原位杂交步骤自己整理的精讲
荧光原位杂交
试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：
1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；
PBST：PBS加0.1%吐温-20；
LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：
准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；
50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；
25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；
HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2
HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.2
50%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；
MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）
MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；
10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
封闭缓冲液（blocking buffer）：10%羊血清、2%阻断剂（终浓度），两者溶于MABT；三者MABT:羊血清：10%阻断剂=7:1:2；也有用：1×PBT，2% sheep serum (vol/vol)，2 mg／ml BSA）
1×Blocking reagent：用马来酸缓冲液将10×Blocking reagent稀释1×Blocking reagent。此溶液需要随配随用，不可久放。
标准杂交缓冲液（standard hybridization）：5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)，0.02％SDS（w/v），1％Blocking reagent(取1/10体积的10×Blocking reagent)
标准杂交缓冲液（含甲酰胺）：50%去离子甲酰胺，5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)，0.02％SDS（w/v），2％Blocking reagent(取1/5体积的10×Blocking reagent)
蛋白酶K储液：10mg／ml；将蛋白酶K按10mg／ml溶于PBT中，分装成100ul的小包装，保存于－20℃。使用浓度为10ug／ml。（注：PBS不需要除酶，因为蛋白酶K可以降解RNase）
抗地高辛荧光素偶联的抗体（Anti-digoxigenin-fluorescein，Fab fragments）保存及使用方法：
1、激发最大波长（Excitation max）:494nm；发射最大波长（Emission
）：523nm
max
抗体冷冻干粉末，用1ml双蒸水进行溶解，其终浓度为200ug／ml，即200ng／ul。注意事项：此保存液应该在使用前不久进行稀释，（Note: The stock solution should be diluted shortly before use）；
2、以上保存液在2－8℃避光条件下，可以保存2个月。保存液应
避免反复冻融，分装后，保存于－20℃
3、推荐使用含0.5%BSA（w／v）的PBS（pH7.4）对以上抗体保存
液进行稀释；
4、此抗体可以用来对地高辛标记的复合物进行检测，注意事项：
在使用抗体之前，10000rpm离心5min，且在液面吸取需要的
体积。
探针的制备过程：
1、设计上下游引物，加酶切位点（HindⅢ、EcoRⅠ）和保护性碱
基（3个保护性碱基），用来扩增目的基因片段，回收目的基
因片段，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。
2、用限制性内切酶（HindⅢ、EcoRⅠ）对载体pSPT18（约1ug
的量）进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的片段，溶
于适量无菌水中。设计上下游引物，扩目的片段为700～800bp
长度的片度，回收连接T-载体，连接过夜，
3、将pSPT18酶切回收后的片段与相应酶切的基因片段，按摩尔
比例1:10左右进行混合，加入连接酶，16℃，连接过夜。4、将以上的重组载体进行转化，选择具有氨苄青霉素抗性的培养
基，37℃，培养13-15h，保存于4℃冰箱，再进行挑菌，接种
