infection)

血吸虫病诊断标准要点

血吸虫病诊断标准（WS261-2006） 1 范围 本标准规定了血吸虫病的诊断依据、诊断原则、诊断标准和鉴别诊断。本标准适用于全国各级疾病预防控制机构和医疗机构对血吸虫病的 诊断。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准： 2.1血吸虫病 是由血吸虫寄生于人体内所引起的寄生虫病。在我国特指日本血吸虫病，是由日本血吸虫寄生于人和哺乳动物体内所引起的疾病。 2.2急性血吸虫病 由于人在短期内一次感染或再次感染大量血吸虫尾蚴而出现发热、肝脏肿大及周围血液嗜酸粒细胞增多等一系列的急性症状。潜伏期大多为30d～60d，平均约41.5d。 2.3慢性血吸虫病 是指人体经常接触疫水或少量多次感染血吸虫尾蚴使临床表现较轻，或无症状、体征。急性血吸虫病未治愈者，也可演变为慢性血吸虫病。 2.4晚期血吸虫病 是指出现肝纤维化门脉高压综合征，严重生长发育障碍或结肠显著肉芽肿性增殖的血吸虫病患者。病人由于反复或大量感染血吸虫尾蚴，未经及时、彻底的治疗，一般经过2年～10年的病理发展过程，可演变成晚期血吸虫病。

3.1流行病学史（参见附录A） 3.1.1发病前2周至3个月有疫水接触史。 3.1.2居住在流行区或曾到过流行区有多次疫水接触史。 3.2临床表现（参见附录A） 3.2.1发热、肝脏肿大及周围血液嗜酸粒细胞增多为主要特征，伴有肝区压痛、脾脏肿大、咳嗽、腹胀及腹泻等。 3.2.2无症状，或间有腹痛、腹泻或脓血便。多数伴有以左叶为主的肝脏肿大，少数伴脾脏肿大。 3.2.3临床有门脉高压症状、体征，或有结肠肉芽肿或侏儒表现。 3.3实验室检测 3.3.1下列试验至少有一种反应阳性（见附录B） 3.3.1.1间接红细胞凝集试验。 3.3.1.2酶联免疫吸附试验。 3.3.1.3胶体染料试纸条法试验。 3.3.1.4环卵沉淀试验。 3.3.1.5斑点金免疫渗滤试验。 3.3.2粪检找到血吸虫虫卵或毛蚴（见附录C）。 3.3.3直肠活检发现血吸虫虫卵（见附录C）。 3.4吡喹酮试验性治疗有效 4 诊断原则 根据流行病学史、临床表现及实验室检测结果等予以诊断。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

细胞增殖教学设计

《细胞的增殖》教学设计 巨鹿二中王耀华 一．教材分析： 细胞的增殖是必修一《分子与细胞》第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。 二、学情生分析： 高一的学生由于在初中基本上不学习生物学，对生物学中的一些基本概念不甚了解，而且缺乏一定的空间感，故对本节内容的学习比较困难。因此要借助多媒体或模型来帮助理解。三．教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。可以通过不同方式，从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 四．教目学标： （一）知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。 （二）能力目标： 1、学习用曲线图描述DNA和染色体数量的变化规律 2、通过学习有丝分裂过程培养学生分析图像、解读图像的能力。 3、通过实验培养学生制作临时装片的技能，培养学生的观察、分析能力以及识图和绘图能力。 （三）情感态度与价值观： 1、通过对细胞周期以及有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化的学习，培养学生树立唯物主义的世界观。使学生对生命的运动性、对事物发展变化过程中由量变到质变的转化等哲学问题有正确的认识。 2、通过对实验思路的分析和对实验现象的观察培养学生实事求是的科学态度和严谨的科学工作作风。 五．教学重难点： 教学重点：1、细胞周期的概念。

斑点杂交实验

斑点杂交实验 探针的标记： 取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。 点膜： 样品DNA：50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释） 变性：1N NaOH 30分钟 中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。 预杂交： 预杂交液 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）

膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。 杂交： 杂交液的配制： 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml） 双蒸水补4ml 探针DNA（变性）20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗：62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’

免疫学实验整理

免疫学实验整理 一、凝集试验、吞噬试验 （一）凝集试验 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （二）吞噬试验（示教） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 名解： 1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。 2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。 3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。 4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。 5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。 6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer. 实验及注意点： 1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原） 检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。

Brdu细胞增殖检测实验

Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细

CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度：0, 2000，4000，8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。） 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37C, 5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720（终浓度3um）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。

