分子生物学常用实验技术.pdf

分子生物学常用实验技术

第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定

第二章 DNA酶切及凝胶电泳

第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

第四章 RNA的提取和cDNA合成

第五章重组质粒的连接、转化及筛选

第六章基因组DNA的提取

第七章 RFLP和RAPD技术

第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

第九章分子杂交技术

第十章测序技术

第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定

第一节概述

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检

测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript （简称pBS）等。

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

第二节材料、设备及试剂

一、材料

含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

二、设备

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

三、试剂

1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。

2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。

3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。

4、溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。

5、3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。

8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml 的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。

10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA 的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

11、氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。

14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。

15、电泳所用试剂：（1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。（2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

第三节操作步骤

一、细菌的培养和收集

将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

二、质粒DNA少量快速提取

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

（一）、煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。

（二）、碱法

1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。

6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。

2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。

3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。

（三）、Wizard少量 DNA 纯化系统

Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。

该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。

1、 1-3ml过夜培养细胞液4℃下 12000g离心1-2分钟。

2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。

3、加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。

4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。

5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。

6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。

7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。

8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。

9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。

10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒。

11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。

[注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。

三、质粒DNA的大量提取和纯化

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

（一）、碱法

1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。

5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。

6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。

7、4℃下5000g离心15分钟。

8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。

9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。

12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。

2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。

3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃1小时),使DNA酶失活。

（二）、Wazard大量DNA纯化系统

碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。

该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA纯化树脂，125ml Wizard 柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。

1、100-500ml细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g离心10分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。

2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。

3、加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。

4、 14000g,22-25℃离心15分钟。

5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。

6、加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心15分钟。

7、弃上清,悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。

8、加10ml Wizard大量DNA纯化树脂溶液, 并涡旋混合。

9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。

10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液。

11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脱。

13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。

14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。

15、取出柱子，真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。

16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子

/离心管5分钟。

17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。

[注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。

2. 纯化树脂必须混匀后再用.

（三）、Sephrose 2B柱纯化质粒DNA

碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA 制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化。

1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。

3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。

4、以1ml流出液为1份进行收集。

5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。

6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。

7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。

9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。

[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。

思考题

1. 质粒的基本性质有哪些？

2. 质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？

3. 在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？

第二章 DNA酶切及凝胶电泳

第一节概述

一. DNA的限制性内切酶酶切分析

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

分子生物学作业

分子生物学作业 一、名词解释 1.断裂基因 真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区相互间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因成为断裂基因。 2.单核苷酸多态性 单核苷酸多态性是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA 序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。单核苷酸多态性被认为是一种能稳定遗传的早期突变。 一、简答题 1.简述真核生物基因组的结构与功能特点。 ①真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核 内，除配子细胞外，体细胞内基因组是双份的（即双倍体），有两份同源的基因组。 ②真核生物的基因转录产物为单顺反子。即一个结构基因经过转 录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链。 ③真核生物基因组存在重复序列，重复次数可达百万次以上。 ④真核生物基因组中不编码的区域多于编码的区域。 ⑤真核生物的大部分基因都含有内含子，因此，基因是不连续的

（断裂基因）。 ⑥真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，具有多复制起始 点，而每个复制子的长度较小。 2.试述双向凝胶电泳技术的基本原理。 双向凝胶电泳技术是指第一向的固相pH梯度等电聚焦电泳与第二向SDS-PAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。 其中等电聚焦指：在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的PH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，待正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的PI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上，这种不同的蛋白质分别聚焦在各自的PI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象就称为等电点聚焦。 SDS-PAGE是在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主

现代分子生物学_复习笔记完整版.doc

现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。

建立一个分子生物学实验室所需的仪器

分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：

二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达

分子生物学实验报告

分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具

有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂

现代分子生物学第六章作业

现代分子生物学第六章作业 09级一班芮世杭222009317011027 1，列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。 （1）基因表达序列分析技术（SAGE）是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息在转录组水平上，任何长度超过9—10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性核苷酸的转录产物，因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9—10个碱基的核苷酸序列并制成标签。将这些序列标签连接，克隆，测序后，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。 （2）原位杂交技术（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞，间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应。若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，课通过反射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 （3）基因芯片技术（FISH）对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 2，简述基因芯片技术对分子生物学研究的意义。 解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活，另可研究表达基因的生物学特性。 3，比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点？ （1）酵母双杂交技术称Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD 则推动了转录起始。 若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基因。 主要实验过程： a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b. 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体; c. 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。 d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。 e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

分子生物学实验课件..

