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土壤放线菌分离方法的初步研究

摘要：为了提高从土壤中分离放线菌的效率，解决土壤中的细菌对放线菌分离培养中的污染问题，研究了自然风干、重铬酸钾、青霉素和干热处理4种方法对细菌及放线菌的作用，并对其细菌和放线菌菌落数进行统计。结果表明: 土样放置6 d和21d适合放线菌的分离；用加50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素的培养基，可以选择性地从土壤中分离放线菌；土样在80℃下干热处理也可提高放线菌的分离效率。

关键词：土壤放线菌；分离；风干时间；重铬酸钾；青霉素；干热处理

Preliminary Studies on the Isolation Methods of Actinomycetes from Soil Abstract：In order to improve the efficiency of isolating actionmycetes from soil and solve the problem of contamination by bacteria when actionmycetes were isolated and cultivated, the effect of natural air-dry time, potassium dichromate(K2Cr2O7), penicillin and heat treatment of fabrics on bacteria and actionmycetes was studied in this article, and the number of bacteria and actinomycetes colonies separated f rom soil samples.The result showed tha:6 or 21 days of air-dry is optimal for actionmycetes separation from soil sample; The numder of actionmycetes can be selectively isolated by using a special medium contanting 50 mg/L potassium dichromate or 1 mg/L penicillin; Treating the soil samples with at 80℃ can also promote the efficiency of isolating actinomycetes. Keywords: soilactinomyeetes; isolation; air-drytime; potassiumdichromate(K2Cr2O7); penicillin;heat treatment of fabrics

引言

土壤放线菌是具有巨大应用价值的微生物类群。自Wakksman和Umezwa发现放线菌用途的多样性后，人们还发现放线菌可作为抗生索、维生素、酶和酶抑制剂的产生菌[1]。迄今为止，微生物产生的2万多种生物活性物质(如抗生素等)，有近60％～80％是放线菌产生的。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。从放线菌中筛选新抗生素已成为目前研究的重要课题之一。放线菌大量存在于土壤中,从土壤中分离、纯化、快速筛选目标放线菌是抗生素开发、应用的基础。对于刚采集的土壤样品,细菌和真菌的含量多而放线菌又长势缓慢,不利于放线菌的分离[2]。所以，应尽可能从土壤中分离出放线菌，排除其他微生物如细菌的干扰，创造有利于放线菌生长的条件[3]。为此，笔者就如何抑制土壤其它杂菌的污染

和如何选择抑制剂进行了初步研究，以寻求既能抑制细菌生长，同时又不影响放线菌生长的分离方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1土壤样品2010年7～9月采集于河南农业大学小花园10～20cm深层土[4]，混合，过筛。

1.1.2供试药品与试剂重铬酸钾、青霉素、可溶性淀粉、琼脂、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·4H2O。

1.1.3 仪器全自动蒸汽灭菌器(日本AL P ,CL-32L) ；电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司,DHG-9240A)；超净工作台(苏州净化设备有限公司, SW-CJ- 2FD)；智能生化培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂,SP-150)；托盘电子分析天平(岛津国际贸易有限公司,A Y-220) 。

1.1.4培养基（高氏一号合成培养基）

可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCL0.5g/L、10% FeSO4·4H2O溶液2滴、琼脂15~20g。用少量蒸馏水将淀粉溶解并加热至60~70℃使淀粉呈透明状，然后倒入煮沸的培养基中，调pH 至7.4～7.6[5]。

1.2方法采用稀释平板法:将土样制成10-2、10-3、10-4 、10-5 的土壤稀释液。分别取10-2、10-3、10-4 、10-5的土壤稀释液0.2 mL加入已做好的培养基平板上，用灭菌的涂布棒将稀释液均匀地涂布整个平板，放入28 ℃恒温培养箱中培养，每个浓度设2个重复，对照为不作任何处理的土壤样品[2]。

2 结果与分析

2.1 土样自然风干对放线菌计数的影响

土样一般都要放置一定时间，再做分离，这样可以减少耗费、提高放线菌检出的效率[2]。按照上述放线菌的分离与纯化的方法做土样放置第0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d的重复试验,统计出各时间段土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。