于含1‰氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min条
件下，摇菌过夜。
5、次日，用特异性引物做菌落PCR，确定插入目的基因片段重组
成功的克隆，保存菌种，其余进行测序验证。测序成功
6、选择测序验证成功的相应菌液，进行扩大培养，回收重组质粒。
7、对重组质粒分别进行单酶切（HindⅢ、EcoRⅠ），使其线性化，
并回收线性化的质粒DNA，以用于体外转录。（如何回收较好？
1、Puri?cation of linear DNA can be achieved
byphenol/chloroform extraction followed by ethanol
precipitation.2、）
8、选择插入片段5＇端酶切位点的酶(合成反义RNA)或3＇端酶切
点的酶(合成正义RNA)。对于本实验来说，用RNA聚合酶T7，
对HindⅢ酶切的模板DNA进行体外转录，以产生可以检测
CXCR7基因mRNA的反义RNA探针；用RNA聚合酶SP6，对EcoR
Ⅰ酶切的模板DNA进行体外转录，产生用于阴性对照的正义
RNA探针。反应体系为20ul,所加模板DNA为1ug左右，10× NTP
labeling mixture 2ul、10×Transcription buffer 2ul、
Protector RNase inhibitor 1ul、 RNA Polymerase SP6 or
RNA Polymerase T7 2ul，将以上各个成分轻轻混合后，简单
离心，在37℃下孵育2h(延长孵育时间并不能增加标记的RNA
的产量；按每1ug模板，可以产生10ug探针RNA)。
9、向上述反应体系中，加入RNase-free的2ul DNaseⅠ，37℃
保温15min,以消除模板DNA。
10、向上述反应液中，加入2ul 0.2M的EDTA (pH 8.0)以终止反
应，RNA转录子可以通过琼脂糖凝胶电泳EB染色来进行分析。
11、标记好的探针，不能用苯酚\氯仿进行抽提，这样会导致探针
分解。标记好的探针可以在－15-－25℃，稳定保存至少一年；
要避免反复冻融标记好的探针，可以对其进行小管分装，方便
使用。
12、需要的试剂：RNA Dilution Buffer:DMPC处理的RNase-free的双蒸水:20×SSC:
formaldehyde=5：3:2（需要配置新鲜的）；
大飞传给我的：
4）反应结束后加入30μLRNase free 水和30μL LiCl，离心混匀，-20℃1hr
5）14000rpm，4℃离心5min，加入1mL 70% 乙醇；
6）14000rpm，4℃离心15min，尽量弃上清；
7）室温晾置5-6min：
8）加入30μL DEPC H20，RNA sein 1μL，-80℃保存。
12、吸取少量标记好的探针，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测其质量。好的探针应该会出现一个或两个分离的条带，而不是拖尾，如是拖尾意味着探针有所降解了。
探针标记：
1、用地高辛标记的UTP在体外进行转录（载体pPST18），
以获得正义和反义RNA探针，将其溶入无RNase的去
离子水中。探针转录体系如下：
整体原位杂交步骤：
胚胎的准备、固定与保存
1、收集西伯利亚鲟的一定数量未受精卵和受精后各个发育时期的胚胎，用蛋白酶（浓度：）或手动医用镊子以去除其卵壳。
2、将未受精卵和各期胚胎加入10倍体积的4%多聚甲醛中，4℃过夜。
3、在PBS缓冲液中漂洗胚胎若干次，然后分别依次以不同比例(25%:75%、50%：50%、75%：25%)的甲醇∕PBS T，对胚胎进行梯度脱水，每次5min;再用100%甲醇洗一次，时间为5min，最后转至100%甲醇中，-20℃保存备用。
整体原位杂交步骤：
原位杂交第一天：
1、胚胎的复水
在室温下进行以下实验操作，分别依次以75% MeOH / 25% PBS T、50% MeOH / 50% PBST、25% MeOH / 75% PBST洗胚胎，以上三操作每次清洗时间为5min；最后用100%PBST漂洗4次，每次5min。
2、用蛋白酶K消化处理及再固定
室温下，以一定浓度（浓度:10μg/ml）蛋白酶K（用PBST稀释），处理各时期胚胎：最佳处理时间需根据胚胎发育时期而定（也有言24h以前的不用处理；而其他时期可以聊做参考其他鱼类的：如周励的鲫鱼小于5体节期可以不用处理、10体节期处理5min；24体节处理10min；对于斑马鱼：小于5体节期不用处理，10体节期处理1min、24h处理5min、48h处理15min；）。用PBST清洗胚胎5min，以洗去蛋白酶K，最后再用PBST洗胚胎5min，以洗去残留的蛋白酶K。然后在室温条件下，用4%多聚甲醛重新固定胚胎，时间为20min（？对于鲟鱼是否也要适当的延长固定的时间）；再用1×PBST清洗胚胎4（或者3或2次）次，每次5min，以除去残留的多聚甲醛，最后一次清洗将胚胎转移至新的1.5ml的eppendorf管中。（如果以斑马鱼的
