基因克隆技术的发展
基因克隆技术的发展
摘要基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，为了纵览基因克隆的理论和技术的发展创新历程，对各种技术体系，正向遗传学途径、反向遗传学途径进行了综述。随着后基因组时代的到来，基因克隆技术将发挥更加重要的作用。
关键词功能性克隆同源序列技术表达克隆技术转座子标签基因芯片电子克隆
几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标[1-2]。如何利用基因这一重要的资源，关于基因专利权的建立和完善的基因争夺大战的硝烟也正在弥漫全球。克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业(制药业等)，改良农作物、畜禽品种等，还可以对遗传性疾病进行基因治疗，探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。克隆基因的途径有两种，正向遗传学和反向遗传学途径。前者是依据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的；后者则着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进行。基因的克隆一般采用下列技术：同源序列技术、差异表达基因分离技术、表达序列标签技术、转座子标签技术、基因芯片技术和电子克隆技术等。
1.功能性克隆
通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因[3]。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配
体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA3’端poly—A序列指导合成poly—T的3’端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA，将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。
2.同源性序列克隆技术
随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA文库进行PCR 扩增，再对PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。对于同源性很高的基因，可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物种的DNA文库。
同源性序列克隆技术自提出以来，受到了国内外学者的广泛重视，发展很迅速，但有些问题是值得重视和思考的：①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物的特异性要设计得当，必要时需要设计几套引物组合。②由于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。
③基因家族成员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对PCR扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基因。
3.表型克隆技术
细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生)，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点，以此为基础，才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。分离差异表达基因的3种基本方法为：差式筛选[4]、扣除杂交[5-7]、差异展示反转录[8]。差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样和无特异表达基因的参照样中提取mRNA，反转录为cDNA，并构建Ts的cDNA文库，分别将从TS和RS中提取
mRNA制成cDNA探针，分别用TS和RS的eDNA探针与TScDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交，选出只与Ts杂交，而不与RS杂交的克隆即为TS特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度很低。扣除杂交则是用TS提取的mRNA反转录成cDNA探针与Rs的过量mRNA或cDNA杂交，经两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的RS的mRNA或cDNA，将不形成杂交体的TS的eDNA纯化富集，扩增，建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库。但此法回收cDNA量有限，重复性差，灵敏度低。DDRT—PCR则是分别用Ts和RS的总mRNA 作模板，利用12个可能的锚定引物T11MN锚定mRNA的olyA末端，借助逆转录酶合成cDNA第一链，得mRNA／cDNA，再用相同的3’锚定引物和5’端随机引物分别扩增TS、RS的mRNA／cDNA，扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带DNA回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达基因。它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定低丰度差异表达的mRNA。分析2种以上样品基因的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。下面就这些方法的具体过程作详细介绍。
3.1 代表性差示分析法(RDA)
代表性差示分析法(RDA)可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因，具体过程如下：①制备扩增子。提取TS和RS的mRNA并反转录制备双链cDNA即test。er eDNA和driver cDNA。然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR扩增。②扣除杂交。去除接头后仅对tester片段加上新的接头，用过量的driver cDNA与之杂交退火，将形成三种产物：tester／tester、tester／driver、driver／driver。③特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接头引物进行PCR。3种产物中仅自身退火形成的tester／tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester／driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增，Driver／driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA分子，再进行PCR富集特异表达cDNA片段。④对特异片段进行克隆，通过FISH等技术进一步分离特异表达基因。
3.2 抑制性差减杂交PCR法(SSH)
SSH的基本流程如下：①第1次杂交。提取TS和RS的mRNA反转录为tester eDNA
和driver eDNA，用Rsa I或Hae m酶切成平头末端cDNA，分成均等2份，分别加不同的接头，再分别与过量的driver cDNA杂交，将形成4种产物：a，单链tester cDNA、b，自身退火的tester／tester双链、c，异源退火tester／driver双链、d，drivercDNA。