在高氏一号培养基上，采用稀释平板法分离土壤样品,观察各类微生物出现的情

况:10-2稀释度平板上分离到的菌株多,但生长密集或连成片的较多，挑菌有些困难；10-3稀释度的土壤稀释液放线菌分离效果好,平板上的菌落数适中，细菌生长密集；10-4稀释度的土壤稀释液细菌分离效果好,平板上的菌落数适中；10-5稀释液平板上很少甚至没有。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计，结果见表1。

表1 土样放置不同时间对微生物菌落数的影响

细菌（10-4）340 88 97 171 151 212 139 91 127 114 放线菌（10-3）32 23 53 75 56 60 57 54 31 27 从放置0d的新鲜土样到放置27d的土样统计结果来看，放置0d细菌菌落很多，平板菌落密度过高,相邻菌落相连甚至形成片状菌落,严重影响了放线菌菌种的挑取。放置6d的放线菌菌落较多,种类也较齐全，而细菌数量下降较快。土样放置21d ,培养皿内的细菌非常少,且放线菌种类下降不明显，非常适合放线菌分离。而放置27d的土样,细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。由此可见,土样放置6d和21d均适合放线菌的分离,但放置6d的放线菌的种类更多更全，而放置21d的放线菌单菌落更突出。

2.2 重铬酸钾对放线菌计数的影响

按照放线菌的分离与纯化的方法，在高氏一号培养基中加入25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L的重铬酸钾，统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计,结果见表2。

表2 重铬酸钾对微生物菌落数的影响

从土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数的统计结果来看，无论是任何含量的重铬酸钾,细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。在含25mg/L重铬酸钾的平板上放线菌菌落较多，但细菌菌落也很多,平板菌落密度过高,影响了放线菌菌种的挑

取；在含50 mg/L重铬酸钾的平板上，细菌菌落大幅度减少，放线菌菌落较多,种类也较齐全；在含75mg/L、100mg/L、125mg/L重铬酸钾的平板上，细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少甚至没有,所以不适合放线菌的分离。即抑制剂重铬酸钾为50 mg/L 时最适合放线菌的分离。

2.3 青霉素对放线菌计数的影响

同重铬酸钾对放线菌计数的影响，在高氏一号培养基中加入1mg/L、3mg/L、

5mg/L、7mg/L、9mg/L的青霉素（160万单位），统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。以10-4稀释度平板上的细菌作统计，10-3 稀释度平板上的放线菌作统计,结果见表3。

表3青霉素对微生物菌落数的影响

从表3可以看出，无论是任何含量的青霉素,细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。在含1 mg/L青霉素的平板上，细菌菌落大幅度减少，放线菌菌落较多,种类也较齐全；在含3mg/L、5mg/L、7mg/L、9mg/L的青霉素的平板上，细菌非常少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。即抑制剂青霉素为1 mg/L时最适合放线菌的分离。

2.4 土壤样品干热处理对放线菌计数的影响

分别将土样在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃等不同温度下干热处理1h，然后采用稀释平板法分离土壤样品，统计出土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数。因干热处理对微生物数量影响较大，所以以10-3稀释度平板上的细菌作统计，10-2稀释度平板上的放线菌作统计,，结果见表4

表4 干热处理对微生物菌落数的影响

从土样各稀释度平板上的细菌、放线菌菌落数的统计结果来看，干热处理使细菌、放线菌菌落数基本呈逐渐减少状。60℃、70℃时细菌菌落减少不明显，平板菌落密度过高,影响了放线菌菌种的挑取；80℃时细菌菌落大幅度减少，放线菌菌落较多,90℃、100℃、110℃、120℃、130℃时细菌大幅度减少,但是放线菌数量也大量减少，所以不适合放线菌的分离。即在80℃干热处理1h时最适合放线菌的分离。

3 小结与讨论

3.1 讨论

3.1.1进行适当的土壤预处理是分离放线菌的重要步骤。试验也表明，干热处理或自然风干使土壤含水量较低，细菌菌落少，而放线菌较耐干燥，利于放线菌的分离筛选。试验表明：土样放置6d和21d均适合放线菌的分离,但放置6d的放线菌的种类更多更全,而放置21d的放线菌单菌落更突出。而土样在80℃条件下干热处理1h时也可以较好的进行放线菌的分离[6-9]。