胚胎大小为准，可以放置多达50颗胚胎。）
注：关于蛋白酶K的消化，时间太短会使探针不能进入，时间太长将会改变胚胎的形态结构。Proteinase K Prepare 10 mg /ml
stock solution in PBT and store at -20℃in100 ul aliquots. Final concentration for embryo permeabilization is 10 ug/ml；斑马鱼的胚胎各期消化时间可以参与在第七页[1]，
3、准备预杂交和杂交混合液
4、Hybridization mix (HM) ：，5×SSC，
0.1% Tween 20，50ug/ml of heparin，500 ug/ml of RNase-free
tRNA adjusted to pH6.0（6.3大飞）by adding citric acid (460 ul of 1M citricacid solution for 50 ml of HM)。
预杂交液HYB－：50%甲酰胺、5 x SSC（用20 x SSC母液稀释）、RNase-free水，0.1%吐温-20。用柠檬酸（citric acid）调节pH至6.0。5、
杂交液HYB+：
甲酰胺（Formamide）50% ；5 x SSC；肝素(Heparin)，50μg/ml ；
吐温-20（Tween-20），0.1%；tRNA，500μg /ml ；
用柠檬酸（citric acid）调节pH至6.0。
6、预杂交
除去PBST，每管取约5-10枚胚胎，向1.5ml的eppendorf管中加入700ul (适量体积)HYB－进行预杂交，在杂交炉中60-68℃保温5min；
然后，换用适量体积的HYB＋溶液，68℃预杂交4-6h（70℃，2-5h、其他如roche采取55-65℃或）在70℃条件下，水浴2-5小时。？？？作用？（注：这些预杂交后的胚胎可以在HM中，-20℃条件下保存数周）
7、杂交：
实验设计反义RNA、正义RNA
℃加热变性5min，马上置于冰上冷却，以消除探针的二级结构；弃去预杂交液HYB＋，加入新的700ul （其他体积也可以）的HYB＋溶液和适量的探针，使探针的浓度为1ng ／ul，65-68-70℃孵育过夜（12-16h）。(加入包含终浓度为0.5-1.0ng ∕μl（30-50ng这个是参考文献[1]）的地高辛标记的反义RNA探针的HM溶液200μl，70℃条件下杂交（有的文献72或80℃加热5min变性，冰上冷却，以此
消除探针的二级结构）（杂交炉中？），过夜（也有65℃,5h；60℃杂交炉中，16h）。
注：1
、不要使用过量的RNA探针，这会增加背景labeling；2、如此高的杂交温度和HM缓冲液中甲酰胺的比例，保证了探针杂交的严谨度（stringency）和减少了交叉杂交（cross-hybridization）的发生。杂交温度不要超过72℃，否则探针被
破坏。空白对照组不加入探针。孵育时，加入的HYB＋应首先预热到70℃，在之后再加入适量探针。
原位杂交第二天：
1、将含有探针的HYB＋溶液吸出，-20℃保存，并可多次重复使用
中，一般可使用十次左右，而能够重复使用的次数取决于探针
的质量，使用次数越多，得到的信号可能越弱；以下步骤在
65-68℃的杂交炉中进行，且注意溶液要预热。洗去多余的探针：
依次用50%甲酰胺／2×SSCT，30min／次，2次；2×SSCT，15min
／次，1次；0.2×SSCT，30min／次，2次（其实可以如下增加
75%、25%）。（或另一方法：将胚胎的溶液介质环境由HM逐渐
过渡到2×SSC，以除去残留在介质中的探针：由HM经过
75%HM、50%HM、25%HM、100%2×SSC，以上每一个步骤都
要在70℃水浴中进行并轻轻摇动，每次10min，而不同稀释度
的HM用2×SSC稀释，且以上用来洗脱残留探针的HM不包含
tRNA和肝素钠（heparin）。；在70℃条件下，用0.2×SSC漂洗
胚胎两次，每次30min，如此高严谨性的漂洗以防止探针非特
异性杂交；）
2、以下步骤在室温下进行，通过用一系列1×PBT稀释的0.2×SSC
漂洗胚胎，逐渐用PBT取代0.2×SSC，方法如下：在室温条件
下，用一定体积？的75% 0.2×SSC、50% 0.2×SSC、25%0.2
×SSC 和1×PBT，逐次漂洗胚胎各1次，15min／次，并置于
水平摇床上（horizontal shaker）以40 r.p.m轻摇。
封闭：
1、做此步骤的前提是不用做前面杂交的步骤2，即是用马来酸缓冲液MABT清洗胚胎3次，5min／次，
3、室温下，用适量封闭缓冲液（blocking buffer：10%羊血清、2%
阻断液，两者溶于MABT；三者MABT:羊血清：阻断剂=7:1:2；
也有用：1×PBT，2% sheep serum (vol/vol)，2 mg／ml BSA）温
育（incubate）胚胎1-3h，并置于摇床上轻微摇晃，此步骤在
于使抗体的非特异性结合位点饱和（saturates）。