②第2次杂交。合并2份杂交产物，加入新的变性driver cDNA退火、杂交，这次除了
a、b、c、d 4种产物外还形成产物e，e是tester自身退火形成，但两端带不同接头。
③特异性片段的扩增。末端补平后，先后加接头的内、外侧引物扩增，a和d无扩增。b由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增，c仅一端有引物结合呈线性扩增，仅e
两端可配不同引物而呈指数扩增。④特异性片段e克隆，并进一步分离差异表达基因。该法通过2次杂交和2次PCR，使假阳性率可降到6％[9]，且灵敏度高。用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因，效率大增。
3.3 交互差减差异RNA显示(RSDD)
RSDD的主要过程如下：①交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A、B的mRNA，反转录为cDNA，并构建cDNA文库。将这2个文库进行交互差减得到A 减B和B减A的2个差减cDN A文库，由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主后，其上质粒载体被切下，得质粒cDNA文库。②差异显示。用3’锚定引物和5’随机引物对2个差减文库提取的DNA分别进行PCR扩增，将扩增产物用5％序列胶电泳，显示并分离差异条带，回收差异DNA，再次扩增后，获得富集的差异表达片段。③表达分析。采用反向Northern分析和Northern分析鉴定经再次扩增的差异DNA片段的真伪。反向Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜，分别与来自A、B细胞系的总mRNA经反转录制备的32 P标记的cDNA 第一条链探针进行杂交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。④对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差异表达的基因。
RSSD可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因，它结合了DDRT—PCR和扣除杂交的优点，减少或消除了共有序列，使序列胶上条带清晰度增加，并使低丰度序列得到富集，降低了假阳性率，且RSDD仅用较少的引物进行逆转录PCR就可分析全部差异表达基因，但RSSD并不能完全杜绝假阳性。Kang等用RSDD法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因(PEGene)和抑制肿瘤发展的
基因(PS Gene)。
4.图位克隆技术
随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位，在90年代初图位克隆技术也应运而生。其原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN文库(如YAC、BAC或Cos。mid文库)，构建出目的基因区域的物理图谱，再通过染色体步行(chromosome walking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosome landing)的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。
定位克隆理论上适用于一切基因。但也存在应用上的一些不足：如果要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低，因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上。
5.转座子标签法(transposon tagging)
转座子(Transposon)是从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米内发现的。随后的研究表明，在生物界内转座子是普遍存在的。并在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是：利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点。以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因，如果某基因的突变是基于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就可以从变异株的基因组中筛选出带有此转座子的部分基因，再以突变基因的部分序列作探针，即可以从野生型文库中克隆出完整的基因，在植物内利用转座子的有玉米的Ac／Ds。En／Spm和金鱼草的Tn3等，其中应用最多的是AciDs双因子系统。利用转座子标记技术目前已克隆y-0的植物抗病基因有玉米抗网斑病基因Hml、Hm2[10]。番茄抗叶霉病基因Cf-2、Cf-4a、Cf-5、Cf-9、Cf-9B及Cf-ECP2[11-15],烟草抗花叶病毒病基因N[16]，亚麻抗锈病基因L6、M等[17-18]。该技术是目前分离克隆抗病基因有效工具之一。随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后，目前已在拟南芥、番茄、水稻内有广泛的运用。同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标签技术
己经成为构建植物突变体库，进行基因功能研究的核心技术。
6.基因芯片技术(gene chips)
基因芯片义称DNA芯片、DNA微阵列(DNA ini—croarray)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫捕，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作m比较和检测，从而迅速得到所要的信息。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因义库作图以及杂交测序等方面。基因芯片根据功能可分为基因表达芯片(gene expression nlicroarrav)和DNA测序芯片(DNA sequencingchip)2类：按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片等；根据所用探针的类型可分为eDNA微阵列芯片和寡核苷酸阵列芯片。
基因芯片与传统的膜杂交相比有以下优点：①芯片点样密度远远高于膜的点样密度、样品用量少、信息量大。②芯片可用双色荧光标记两种探针，这样数据准确度大大提高；而膜通常用核素标记探针，一张膜只能杂交一种探针，数据可比性差：③芯片杂交体积小，灵敏度高；膜杂交体积大，灵敏度差。④芯片具有表面平攀性好、硬度大、透明等特点，比易卷曲的膜杂交更容易在点样、杂交、图像处理及数据采集等方面自动化。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点。
7.电子克隆(electronic cloning)
电子克隆，又称计算机杂交(computer hybridization)，是以数学算法为手段，以计算机和互联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标签(EST)、蛋白序列和生物信息数据库，发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守、同源性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸EST序列，以获得基因潜在的部分乃至全长的cDNA序列。