3.1.2在分离土壤放线菌时，应为放线菌生长提供适宜环境，并且抑制其他菌落生长，即向培养基中加入抗生素和其他抑菌剂。一般使用放线菌酮(50 mg/L)、海松素(50 mg/L)等抑制真菌。但抑制细菌较困难，因为放线菌对一些抗菌素的反应与细菌相近，抑制剂重铬酸钾、青霉素对土壤真菌、细菌都有明显抑制作用，且不影响放线菌的正常生长，因此重铬酸钾、青霉素可作为选择性分离放线菌的抑制剂[10~11]，试验表明，重铬酸钾的适宜浓度为50 mg/L，而青霉素的适宜浓度为1 mg/L。

3.2 小结

通过上述实验结果可知，将土壤样品自然风干6d或21d可选择性的分离出大量放线菌，同时克服细菌等微生物快速大量生长的缺点；在土壤样品中加入50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素可有效抑制细菌的生长，使细菌数大大减少，而不怎么影响放线菌的生长，从而可有效的分离出更多的放线菌；80℃恒温条件下干热预处理1h 也可使细菌数大为减少，从而可有效的分离出放线菌。因此，放线菌分离方法可以简化为：土样室温自然风干→碾碎过筛取→80℃恒温条件下干热预处理1h→称取1g 加9ml无菌水振荡→取lml清液，加入9ml无菌水→依次稀释至10-3、10-4、10-5→选取10-3、10-4、10-5各取0.2mL，分别加有抑制剂的培养基（50 mg/L的重铬酸钾或1 mg/L的青霉素）涂平板→28℃培养3~5天→挑菌。

参考文献：

[1] 徐成勇,袁野,黎丹辉.选择性分离放线菌[J].无锡轻工大学学报. 1999(02):

[2] 范丽霞,郑继平,杨先会.土样自然风干时间对放线菌分离的影响[J].海南医学院学报, 2010 (3)

[3] 杨宇容.徐丽华.放线菌分离方法的研究[J]. 微生物学通报.1995(2)

[4] 郑雅楠.杨宇等.土壤放线菌分离方法研究[J].安徽农业科学.2006(6)

[5] 安荣.慕小倩等.土壤放线菌分离中抑制剂的应用研究[J].西北农业学报.2002（1）

[6] 胥秀英.郑一敏.土壤放线菌分离方法的初步研究[J].生物学杂志.2000(2)

[7] 王勇.张文革等.长白山地区不同海拔环境拮抗放线菌的筛选[J].湖北农业科学.2009(2)

[8] 杨海英.杜刚等.抑制剂对土壤放线菌分离的影响[J].湖北农业科学2008(4)

[9] 史学群.宋海超.刘柱.海南省土壤拮抗放线菌分离方法初探[J].中国农学通报2006(10)

[10] 宗兆锋.郭小芳.诱捕分离土壤中的生防放线菌J].西北农林科技大学学报(自然科学版)2004(11)

[11] 司美茹.薛泉宏.放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究[J].微生物学通报2004(2)

产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究【开题报告】

开题报告生物科学产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义舟山地处长江口南侧，地理位置介于东经121°30′～123°25′，北纬29°32′～31°04′之间，地理环境优越，生物资源丰富。特别是舟山海域潮间带，所谓潮间带，即是指大潮期的最高潮位和大潮期的最低潮位间的海岸，也就是海水涨至最高时所淹没的地方开始至潮水退到最低时露出水面的范围。由于潮间带的特殊性质使得潮间带微生物环境中生长的放线菌就会具有非常独特的生理生化性质，可能在它们身上发现一些具有特殊作用的代谢产物。海洋微生物包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌等，是一个正在开发的重要生物资源。海洋环境独特，具有高压、高盐、低营养、低温的特点。在这种环境中海洋微生物种类约为陆生微生物的20倍以上，代谢途径不同于陆地微生物，因此，可以产生多种新的物质。目前各国已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物中分离到多种活性物质，这些活性物质可大致分为：1、抗生素：研究表明海洋微生物及其代谢产物是寻找新抗生素的重要来源。其中海洋放线菌始终是研究和开发的前沿。头孢菌素C、P、N，硫酸小诺霉素就是由海洋放线菌分泌产生并已得到临床应用的抗生素[1]。2、抗肿瘤活性物质：海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的抗肿瘤代谢产物，国内外已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物体内分离到多种抗肿瘤活性物质[2]。3、毒素：海洋生物毒素一直是海洋活性物质研究的焦点之一。目前发现，许多海洋生物毒素的真正来源是海洋中游离的或附生在海洋生物上的海洋微生物所产生。其中研究较多的是河豚毒素(TXX)。4、酶制剂：由海洋微生物生产的酶制剂，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。其中包括蛋白酶，淀粉酶，热稳定酶等等。淀粉酶(amylase) 是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它广泛存在于动植物和微生物中。淀粉酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶（EC3.2.1.1）从淀粉糖链内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键，广泛应用于燃料乙醇、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一. 随着社会需求的发展，淀粉酶不仅需要活力