4、（也即是：更换新鲜的封闭缓冲液，加入比例1:5000的抗地高
辛荧光素标记的抗体，）将胚胎置于含1/10000（多数文献是
1:5000）抗地高辛荧光素标记的抗体的封闭缓冲液中，4℃过夜，且置于以40 r.p.m.的水平摇床（振荡器？）上（horizontal shaker）轻轻摇晃。
原位杂交第三天：
1、弃去抗体溶液，并用PBT简要地（briefly）漂洗胚胎；然后室
温下，再用PBT漂洗胚胎6次，每次15min，每次漂洗的同时
将其置于horizontal orbital shaker以40 r.p.m.轻轻摇晃。（其他
漂洗方法：？），干燥？（其他漂洗方法重点参考：室温下洗去
多余的抗体：hybridization solution contains 50% formamide (Ultra Pure from USB, USA) in 2× SSC，罗氏202页资料：分别用
不同混合比例的杂交缓冲液（hybridization solution）／1×PBS
（3:1、1:1、1:3）清洗胚胎，每次20min，各1次，最后用1
×PBS清洗胚胎4次，15min／次）
2、室温下，用alkaline Tris buffer（配方见文献1，这个对于AP及
其底物显色才合适）在horizontal orbital shaker上以40 r.p.m.轻
轻摇晃，进行漂洗3次，每次5min。
3、这个步骤对于AP除去alkaline Tris buffer，用新鲜配制的0.7ml
染色液将其替代，并置于黑暗环境中（这个步骤是按照
AP-BCIP\NBT来进行的）。
检测观察拍照并记录：
1、是否还需要4%多聚甲醛固定？，原位杂交胚胎经梯度甘油
／PBST透明后（30%甘油／PBST、50%甘油／PBST、70%甘油／PBST、100%甘油／PBST），连同少量100%移到载玻片，观察拍照。拍照后可移回4%PFA？或甲醇中？保存
杂交漂洗缓冲液HyB-:
甲酰胺（Formamide）50% ；
5 x SSC；
吐温-20（Tween-20），0.1%；
用柠檬酸（citric acid）调节pH至6.0。
1、可选择做法：在加入胚胎之前，预热HyB–；
2、将包含RNA探针的HyB+吸出，保存于-20℃；在没有如何信号损失的情况下，该探针可以重复多次使用。
3、100% HyB–，70℃短暂地漂洗；
4、75% HyB–∕25% 2 x SSC T，70℃，15min；
5、50% HyB–∕50% 2 x SSCT，70℃，15min；
6、25% HyB–∕75% 2 x SSCT，70℃，15min；
7、2 x SSCT，70℃，15min；
8、0.2 x SSCT，70℃,30min，漂洗2次（如果第一天杂交使用的是50%甲酰胺，以下相同）；或0.05 x SSCT，70℃,30min，漂洗2次（如果第一天杂交使用的是65%甲酰胺）（注：对于）
9、75% 0.2 (or 0.05) x SSC/25% PBT ，室温，10 min；
10、50% 0.2 (or 0.05) x SSC/50% PBT ，室温，10 min；
11、25% 0.2 (or 0.05) x SSC/75% PBT ，室温，10 min；
12、PBT，室温，10 min；
13、加入杂交封闭液：PBT/2%羊血清/2mg/mlBSA（有的文献周励加入roche 的阻断剂于MABT中，前面步骤也有此方面的操作，待确定？？？），室温下，孵育若干小时（3小时）？
14、换上新鲜的杂交封闭液，加入荧光素（fluorescein）标记的抗地高辛的抗体反应液（1:200），4℃摇洗过夜。.
原位杂交第三天：
漂洗：
室温下，洗去多余的抗体，彻底地漂洗干净。
1、室温下，PBT快洗一次
2、室温下，PBT漂洗6次，每次15min
镜检：
甘油：PBS=3:1 PBSpH=7.4 也可以延长荧光时间，防淬灭（来自周励）
1、将若干盖玻片重叠累加用胶水粘在一起，分别两处固定于载玻片上，其中间留有一定的空隙，将甘油滴到空隙处的载玻片上，放置胚胎，再在其上放置大的盖玻片，可以通过轻轻移动它滚动胚胎的位置，
以此在不同的方向上对其进行观察。
所用试剂的配制方法：
3、PBST
以1‰体积的吐温-20溶于PBS中，混匀即可。
4% paraformaldehyde in PBS
10/23/00
1. For 100mL. Best to use glassware, stir bar（搅拌子）set aside for making paraformaldehyde only.
2. Put 50mL ddH2O in a glass beaker（烧杯）with a stir bar in the bottom. Put stirring on hot plate in the hood. Set hot plate to setting 3-4 (about 60 degrees, make sure the solution does NOT boil).
