斑点杂交实验
乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)
乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法） 1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。 2.应用范围: PCR实验室。 3.职责: 3.1 文件编写：实验室技术员。 3.2 文件审核：实验室主管。 3.3 文件审批：实验室主任。 3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。 4. 参考文献: 4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》 4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书 5. 内容: 5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。 5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA. 5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。 5.3.1 标本类型：血清。 5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。 5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。 5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。 5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。 5.4 设备和试剂: 5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。 5.4.2 试剂： 5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒 5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100
检测试剂盒反向斑点杂交法
人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书 （PCR-反向斑点杂交法） 【产品名称】 通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB） 【包装规格】25人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。 【检测原理】反向斑点杂交法 本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。 本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、 68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、 69、70、72、81型。
【主要组成成分】 【自备试剂】 1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓 HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容 至200mL，高压灭菌，室温保存。 3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0， 定容至1000mL，室温保存。 4、A液：(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 5、B液：（0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 6、C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。 【储存条件及有效期】 核酸扩增组分（试剂盒I）于-20℃以下冷冻保存；杂交组分（试剂盒II）和核酸提取组分于2～8℃冷藏保存；TMB应避光保存。试剂有效期6个月。 【适用仪器】 核酸扩增仪：ABI-Veriti(USA)；Ependorf Gradient(German)；MJPTC-100(USA)；AB9700(USA)等。
斑点杂交实验
斑点杂交实验 探针的标记： 取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。 点膜： 样品DNA：50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释） 变性：1N NaOH 30分钟 中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。 预杂交： 预杂交液 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml）
膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。 杂交： 杂交液的配制： 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA（变性）0.4ml（5mg/ml） 双蒸水补4ml 探针DNA（变性）20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗：62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉）0.5－1小时 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’
斑点杂交实验服务
斑点杂交实验服务 一、实验技术简介: 斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。【晶莱生物】 二、实验技术原理: 斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。 慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验， 蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、 核心期刊等服务。 三、实验操作流程： 1、DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 2、RNA斑点杂交 与上法类似、，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯0仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 3、完整细胞斑点杂交 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 四、实验注意事项： 客户提供： TotalRNA（DNA）≥20ug，浓度>1ug/ul，A260/A280>1.8；提供标记后的探针，需同时告知标记后探针的浓度及活性，待检测目的基因的Genbank 序列号。 交付标准： 1、图片
DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档
DNA斑点杂交系列(一)-实验方法 点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybr i-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 （1）DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5μl（2-10μg DNA）。 ④将膜烘干，密封保存备用。 （2）RNA斑点杂交： 与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA 溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。 （3）完整细胞斑点杂交： 应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使