薄层色谱自显影法分离检测海洋放线菌T-2-3中抑菌成分

薄层色谱自显影法分离检测海洋放线菌T-2-3中抑菌成分目的采用薄层色谱生物自显影方法对北极海洋放线菌T-2-3提取物的抑菌成分进行研究。方法采用大孔树脂对该放线菌活性成分进行富集，并针对活性成分进行薄层生物自显影检测。结果经检测，Rf 0.40的点为活性化合物。结论薄层色谱生物自显影法是一种快速分离检测抑菌成分的实验手段。 Abstract：ObjectiveTo investigate the antimicrobial components in extracts of Arctic Marine actinomycetes T-2-3 by TLC bioautography. MethodsThe active fraction was extracted by macroporous resin, and detected by TLC bioautography. ResultsThe compoud of Rf 0.40 behave antimicrobial activity. ConclusionTLC bioautography is a fast method to isolate and detect antimicrobial activity components. Key words：TLC bioautography; Marine actinomycetes; Antimicrobial activity 海洋微生物由于其特殊的生存環境，表现出特异的代谢方式，同时可以产生结构新颖且具有特殊生物活性的化合物，是海洋生物活性物质的重要来源[1]。目前为止，已知有22000多种微生物次级代谢产物中70%由放线菌产生，而10000多种抗生素由链霉菌属产生[2]。链霉菌属在放线菌中占有重要的地位，是生物活性物质的重要来源。薄层色谱生物自显影法（TLC-Bioautography）是近年来应用的一种集分离、生物活性和鉴定于一体的”化合物+生物活性”的测定方法[3-4]。本实验室前期从北极海底海泥沉积物中分离得到一株海洋放线菌T-2-3，经初步鉴定为链霉菌属。本实验利用TLC-生物自显影法对T-2-3的提取物中的抗菌活性成分进行检测，为进一步分离纯化活性成分提供了依据。 1资料与方法 1.1一般资料噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司；替加环素、氨苄西林购自美国Amresco公司。所用试剂均为市售分析纯。 1.2方法 1.2.1 T-2-3菌株粗提物样品制备将生长良好的T-2-3斜面培养物接种至种子培养基中，180 r/min摇床，28 ℃培养3 d；然后转接于发酵培养基中，180 r/min 摇床，28℃下持续发酵5 d，收取发酵液，并用D-101大孔树脂富集，依次用水，100%乙醇梯度洗脱，洗脱部位减压浓缩得浸膏，将乙醇梯度的浸膏用甲醇溶解，制备成20 mg/mL供试样品。 1.2.2供试菌及其培养供试细菌：①革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄八叠球菌；②革兰氏阴性菌：大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌；③临床耐药菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）3株、耐甲氧