结核斑点试验操作简要

结核斑点试验操作步骤-2 1.先分离淋巴细胞 一、每个病人标本准备15ml离心管2支，编号1#，2#。 二、在1#管加3ml Ficoll；2#加4ml血和3ml 1640 三、将2#管中液体7ml慢慢加入1#中（让血加在Ficoll上面）， -18 C 1000g离心22min。 四、将离心好的1#管中的淋巴细胞层由上向下慢慢吸取约 5ml（尽量将细胞吸取干净），加入到新的15ml离心管中，并 加1640至10ml，颠倒混匀后600g离心7min。18C 五、离心后尽快倒掉上清，先加1ml 1640培养液，吹打把细 胞打开。再加1640至10ml，混匀。 六、350g离心7min。倒掉上清，加入500μlAIM-V培养液， 震荡混匀。 2.细胞计数及稀释 七、计数细胞：取100μl台酚蓝于96孔板中，再加入25μl

步骤六液，吹打混匀，取出10μl加在细胞计数板上，显微镜下计数活细胞。 3.抗原A\B刺激特异性T淋巴细胞使之产生特定的细胞因子 八、根据标本数取本试剂盒中的微孔板，每份样本用4个检测孔，顺序标记各孔：○阴性对照、○抗原A、○抗原B、○阳性对照。（每条微孔板也标记好序号）。 九、按顺序加入阴对（ AIM-V）、抗原A、抗原B、阳对，各50μl，每孔加100ul配置好的细胞液。（A和阴对用一个枪头，B和阳对用一个枪头），全部加完后，标注时间，放入CO2培养箱培养16-20小时。 4酶联免疫检测☆☆☆ 十、次日准备1×PBS液，用200μl PBS洗板，重复洗4次.（洗去除因子外多余细胞及因子） 十一、根据标本量先计算好酶结合物工作液所需的量，以1:200的比例将酶结合物（酶标抗体）原液与PBS液混合，制成酶结合物工作液，每孔加50μl。4-8度孵育1小时。

CFSE细胞增殖实验

准备： 1.20ml预冷5%FBS(HI)-PBS 2.50ml 预冷MACS buffer 3.70um滤网 4.2.5ml RBC lysis 5.LS column 6.50ml 37度预热PBS 7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat Inactivated FBS+10 mM HEPES+1 mMpenicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol) （一）CD3抗体包被 取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。 （二）淋巴细胞获取 1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。 2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。 3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。留取105 个细胞进行FACS。 （三）磁珠分选na?ve CD8a+ T细胞 1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells. 7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 8.Wash cells by adding 10ml of MACS bufferper 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS bu ffer. 10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.

斑贴试验及临床应用介绍

1、什么是斑贴试验？ 斑贴试验在临床上应用有100多年的历史，对协助诊断接触性皮炎，检测接触性变应原的可靠性已经在临床上得到了充分证明。在欧美等发达国家，斑贴试验技术是皮肤科医师须具备的基本技能之一。 2、斑贴试验原理是怎样的？ 将小量接触性变应原直接接触皮肤一段时间后，观察是否在局部诱发一个轻度的接触性皮炎，从而判断患者是否对所测试的变应原接触过敏。主要用于迟发型变态反应（Ⅳ型变态反应）的病因诊断，确定引起迟发型接触性变态反应的变应原。 斑贴试验是一个仿真试验，属于皮肤激发试验，如果测试的变应原对皮肤有刺激，同样可以诱发出刺激性皮炎，因此，斑贴试验应该尽可能避免刺激性反应。首先，尽量选择市场销售成熟的变应原进行测试。其次，斑贴试验可以引起如接触性荨麻疹甚至全身严重过敏反应的速发型接触性反应，有此类病史的患者不要使用可能引起速发型变态反应的变应原进行斑贴试验。 3、哪些患者应该进行斑贴试验？ 斑贴试验适合于临床上所有怀疑存在接触变应原引起的接触性过敏的检测，包括：①变应性接触性皮炎，皮炎湿疹患者有明确接触史提示可能是变应性接触性皮炎的患者；②特应性皮炎患者；③各类湿疹皮炎尤其是脂溢性皮炎、淤积性皮炎等有急性发作史者；④接触性皮炎综合征（系统性接触性皮炎）：表现为手足无规律的水疱性湿疹、狒狒综合征样发疹或泛发性湿疹；⑤虽无明确接触史，但发生在特殊部位的皮炎，如，手部、面部、颈部等暴露部位的皮炎湿疹；⑥淤积性皮炎、慢性湿疹及其他慢性复发性皮肤病怀疑有继发性外用药物接触过敏时；⑦需要鉴别变应性接触性皮炎与刺激性接触性皮炎时；⑧药物性皮炎、食物过敏等怀疑是迟发型变态反应引起时（此时应该分别实施药物性斑贴试验及特应性斑贴试验）。 另外，对于有体内植入物（假牙、假体等）、皮肤黏膜（口腔、结膜、外阴等）部位出现的皮肤炎症反应也应考虑是否为变应性接触性皮炎。 4、斑贴试验测可以检测哪些物质？ 斑贴试验测试除了特应性斑贴试验中所用的是大分子物质外，变应原多数是小分子化学物质，广泛存在于我们的生产和生活环境中，如，衣物、首饰、居家用品、洗浴用品、生产材料、劳动工具、化妆品、药品、食品及添加剂等中。