实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加

热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA

现代分子生物学第四章作业【修订版】

现代分子生物学第四章作业（5-13题） 222009317011128 牛旭毅2011.10.15 5，比较原核与真核的核糖体组成？ 答：相同点：核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。 不同点：（1）原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。（2）大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1……S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1……L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。 6，什么是SD序列？其功能是什么？ 答：定义：因澳大利亚学者夏因(Shine)和达尔加诺(Dalgarno)两人发现该序列的功能而得名。信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核16S 核糖体RNA或真核18S rRNA 3′端富含嘧啶的7核苷酸序列互补的富含嘌呤的3～7个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与mRNA结合并形成正确的前起始复合体的一段序列。 功能：此序列富含A-G，恰与16SRNA3’端富含T-C的序列互补，因此mRNA 与核蛋白体sRNA容易配对结合。因此SD序列对mRNA的翻译起重要作用。 7，核糖体有哪些活性中心？ 答：核糖体有多个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA- tRNA部位（A 位）、结合或接受肽酰-tRNA的部位（P位）、肽基转移部位及形成肽键的部位（转肽酶中心），此外还应有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。 8，真核生物与原核生物在翻译起始过程中有什么区别？ 答：原核生物的起始tRNA是fMet-tRNA(fMet上角标），30s小亚基首先与mRNA 模板相结合，再与fMet-tRNA(fMet上角标）结合，最后与50s大亚基结合。 真核生物的起始tRNA是Met-tRNA(Met上角标），40s小亚基首先与Met-tRNA(Met上角标）相结合，再与模板mRNA结合，最后与60s大亚基结合生成起始复合物。真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNA （Met上角标）不甲酰化，mRNA分子5' 端的“帽子”参与形成翻译起始复合物。9，链霉素为什么能预制蛋白质合成？ 答：链霉素是一种碱性三糖，干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，并导致mRNA的错读。若以poly（U）作模板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会掺入。链霉素的作用位点在30S亚基上。

现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)

现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)

一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。

二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白

真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。

分子生物学作业(完整版)

分子生物学作业 第一次 1、Promoter：（启动子）一段位于结构基因5…端上游、能活化RNA聚合酶的DNA序列，是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系转录的特异性与效率。 2、Cis-acting element：（顺式作用元件）影响自身基因表达活性的非编码DNA序列，组成基因转录的调控区包括：启动子、增强子、沉默子等 一、简述基因转录的基本特征。（作业）P35 二、简述蛋白质生物合成的延长过程。P58 肽链的延伸由于核糖体沿mRNA5 ′端向3′端移动，开始了从N端向C端的多肽合成。 起始复合物，延伸AA-tRNA，延伸因子，GTP,Mg 2+，肽基转移酶 每加一个氨基酸完成一个循环，包括: 进位：后续AA-tRNA与核糖体A位点的结合 起始复合物形成以后，第二个AA-tRNA在EF-Tu作用下，结合到核糖体A位上。 通过延伸因子EF-Ts再生GTP,形成EF-Tu?GTP复合物，参与下一轮循环。 需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子。 转位：P位tRNA的AA转给A位的tRNA,生成肽键； 移位：tRNA和mRNA相对核糖体的移动； 核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子，二肽酰－tRNA2进入P位，去氨酰-tRNA 被挤入E位，空出A位给下一个氨酰-tRNA。移位需EF-G并消耗GTP。 三、真核细胞mRNA分子的加工过程有哪些？P40 1、5’端加帽 加帽指在mRNA前体刚转录出来或转录尚未完成时，mRNA前体5’端在鸟苷酸转移酶催化下加G,然后在甲基转移酶的作用下进行甲基化。 帽子的类型 0号帽子(cap1) 1号帽子(cap1) 2号帽子(cap2) 2、3’端的产生和多聚腺苷酸花 除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3?末端都有poly(A)序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40～200个A 。 大部分真核mRNA有poly(A)尾巴，1/3没有。 带有poly(A)的mRNA称为poly(A)+， 不带poly(A)的mRNA称为poly(A)－。 加尾信号： 3?末端转录终止位点上游15～30bp处的一段保守序列AAUAAA。 过程： ①内切酶切开mRNA3?端的特定部位； ②多聚A合成酶催化加poly(A)。 3、RNA的剪接