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作

海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究

第39卷第5期海洋与湖沼 Vol.39, No.5 2008年 9月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Sep., 2008 * 浙江省自然科学基金资助项目，402038号。杨文鸽，博士，教授，E-mail ：yangwenge@https://www.wendangku.net/doc/cb13802789.html, 收稿日期: 2007-08-17, 收修改稿日期: 2007-10-25 海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究* 杨文鸽1 楼乔明2 徐大伦1 孙爱飞1 潘云娣3 (1. 应用海洋生物技术教育部重点实验室宁波大学生命科学与生物工程学院宁波 315211; 2. 中国海洋大学食品科学与工程学院青岛 266003; 3. 宁波出入境检验检疫局宁波 315012) 提要采用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rDNA 序列分析方法, 对从宁波海域滩涂泥样中筛选到的一株放线菌XS904进行分类鉴定, 同时对XS904菌株发酵液的抑菌活性和抑菌物质的理化性质进行了研究。结果表明, XS904菌株为链霉菌属灰浅红链霉菌(Streptomyces griseorubens )的变种; 经液体培养, XS904菌株发酵液对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌活性, 对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.78%; pH 纸色谱和捷克八溶剂系统纸层析结果显示发酵液中的抑菌活性物质为一类中等极性的碱性抗生素, 易溶于三氯甲烷, 对温度较敏感, 在酸性和中性条件下稳定。关键词海洋放线菌, XS904, 分类鉴定, 发酵液, 抑菌活性中图分类号 Q93 放线菌是抗生素等制药工业最重要的微生物资源之一。自Waksman(1943)从灰色链霉菌提取出链霉素以来, 在放线菌中已发现和分离到4000多种抗生素, 如链霉素、土霉素、卡那霉素、井冈霉素等已广泛应用于临床治疗和农业生产。当前开发研究陆栖放线菌已相当深入, 从陆栖放线菌发现新的活性物质的几率正逐渐下降, 因此从海洋微生物资源中寻找新型微生物药物成为研究的必然趋势(Adinarayana et al , 2007; Janos, 2005; Maskey et al , 2004)。据不完全统计, 自20世纪70年代东京微生物化学研究所从海洋放线菌Chainia sp.分离到抗生素SS-228Y 以来, 从海洋放线菌中发现结构新颖具有强生理活性的物质已达100多个, 其中90%以上产生于放线菌中的链霉菌属(林永成等, 2003)。源于链霉菌的新生理活性物质不断被发现, 新链霉菌的分离、鉴定和活性物质的筛选已成为微生物来源新药筛选工作的重要课题(Muramatsu et al , 2004; 徐平等, 2005)。本实验室从宁波海域滩涂泥样中筛选到一株海洋放线菌XS904, 经多次传代培养证实该菌株具有稳定的生理特性。本文作者在形态观察、生理生化特征试验以及16S rDNA 序列相似性比较的基础上对XS904菌株进行分类鉴定, 同时对该菌株发酵液的抑菌活性进行研究, 旨为海洋放线菌的开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株XS904 分离自宁波象山港海域滩涂海泥中。 1.1.2 供试菌青霉(Penicillium sp.), 根霉(Rhizopus sp.), 曲霉(Aspergillus niger ), 啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis ), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ), 枯草杆菌(Bacillus subtilis ), 大肠杆菌(Escherichia coli )。以上供试菌均由本院微生物实验室提供。 1.1.3 培养基 ① 改良高氏一号培养基：可溶性淀粉20g, KNO 3 1g, NaCl 0.5g, K 2HPO 4 0.5g, MgSO 4 0.5g, FeSO 4 0.01g, 琼脂15—20g, 海水晶30g, 蒸馏水1000ml, pH7.2—7.4, 121℃灭菌20min 。② 黄豆粉培养基：可溶性淀粉20g, 黄豆粉15g, 葡萄糖5g, 酵

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。 2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、 KNO 3、NaCI、K2HPO 4?3H 2O、MgSO 4?7H 2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO 4?3H 2O 、MgSO 4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（1h1）0或加入某种抑制剂（如加数滴 10% 酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备