医学检验免疫学检验归纳总结

三大免疫结合反应 直接凝集反应玻片凝集反应 试管凝集反应 间接凝集反应间接血凝试验 胶乳凝集试验 凝集反应 P47 明胶凝集试验 自身细胞凝集试验 抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原） 间接coombs试验（血清中的游离抗原） 液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法 抗体稀释法 免疫浊度测定 沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳 交叉免疫电泳 三大标记技术 一、放射免疫：放射免疫： 免疫放射：

二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法 光 免固相抗体竞争法 疫 分固相抗原竞争法 析 类 型 荧光偏振免疫测定测定 荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析 异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法 双位点一步法 Ag 间接法 双抗体夹心法 竞争法 捕获法 其他标记技术 化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术 固相膜免疫测定免疫试验IFA 免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA

免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱滤过法 磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法 免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法 淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：.......... 吞噬细胞...............

斑点金免疫渗滤试验

斑点金免疫渗滤试验 斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。 （一）原理 以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。 （二）试剂和操作 1.渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm

的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。 2.试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。 3.测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下： （1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。 （2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。 （3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。 （4）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。 （三）质量控制 滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。医学|教育网搜集整理双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法

细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程（以贴壁细胞为例） 1. 收集对数期细胞，调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。 3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。

保健用品毒理学评价程序与检验方法——人体皮肤斑贴试验

DB22/T 396.12—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第12部分：人体皮肤斑贴试 验 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能得安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施。并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品毒理学人体皮肤斑贴试验评价程序。 本标准适用于保健用品毒理学人体皮肤斑贴试验检验方法。 2 人体皮肤斑贴试验目的 检测受试物引起人体皮肤不良反应的潜在可能性。 3 试验基本原则 3.1 选择合格的志愿者作为试验对象。 3.2 应用特制的斑试材料进行人体斑贴试验。 3.3 根据保健用品的不同性质，斑贴试验时可选用保健用品原物、或将其稀释成不同浓度作为受试物。 3.4 要求先完成动物多次皮肤刺激试验并出具书面证明， 然后方可安排人体斑贴试验。 3.5 受试者的选择 3.5.1 选择18～60岁符合试验要求的志愿者作为受试对象，人数不少于30例。 3.5.2 不能选择有下列情况者作为受试对象： a)近一周适用抗组胺药或近一个月内使用免疫抑制剂者； b)近两个月内受试部位应用任何抗炎药物者； c)受试者患有炎症性皮肤病临床未愈者； d)胰岛素依赖性糖尿病患者； e)正在接受治疗的哮喘或其它慢性呼吸系统疾病患者； f)在近6个月内接受抗癌化疗者； g)免疫缺陷或自身免疫性疾病患者； h)哺乳期或妊娠期妇女； i)双侧乳房切除或双侧腋下淋巴结切除者； j)在皮肤待试部位由于疤痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其它瑕疵而影响试验结果的判定者； k)参加其它的临床研究者； l)体质高度敏感者； m)非志愿参加者或不能按试验要求完成规定内容者。 4 试验方法 1