现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第三版)上

第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色

现代分子生物学作业

现代分子生物学与基因工程作业 姓名________________班级_____________学号________________ 1、绝大多数的真核生物染色体中均含有HI、H2A、H2B、H3和H4五种组蛋白，在不同物种之间它们的保守性表现在（） A．H3和H4具有较高的保守性，而H2A和H2B的保守性比较低 B. H2A和H2B具有较高的保守性，而H3和H4的保守性比较低 C. H1和H4具有较高的保守性，而H3和H2B的保守性比较低 D. H1和H3具有较高的保守性，而H4和H2B的保守性比较低 2、下列叙述哪个是正确的（） A. C值与生物体的形态学复杂性成正相关 B. C值与生物体的形态学复杂性成负相关 C. 每个门的最小C值与生物体的形态学复杂性是大致相关的 C值指一种生物单倍体基因组DNA的总量。不同物种的C值差异很大，随着生物体的进化 3、真核DNA存在于（） A. 线粒体与微粒体内 B. 线粒体与高尔基体内 C. 线粒体与细胞核内 D.细胞核与高尔基体内 E. 细胞核与溶酶体内 4、在核酸分子中核苷酸之间的连接方式是（） A. 2‵-3‵磷酸二酯键 B. 2‵-5‵磷酸二酯键 C. 3‵-5‵磷酸二酯键 D.糖苷键 5、所有生物基因组DNA复制的相同之处是（） A. 半保留复制 B. 全保留复制 C. 嵌合型复制 D. 偶联型复制 6、复制子是（） A. 细胞分离期间复制产物被分离之后的DNA片段 B. 复制的DNA片段和在此过程中所需的酶和蛋白 C. 任何自发复制的DNA序列（它与复制起始点相连） D. 复制起点和复制叉之间的DNA片段 7、在原核生物复制子中，下列哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核酸（） A.DNA聚合酶I B.DNA聚合酶II C.DNA聚合酶III D. 连接酶

分子生物学实验技术全攻略

分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取

实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物

分子生物学实验方法与步骤

表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制

分子生物学作业

《分子生物学》> 作业系统> 答题 第一次作业 题目：一、名词解释 1.广义分子生物学 2. 狭义分子生物学 3. 基因 4.断裂基因 5.外显子 6.内含子 7.C值与C值矛盾 8.半保留复制 9.转座子 10.超螺旋结构 参考答案： 1.广义的分子生物学概念包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白结构与功能和跨膜运输等。 2.狭义分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平阐明蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系及其基因表达调控机理的学科。 3.基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位。包括编码蛋白质和tRNA、rRNA的结构基因，以及具有调节控制作用的调控基因。基因可以通过复制、转录和决定翻译的蛋白质的生物合成，以及不同水平的调控机制，来实现对遗传性状发育的控制。基因还可以发生突变和重组，导致产生有利、中性、有害或致死的变异。 4.断裂基因：在真核生物基因组中，基因是不连续的，在基因的编码区域内部含有大量的不编码序列，从而隔断了对应于蛋白质的氨基酸序列。这一发现大大地改变了以往人们对基因结构的认识。这种不连续的基因又称断裂基因或割裂基因。 5.外显子：基因中编码的序列称为外显子。 6.内含子是在信使RNA被转录后的剪接加工中去除的区域。 7.C值与C值矛盾：C值指生物单倍体基因组中的DNA含量，以pg表示（1pg=10-12g）。C值矛盾（C value paradox）是指真核生物中DNA含量的反常现象。 8. 半保留复制：在DNA复制程程中，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种方式称为半保留复制。

现代分子生物学考研复习重点

现代分子生物学考研复习资料整理 第一章绪论 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构及其重要性、规律性和相互关系的科学 分子生物学的主要研究内容 1、DNA重组技术 2、基因表达调控研究 3、生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 5、DNA的复制转录和翻译 第二章染色体与DNA 半保留复制：DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样，因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA半保留复制 DNA半不连续复制：DNA双螺旋的两条链反向平行，复制时，前导链DNA的合成以5′-3′方向，随着亲本双链体的解开而连续进行复制；后随链在合成过程中，一段亲本DNA单链首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反的方向、按照5′-3′方向合成一系列的冈崎片段，然后再把它们连接成完整的后随链，这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制称为DNA 的半不连续复制 原核生物基因组结构特点：1、基因组很小，大多只有一条染色体2、结构简练3、存在转录单元，多顺反子4、有重叠基因 真核生物基因组的结构特点：1、真核基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组2、真核基因组存在大量的重复序列3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90％以上，该特点是真核生物与细菌和病毒之间最主要区别4、真核基因组的转录产物为单顺反子5、真核基因是断裂基因，有内含子结构6、真核基因组存在大量的顺式作用元件，包括启动子、增强子，沉默子等7、真核基因组中存在大量的DNA多态性8、真核基因组具有端粒结构 DNA转座（移位）是由可移位因子介导的遗传物质重排现象 DNA转座的遗传学效应：1、转座引入插入突变2、转座产生新的基因3、转座产生的染色体畸变4、转座引起生物进化 转座子分为插入序列和复合型转座子两大类 环状DNA复制方式：θ型、滚环型和D-环型 第三章生物信息的传递（上）从DNA到RNA 转录：指拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程 启动子：是一段位于结构基因5′段上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性 原核生物启动子结构：存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区，其是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力 终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列（促进转录终止的DNA序列） 终止子的类型：不依赖于ρ因子和依赖于ρ因子 增强子：能增强或促进转录起始的序列 增强子的特点：1、远距离效应2、无方向性3、顺式调节4、无物种和基因的特异性5、具