电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs序列人手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA义库等繁重、耗时
的实验室T作，将大大加快基因克隆的方法。与传统的实验室克隆基因的繁杂、耗时、费用高、效率不高的方法相比，电子克隆更为简捷、快速、费用大大降低。随着多种模式生物的基因组测序T作的完成，以及各种生物的EST数据库的建立和充实，电子克隆必将在基因克隆的领域占有重要的一席之地，也必将加快新基因的发现与克隆的进程。
基因克隆的技术发展很快，种类也越来越多，但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素。综合来看，不同的克隆策略，虽主导思路不同，但常常是相互联系相互补充的，有些过程也是共通的，因而实验者必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累，克隆基因的技术也逐步完善，速度效率也不断提高，相信人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术，并很快将基因的研究安全地应用到实践中去。
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南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景
浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景 肖婷2012333500202 浙江理工大学经管学院工商管理专业 指导老师：解纯刚浙江理工大学生科学院 【摘要】：随着生命科学时代的到来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，愈来愈引起社会各界的广泛关注。克隆技术作为人类的创造性活动，有其产生和存在的合理性，在诸多领域蕴藏巨大的应用潜力与巨大应用价值和广阔的发展前景。但克隆技术目前仍存在一些问题,如克隆技术对社会伦理和人类健康的影响。人类克隆技术的进步为人类带来的利益是巨大的,因而它的发展是难以阻止的。应对人类克隆技术带来的巨大挑战。 【关键词】：克隆技术；利弊；社会影响；应用前景 一、克隆是什么？ 克隆是英文Clone一词的音译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆的定义是指独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的物遗传质。 一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗。凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。 自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体。这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这些个体就叫做无性繁殖系。 二、克隆技术是什么？ 克隆技术是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.wendangku.net/doc/b612174562.html,
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。 载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。 特异基因的筛选 常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
克隆技术及其应用_陈大元
科技与社会 克隆技术及其应用 陈大元 (中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室 北京 100080) 摘要 “克隆”的含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,这个细胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。动物克隆,就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致,形态非常相像的动物。随着动物克隆研究的发展、克隆技术将广泛应用于医学、畜牧业和濒危动物保护等领域。 关键词 克隆,动物,胚胎细胞, 体细胞 “克隆”是“clone” 的音译,其含义是无性 繁殖,即由同一个祖先 细胞分裂繁殖而成的 纯细胞系,该细胞系中 每个细胞的基因彼此 是相同的。动物克隆, 就是指通过无性繁殖 由一个细胞产生一个 和亲代遗传性状一致、形态非常相像的动物。 科学家们很早就开始了动物克隆的研究。早在1938年,德国胚胎学家Sp emann即提出“奇异的实验”的设想。1952年,英国科学家Briggs和King 首次报道了蛙的核移植研究。1962年,英国剑桥大学的Gurdon获得了成年蛙。我国已故科学家童第周教授在20世纪60—70年代曾用囊胚细胞进行鱼类细胞核移植工作,获得属间和种间移核鱼,使我国鱼类核移植研究居世界领先水平。 早期的动物克隆研究仅限于两栖类和鱼类,直到20世纪80年代,核移植克隆技术才开始应用于哺乳动物。根据供核细胞的不同,可将动物克隆研究分为三个阶段: 1 胚胎细胞克隆阶段 1981年,Illmensee和Hop pe报道了他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为核供体,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中,重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫,获得克隆小鼠,这是第一次用胚胎细胞对哺乳类进行核移植获得成功。1983年,美国科学家利用核移植技术和细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986年,英国的Willadsen用绵羊的8—16细胞阶段的胚胎细胞作为供体进行核移植,首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,科学家们又相继克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。 2 同种体细胞克隆阶段 1997年2月,英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布,他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”[10]。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞,由此说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转, 2002年中 国 科 学 院 院 刊第3期 收稿日期:2002年4月25日 DOI:10.16418/j.issn.1000-3045.2002.03.005
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
克隆技术及其应用与发展