第二十二章 金免疫技术

第二十二章金免疫技术 Chapter 22 colloidal gold immunoassay 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：免疫金标记技术、胶体金、免疫金的概念，金免疫技术的主要类型，金免疫测定技术的类型、原理和临床应用；熟悉：金免疫组织化学染色技术的类型、原理及临床应用；了解：胶体金特性及其制备，免疫金的制备及技术要点，各检测技术方法的技术要点。 二、教学内容 1．胶体金与免疫金制备：胶体金特性及其制备，免疫金的制备。 2。金免疫测定技术：斑点金免疫渗滤试验，斑点金免疫层析试验，临床应用及评价。 3。金免疫组织化学技术：免疫金(银)光镜染色技术，免疫金电镜染色技术，临床应用与评价。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1. 金免疫技术由Faulk和Taylor始创，最初用于 A. 金免疫电镜染色 B. 金（银）免疫光镜染色 B. 斑点金免疫渗滤试验 D. 斑点金免疫层析试验 E. 金免疫定量检测 2. 有关胶体金颗粒大小特性的正确描述 A. 胶体金颗粒越大，λmax越小 B. 胶体金溶液呈色与胶体金颗粒大小无关 C. 胶体金颗粒越大，呈色越深 D. 胶体金颗粒大小与制备时柠檬酸三钠加入量无关 E. 胶体金颗粒大小与制备时柠檬酸三钠加入量呈正比 3. 同时检定胶体金颗粒大小和均一度的方法是 A.观察胶体金溶液的颜色 B.分光光度计扫描λmax C.扫描电镜观察 D.对流免疫电泳 E.免疫电泳 4. 在免疫金的制备原理中，胶体金与蛋白质结合力为 A.肽键结合力 B. 二硫键结合力 C. 氢键结合力 D. 静电引力 E. 疏水作用力 5. 关于胶体金保存的描述，正确是 A. 置于洁净的玻璃器皿 B. 加防腐剂不利于保存 C. 使用时为提高标记效率不必低速离心去除凝集颗粒 D. 保存过程产生少量胶体金凝集颗粒就会影响以后胶体金的标记。 E. 应于干燥处避光保存 6. 当前免疫电镜技术中应用最广的标记物 A. 辣根过氧化物酶 B. 硝酸银 C. 胶体金 D. 铁蛋白 E. FITC 7. 斑点金免疫渗滤试验间接法测血清标本中抗体,导致假阳性结果的主要原因 A. 血清标本中非目的IgG的干扰 B.血清标本中非目的抗原的干扰 C.洗涤不充分

细胞增殖MTT检测经验总结

细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

斑点杂交实验服务

斑点杂交实验服务 一、实验技术简介: 斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。【晶莱生物】 二、实验技术原理: 斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。 慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验， 蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、 核心期刊等服务。 三、实验操作流程： 1、DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 2、RNA斑点杂交 与上法类似、，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯0仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 3、完整细胞斑点杂交 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 四、实验注意事项： 客户提供： TotalRNA（DNA）≥20ug，浓度>1ug/ul，A260/A280>1.8；提供标记后的探针，需同时告知标记后探针的浓度及活性，待检测目的基因的Genbank 序列号。 交付标准： 1、图片

细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解

如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料

艾滋病的实验室诊断方法

科研方法学 班级：2008级研3班学号：2008128 姓名：段治华

艾滋病的实验室诊断方法 段治华 （山西医科大学，太原030001） 摘要:艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染引起的传染病，实验室检测是诊断艾滋病的主要手段，检测项目包括HIV抗原和抗体检测，病毒载量检测，CD4T 淋巴细胞检测，HIV耐药性检测，基因芯片技术的运用，病毒分离等。近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步，为艾滋病的准确诊断提供可靠的方法。 关键词:艾滋病 HIV 实验室诊断 艾滋病是获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS) 的英文音译，由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV) 感染引起的以免疫功能缺陷为主要特点的传染病[1]。目前在我国，艾滋病的流行已进入快速增长期，要有效地预防和控制艾滋病的流行，必须有可靠的诊断方法快速准确地诊断艾滋病。目前，艾滋病的诊断主要依靠实验室检测方法，近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步。现简单叙述目前采用的实验室诊断HIV的方法。 1 HIV结构特点 人类免疫缺陷病毒（HIV）外型呈球形或卵形，直径90～130nm，病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成其包膜。核心含有两条相同拷贝的RNA 链，外周核膜由多种蛋白质形成。HIV属逆转录病毒，基因组中存在三个大的开放读框，其顺序是gag-pol-env。Gag基因编码55KD的前体蛋白，在病毒成熟过程中，被pol基因编码的蛋白酶加工，分别产生核心蛋白P17、核壳蛋白P24和核酸结合蛋白P15 。P24是核壳组成蛋白，构成病毒的核衣壳，它的结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。在HIV-2与P24对应的是主要核心抗原P32，为HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白，由外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白