细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。 DNA斑点杂交系列(二)-实验举例 一、实验原理 用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。 二、实验步骤 1. 处理： 将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作） 2. 变性： 【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。 将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。） 3. 点样： 【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。 将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。
分子生物学检验完整版
１病原生物基因组在医学上有何应用?详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染与病毒载量c病毒分析ｄ细菌耐药监测与分子流行病学调查 2什么就是原癌基因，原癌基因有什么特性,原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见得激活机制有哪些？ 原癌基因就是指人类或其她动物细胞（以及致癌病毒)固有得一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征得基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白,核调节蛋白，细胞周期调节蛋白,抑制凋亡蛋白激活机制:插入激活,基因重排，基因点突变,基因扩增,基因转录改变 ３试述Dｏwｎ综合征（21三体综合征)得主要临床特征及核型。 临床特征:生长发育障碍,智力低。呆滞面容,又称伸舌样痴呆.４0％患者有先天性心脏畸形.肌张力低,５０%患者有贯通手,男患者无生育能力，女患者少数有生育能力,遗传风险高。 核型：92、5%患者游离型：核型为47，XX（XY），+21 2、５%患者为嵌合型：46，XＸ（XY)／４7，XX（ＸY)，+2１ 5％患者为易位型:４６,ＸX(XＹ)，—１4，＋t（1４ｑ2１q) 4简述淋球菌感染得主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法得优势 1直接涂片染镜检:敏感度与特异性差,不能用于确诊。 2分离培养法:诊断NG感染得金标准，但就是其对标本与培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中得非特异性反应严重以及抗体法间得稳定性与条件限制，推广受限. 分子生物学得优点：敏感,特异,可直接从了临床标本中检出含量很低得病原菌,适应于快速检测 5、在单基因遗传病得分子生物学检验中,点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HＡ）2突变体富集ＰCR法3变性梯度凝胶电泳法４化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法９RＮＡ酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌得分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNＡ)得检测、基因分型与耐药基因分析等。 1PCR技术:选择高度特异性得天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCＲ—斑点杂交技术：正向杂交与反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DＮA指纹技术：ＲFＬPRAPＤ电泳核型分析 AP—PCR技术：定义方法简便,快速，特别适合临床应用 DNA序列分析:可测定rDNＡ序列也适用于基因突变引起得耐药 基因芯片技术:适用于病原体得耐药研究 7、ＦVＩII基因倒位导致血友病A，ＤMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P19７,P2０3,P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了) 答:F VIIＩ基因倒位就是导致得血友病A得主要原因（占50％）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病Ａ。 同理DＭD基因外显子缺失就是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生得主要原因(６0％-７0％）。珠蛋白合成障碍性贫血有六种,主要得两种就是α珠蛋白生成障碍性贫血与β珠蛋白生成障碍性贫血,基因突变就是主要发病原因。 8、基因多态性有哪些得临床应用？(P4）
斑点杂交法检测
斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨 作者：陆文英作者单位：江苏省盐城市慈航医院，江苏盐城224001 【摘要】目的：探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法平行检测76例临床标本和28种标准菌株。结果:46例肺结核患者痰标本抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性率分别为43.4%、50.0%、73.9%和56.5%；30例非结核患者痰标本、19种非结核分枝杆菌和9种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性，PCR法有3例阳性。结论:斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便，结果可靠，可用于结核病的快速诊断。 【关键词】结核分枝杆菌点杂交酸染色L-J培养 The Clinical V alue of Detection Mycobacterium Tuberculosis by Dot Blot Hybridization LU Wen-ying, et al (Cihang Hospital of Y ancheng City, Jiangsu Y ancheng 224001,China) Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis . Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It can be uesd to rapid diagnosis of TB. Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J culture 近年来结核病的发病率大幅提高，为早期、快速、准确诊断结核病，我们建立了斑点杂交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌，并应用于临床，同时与传统的涂片抗酸染色法、L-J 培养法、PCR法进行平行观察，以探讨其临床应用价值。 1 材料和方法 1.1 菌种来源: 19种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9种非分枝杆菌来自中国科学院微生物研究所。 1.2 标本来源：46例结核病人痰标本来自2004年至2006年盐城第一人民医院门诊病人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人，所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结核，30份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做4项检查，首先集菌涂片镜检，余下标本经3%NaAC-NaOH处理后分别用L-J培养法、PCR法、斑点杂交法进行检测。 1.3 试剂和仪器：斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成，其5＇端以地高辛标记，探针序列：5＇-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3＇。FQ-PCR试剂由深圳匹基公司提供，扩增仪为罗氏公司light cycle型。 1.4 方法
分子生物问答及答案