克隆技术及其应用与发展 目前克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展，基因概念及其理论的建立，打开了人类了解生命并控制生命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一，成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知，20世纪遗传学的发展举世瞩目，由于遗传学的发展，科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注，从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21世纪是生物技术革命的世纪，克隆技术的应用将促进遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究进展，有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高，对人类的生活将会产生深远的影响。 克隆、克隆技术 以及克隆的基本过程 “克隆”一词源于“Clone”的音译，指的是人工诱导动、植物的无性繁殖过程，这门生物技术就叫克隆技术。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，如：由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后再被植入动物子宫中使动物怀孕便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。 基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。 细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞。 个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞，也可能是一个组织。可以看出，基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作，以原有的基因或细胞或生物个体作为模板，复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料，或用胶片冲洗照片一样，从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎，只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料，然后将植入一个没有核子的卵子细胞内，通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的，多利羊的产生与三只母羊有关，其克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利，出生的“羊多”小绵羊与6岁母羊具有完全相同的外貌。 克隆技术在相关领域的应用 克隆的最终产物，如克隆牛、克隆鼠等都不是最重要的成果，基因克隆技术应是建立转基因动物模板的核心和关键性技术，利用转基因动物的体细胞大量复制出具有相同优良性状的个体。由于动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体，因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上。通常在动物育种中所采用的方法主要是杂交育种，即把两个具有不同优良性状的雌雄个体进行交配，然后在后代中去选择人们所需要的个体。要获得一个优良品种，往往需要几年甚至几十年的时间，而且必须不断地进行育种。如果采用动物个体克隆技术，就可以大量复制出人类所需要的优良个体，还可以大大缩短育种时间和节省大量的人力、物力。克隆技术的完善为转基因动物的繁殖开辟了一条通道，应用克隆技术可以将转基因绵羊
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾
基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾 一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传 （1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。 （2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR 反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR 体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。 （4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。
基因图位克隆的策略与途径拟南芥
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
基因克隆的四大要素(Four Elements for Gene Cloning)
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。 22楼 一、工具酶： 基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。 工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。 从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。 核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列 甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA 的切割，来限制外源性DNA 侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。 根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类： 第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量。 第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。
基因克隆的技术
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
第四节克隆技术的应用和难题
第四节克隆技术的应用和难题 一、克隆技术的应用领域 克隆技术已展示出广阔的应用前景和有价值的应用，概括起来大致有以下五个方面： （一）生产转基因动物 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 目前，克隆技术在英国又有了新的进展，他们把这一技术应用于人类造血事业。英国的PPL公司是克隆技术的经济后台，它的主管罗思詹姆斯博士说：“从研究“多莉”中我们知道，我们可以用一个细胞制造出一只转基因动物。我们现
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那
就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R 在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水，若模板为质粒灭菌水； ； 10乘Taq ； 引物F、R各； 模板1ul；若为质粒就够； 最后加入Taq酶，Taq酶现用现拿。 过程：我们用的是预变性94℃3min； 然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性94℃30s，退火退火温度下30s，延伸72℃时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb； 循环完成后，此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72℃延伸； 最后4℃保存待用。