3. Measure out 4g of paraformaldehyde (Sigma, stored on the bottom left in the cold box). Measure IN THE HOOD (move the scale in there). Add the paraformaldehyde to the heater stirring water.
4. You need to raise（提高）the pH until the solution clears. I do this by adding a few drops (2-3) of 1N NaOH and watch the solution. Gabrielle does with 10uL of 10N NaOH and that is it. If the solution fails to clear, check the pH by pipetting a small amount of the solution onto a pH strip. If you are too high (>8) or too low (<7) keep pHing. You cannot pH on the pH meter as it will be ruined by the paraformaldehyde.
5. When dissolved, cool, then filter（过滤）the solution by pouring through a piece of filter paper inside a funnel. Pour into a graduated cylinder to check the volume.
6. Add 10mL of 10X PBS. Add ddH2O to 100mL.
7. Recheck the pH with paper. Adjust carefully with small amounts of dilute HCl if needed.
8. Aliquot to use.
10xPBS 这个配方与孙成飞实验室的一致：
80.0 g. NaCl (137 mM)
2.0 g. KCl (27 mM)
2.0 g. KH2PO4 (43 mM)
11.5 g. Na2HPO4 (14 mM)
4% Paraformaldehyde ：
Dissolve 4 g. of paraformaldehyde in 90 ml. of H2O
pH 10 to dissolve
Bring back down to pH 7
add 10 ml. 10x PBS (for a final concentration of 4 g. in 100 ml. of 1x PBS)
Filter sterilize through a .22 micron filter.
4% Paraformaldehyde (PAF) Fixative
Always prepare fresh
Prepare 100mls
4% Paraformaldehyde
1. Dissolve 4g of paraformaldehyde in 90 ml of 1xPBS
2. Heat gently to 58-60o C under a hood. Do not heat over 60o C (PAF dissociates > 60o C).
3. Add 10N NaOH to clear the solution (pH 10 dissolves the paraformaldehyde). Usually 5-10 drops.
4. Remove from heat and pH.
5. Carefully pH to pH 7.2-7.4.
6. Bring to final volume (100mls) with 1xPBS (for a final concentration of 4 g in 100ml of 1xPBS)
7. Filter sterilize through a .22 micron filter if necessary
8. Keep in 4o C refrigerator (no more than 1 wee k)
Paraformaldehyde (4%)
1. Place 80 ml of 0.1M PBS into a hood chemical beaker.
Do NOT use regular laboratory glassware for making
paraformaldehyde.
2. Place beaker on heat/stir plate in the fume hood and
begin stirring while heating (stir level approximately 5, heat
level approximately 8).
3. Measure out 4 grams of paraformaldehyde on a top
loading balance. Make sure you take the necessary
safety precautions, including wearing gloves, goggles, and
mask to prevent contact with the paraformaldehyde.
4. Place the 4 grams of paraformaldehyde in the stirring
0.1M PBS. Paraformaldehyde should dissolve upon
heating and stirring for a while. While the solution does
need to get hot, do NOT let paraformaldehyde solution
boil! It may be necessary to add a couple of drops of 1M
NaOH to the solution to allow it to become clear.
5. Once paraformeldehyde is in solution, allow it to cool to
room temperature.
6. pH the solution to approximately
7.4 using pH strips,
not the pH meter.
7. Bring the volume up to 100 ml with more 0.1M PBS.
8. Store paraformaldehyde solution in the fume hood.
Paraformaldehyde solution (4%) for RNA FISH
Paraformaldehyde(extra pure; Merck) 4 g
PBS (1X, pH 7.4) to 100 ml
NaOH (5 M) 200 μl
HCl to pH 7.4 Dissolve 4 g paraformaldehyde in 80 ml 1X PBS and 200 μl 5 M NaOH at 60°C with stirring.Adjust to pH 7.4 with HCl. Bring to a final volume of 100 ml with 1X PBS.
1. Thisse C, Thisse B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.
Nature protocols 2007,3:59-69.
DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤
原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放
射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位
原位杂交组织化学技术的基本方法
原位杂交组织化学技术的基本方法 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1 987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single st randed, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章）。早期应用的主要是DNA探
原位杂交介绍与步骤
原位杂交 组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。 （3）蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。 4. 杂交缓冲液孵育： 杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。 5. 防止污染： 由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。 6. 双链DNA探针和靶DNA的变性：
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。 2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀，冰浴30min。 4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。 3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。 5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
原位杂交技术步骤
1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design). 每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。另外。互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。 **注意关键： 1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。 2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套 3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5￠(反义核酸探针)或3￠(对感官探测)来插入。净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。 2| Run the PCR using the conditions tabulated below. 使用下面列出的条件运行PCR **暂停点：把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。 3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature. 加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。在室温下1000g离心15 - 20分钟。 **注意关键：膜应该是干的。如果没有再离心 4|Place the Microcon column into a new microfuge tube (provided in the kit), add 20ml of sterile water, vortex briefly and then turn the Microcon column upside down. Spin for 1 min at 1,000 g at room temperature to recover the DNA. 把小层析柱放在一个新的离心管(在这个工具包中提供),增加20毫升的无菌水、短暂离心,然后颠倒层析柱。自旋1分钟1000 g在室温下恢复了DNA **注意关键：离心的步骤应该快速。离心机1分钟只是为了避免样本太干。 5|Check the quality, quantity and size of the PCR amplification product by loading 1/20 of the preparation on a 1% (wt/vol) agarose gel in 1 TBE buffer. DNA should appear as a band and not as a smear. The 1/20 of the preparation should contain at least 40 ng of DNA. 通过装载1/20的稀释液在1*的TBE buffer缓冲液中的1% (wt/vol)的琼脂糖凝胶检查PCR的扩增产物的质量
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交；第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
原位杂交的方法
原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl： 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细
胞样本中不同RNA序列的多重检测。 原位杂交中探针的选择 DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。 就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。 Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization 原位杂交检测步骤 原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤 撰写人：范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 （一）组织冰冻切片 1. 实验准备 （1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。 （2）缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。
原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程
原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1 987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single st
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备 1、医用微波炉； 2、水浴锅； 3、OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测：
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。 原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA 杂交。 （一）探针的选择 根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA 或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。 在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，
荧光原位杂交技术原理及操作步骤
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1．原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。2．实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3．特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4．应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一、主要试剂 1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml 2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程 1 硅化玻片切片烤片60过夜 2 脱蜡入水斜置切片空干 3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35 4 0.2M HCl处理室温10接步骤3 5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3 6 切片入20梯度酒精脱水各2空干 7 切片入85变性液8 8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干 9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜 10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
EBER原位杂交过程
预先准备的试剂 胃酶浓缩液：将胃酶中加入 4 毫升的蒸馏水或去离子水，充分溶解后可根据使用量分装，冻存（-20 °C）。 胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的1NHCl 用蒸馏水或去离子水10 倍稀释，即成0.1NHCl 溶液 PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解后加入Tween205 滴，混匀后使用。 DAB工作液配制：在1毫升5A中加入50微升的5B，临用前配制，未用完的液体应弃去。也可按照上述比例，根据实际需要量配制。 胃酶消化工作液的配制 每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作液应弃去。 石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCI溶液100倍稀 释，例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的0.1NHCI溶液中，混匀后备用。 所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行，避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。 样品的收集和预处理 石蜡切片： 常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12 小时。石蜡包埋的温度不宜超过 65C。4-6微米的石蜡切片，56-60C烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用，也可放置于室温条件下保存（至少可保存3个月以上）。在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡（10分钟X 2）。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后，经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。 酶处理（避免RNA 酶污染，带手套操作） 将切片放置于37C中，每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水（70%、95%和100%），每个梯度放置 1 分钟。空气干燥后杂交。 杂交程序（避免RNA 酶污染，带手套操作） 杂交： 混匀探针溶液，在每张切片上加10-20微升适量的探针（试剂3），加盖盖玻片（注意防止气泡！）。湿盒中37C孵育2小时，杂交过夜效果更好。 冲洗： 将切片浸入PBS缓冲液中10分钟，直到盖玻片自然脱落，用PBS缓冲液冲洗切片2分钟X3次，取出切片，擦干多余的缓冲液。 检测和显色程序 切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（试剂4）, 37C孵育30 分钟，PBS冲洗1分钟X 3次（期间可摇动容器数次），用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟X 1次。 擦净切片边缘的水分，加入适量配制好的DAB 工作液。显色5-15分钟，注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟X3次后，即可进行封片或复染。 复染程序