1 什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么? 答：概念见名解56. 所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展，从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。 功能：基因是编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位，最终可合成各种特异的多肽，具有不同的功能。从化学角度看，基因是具有特定功能和结构的连续脱氧核糖核苷酸序列，是构成染色体的重要组成部分，是构成DNA的功能单位。 2真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？ 答：不能，真核细胞基因序列中的内含子是插入在结构基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随DNA 转录参与形成前体mRNA，而后在转录后的加工修饰过程中通过两次转脂反应而剪切，在原核细胞中，由于其基因组序列不包括这类内含子，也缺乏相应的内含子的剪接功能和转录后加工系统。因此不能完成内含子基因序列的剪切过程，是一种无效转录。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的原核RNA聚合酶以及可识别的原核细胞的启动子, 才能催化RNA的合成。 3试述DNA分子的结构及其意义。 答： DNA一级结构：即DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。其中A,T,C,G 碱基分布不均匀，但脱氧核糖和磷酸均一样。意义：1、蕴藏着极为丰富的转换为蛋白质的遗传信息；2、一些特定序列以其大量信息决定着DNA的空间结构及基因间相互作用和调控功能。 DNA二级结构：为DNA双螺旋结构，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成，两条链之间靠碱基间的氢键结合，多为右手螺旋。意义：解释了DNA 复制时两条链可分别作为模板生成新的子代互补链，从而形成遗传信息稳定传递的半保留复制机制。 DNA三级结构，指双螺旋结构基础上的卷曲，包括线状双链中可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环及环状DNA中的扭结、超螺旋和连环等体拓扑学状态。意义：1、使DNA体积更小，2、DNA的线性序列带遗传信息，而紧绷的超螺旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。 三链DNA：双螺旋结构基础上形成的三链螺旋结构。意义：1、作为精确切割双螺旋DNA靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响DNA 与蛋白质结合及DNA复制转录等。 四链DNA：如端粒酶是真核细胞DNA 3’末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。 4 试述cDNA文库的构建及其意义？ 答：过程：1、cDNA克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总RNA，根据3’末端polyA尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的mRNA2、第一股cDNA 合成：以分离纯化的mRNA为模板，以Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板的3’→5’方向合成。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA，也可用随机引物法，以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长
基因扩增实验室可开展项目
基因扩增实验室可开展项目 乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)定性和定量检验 【正常参考值】 HBV-DNA定性(PCR法或斑点杂交试验):阴性；荧光定量PCR法:HBV-DNA＜103拷贝／ml 【临床意义】血液中HBV-DNA的存在是HBV感染最直接、最灵敏和最特异的诊断指标 丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)定性和定量检验 【正常参考值】 HCV-RNA定性(RT-PCR法):阴性；荧光定量PCR法:HCV-RNA＜103拷贝／ml 【临床意义】HCV-RNA阳性，有助于HCV感染的早期诊断:提示HCV复制活跃，传染性强。HCV-RNA和抗-HCV同时阳性，提示活动性感染；HCV-RNA阴转，提示复制受抑，预后较好；HCV-RNA阴性而抗-HCVIgG阳性提示既往感染。HCV-RNA检测有助于发现抗-HCV阴性期的急慢性肝炎，尤其对抗-HCV低滴度反应患者更有意义。 HCV-RNA定量检测，可连续观察HCV-RNA的动态变化，对判断病情及预后、监测干扰素等药物的疗效以及检测血制品的安全性有重要意义。 乳头瘤病毒(HPV)的DNA检测 【正常参考值】PCR法检测HPV-DNA定性试验:阴性。 【临床意义】生殖道标本HPV-DNA检测阳性可确诊为乳头瘤病毒感染，是目前最常用的主要检查手段 HPV基因分型 【临床意义】宫颈癌是人类所有癌症中唯一病因明确的癌症，即人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌发生的必要条件和主要病因，99.7%的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染，从HPV感染到宫颈癌的发生需要经过多年甚至数十年的时间，这为宫颈癌筛查指明了方向。因此早期定期进行HPV感染的筛查，对预警癌变倾向，及时发现、预防和早期诊断及临床治疗具有非常重要的意义。 相关检查项目：组织原位杂交，基因芯片技术，液基细胞学试验 EB病毒DNA定性 【正常参考值】PCR法检测EBV-DNA定性试验:阴性。 【临床意义】EB病毒属于疱疹病毒，可引起增殖性感染和非增殖性感染。特别是非增殖性感染，可导致细胞癌变。被认为与传染性单核细胞增多症。淋巴癌、鼻咽癌、何杰金氏癌、慢性疲劳综合症有关。 相关检查项目：EB病毒特异性抗体或异嗜性抗体凝集试验 沙眼衣原体(CT) DNA检测 【正常参考值】PCR法检测CT-DNA定性试验阴性。 【临床意义】沙眼衣原体阳性常见于非淋病性尿道炎、性病性淋巴肉芽肿、新生儿眼结膜炎等。泌尿生殖道标本CT-DNA检测阳性可确诊为沙眼衣原体感染，是目前最常用的主要检查手段。 解脲支原体(UU)的DNA检测
原位杂交技术
核酸分子杂交技术 分子杂交是利用某些分子与另外的一些分子特异结合而形成结合体的过程，狭义指核酸分子杂交即具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交,液相杂交,原位杂交。 1、固相杂交 固相杂交即先将待测单链核酸样品结合到支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交。 固相杂交的特点：固相杂交后，未杂交的游离片段易除去，从而使膜上留下的杂交分子较易检测，并可有效避免靶DNA自我复性。故固相杂交技术最为常用。 常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。 2、液相杂交 液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。液相杂交是研究最早的杂交类型，但应用的普遍程度较固相杂交为低。 液相杂交的特点：无需支持物。待测核酸分子不用固定在支持物上。其弊端是由于杂交后过量的未杂交探针存在于溶液中，在已有杂交结合物检测水平条件下检测误差较高。故液相杂交在过去较少应用。近年来由于杂交检测技术的不断进步，商业检测试剂盒的开发等液相杂交技术得到了迅速发展。 常用的液相杂交类型有：吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交、复性速率液相分子杂交等。 3、原位分子杂交 原位分子杂交实际上是固相杂交中的一种形式，杂交过程中待测DNA处于未经抽提的染色体之上，并在原位置上被变性成单链，与探针进行分子杂交。 原位分子杂交与其他杂交技术主要区别在于待测碱基序列位于染色体上。 其主要特点是可以准确定位目的DNA在染色体上的位置。因此在分子遗传学研究、癌基因定位、遗传性疾病临床诊断方面具有重要而广泛应用。 下面做下具体介绍： 1、菌落原位杂交 ●基本原理： 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 ●操作步骤： 1．DNA的变性2．变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定3．预杂交4．杂交5．洗膜6．结果显示 ●优缺点：用简单的滤纸即可完全将菌落转移。由于大菌落所包含的质粒拷贝数多于相应的小菌落,因此产生的 杂交信号较强,减少了曝光时间(室温）。此外,由于滤纸法省去了真空烤膜和预杂交操作,缩短了整个分析时间。虽然滤纸法具有上述优点,但它并不能完全代替硝酸纤维素膜杂交法。尤其是对高密度.菌落的杂交筛选。另外,滤纸的强度较差,操作过程中要仔细、小心。 2、斑点杂交 ●基本原理： 斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 ●主要步骤： （1）DAN斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每个样品一般点50μl（2～10μg DNA）。④将膜烘干，密封保存备用。