海洋放线菌研究的新进展

海洋放线菌研究的新进展 3 刘妍　李志勇 33 (上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室,上海　200240) 摘　要:　海洋放线菌由于其独特的代谢途径和合成新颖抗生素的能力,已经广泛引起人们的关注。本文就海洋放线菌在海洋环境中的分布、医药领域的应用及其相关研究方法进行了综述。关键词:　海洋放线菌　分布　抗生素　研究方法 N ew R esearch Progress of Marine Actinomycetes 3 Liu Yan Li Zhiyong 33 (M arine B iotechnology L aboratory ,S chool of L i f e S cience and B iotechnolog y , S hanghai J iao Tong Universit y ,S hanghai 200240) Abstract :　Great attentions have been paid to marine actinomycetes for their particular metabolic pathway and the ability to synthesize new antibiotics.This review summarized new development on the distribution ,pharmaceuti 2cal application and research approach of marine actinomycetes. K ey words :　Marine actinomycetes Distribution Antibiotics Research approach 放线菌(acti nom ycetes )是一类高(G +C )%的革兰氏阳性细菌。自1875年Cohn 从人泪腺感染病灶中分离到一株链丝菌(st reptot hri x )以来,放线菌由于其拥有独特的合成多种结构复杂的次生代谢产物的能力引起了人们的广泛关注。许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途,已广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物。现在已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中,约有70%是由放线菌所合成的[1]。目前分离得到的绝大多数放线菌都来源于土壤,陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的三分之二以上。然而,随着病原微生物对抗生素抗性的日益提高,寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫。近20年来,从陆生放线菌中分离得到的先导化合物的数量锐减,于是人们把目光投向了更为广阔的生境———海洋[2]。海洋占地球面积的70%,海洋微生物无论从数量还是多样性方面来说都是巨大的。海洋放线菌的生活环境十分特殊,如:高盐度、高压、低营养、低温及与不同生物之间的关系等[3]。在这些所谓生命的极限环境中,海洋放线菌已发展出独特的代谢方式[4],这不仅确保其在极端环境中生存,也提供了产生新颖抗生素的潜力[5]。因此,海洋环境将成为放线菌和放线菌代谢产物的重要新来源。下面分别从海洋放线菌的分布、生物活性物质、研究方法等角度对于海洋放线菌的最新研究进展予以介绍。 1　海洋放线菌的分布虽然人们普遍认为海洋放线菌的祖先来源于陆地,但越来越多研究表明:深海中有许多罕见的放线菌,这些放线菌与陆生样品中典型的放线菌有很大的不同[2,6,7]。海洋放线菌主要包括链霉菌属(S t reptom yce 2tes )、小单孢菌属(M icromonos pora )以及红球菌(R hodococcus )、诺卡氏菌(N ocar di a )、游动放线菌(A cti nopl anetes )等稀有属种[8]。海洋放线菌主要收稿日期:2005206221 　3基金项目:国家高新技术发展计划(863)资助(2002AA628080,2004AA628060)及上海市青年科技启明星计划资助(04QMX1411)和上海高校优秀青年教师后备人才计划资助作者简介:刘妍(19812),女,硕士研究生。研究方向:海洋微生物33通讯作者:李志勇,Tel :021*********,E 2Mail :zyli @https://www.wendangku.net/doc/cb13802789.html, 　生物技术通报 ?综述与专论? B IOTEC HNOLOGY BULL ETI N 2005年第6期

微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告学院：生命科学学院班级： 2013级生科2班组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079

郑国梁 2013506083 2015年10月15日一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。二、实验原理土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特

殊培养基的方法，来获得放线菌。

放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4

海洋放线菌_药物开发的新兴资源_蔡超靖

海洋放线菌—药物开发的新兴资源蔡超靖，丁彦博，单越琦，穆云龙（华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心, 石家庄 050015）摘要：近些年，海洋放线菌成为新药研发的重要来源，引起人们的关注，本文综述了海洋放线菌在分离方面取得的成绩，并介绍了通过传统筛选方法分离得到的生物活性代谢物，以及在与新化合物相关的基因挖掘和生物合成基因簇的异源表达方面取得的进展。关键词：海洋放线菌；活性代谢产物；基因组学；异源表达中图分类号：R978.1 文献标识码：A 文章编号：1001-8751(2012)01-0022-08 Marine Actinomycetes －an Emerging Resource for the Drug Discovery Cai Chao-Jing ， Ding Yan-Bo ， Shan Yue-Qi ， Mu Yun-Long （New Drug Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering & Research Center, Hebei Industrial Microbial Metabolic Engineering Research Center, Shijiazhuang 050015） Abstract: As an important resource of the new drugs, more and more attentions were paid on marine actinomycetes recently. This review highlights achievements in the isolation of marine actinomycetes, some examples of bioactive metabolites identi ?ed by traditional screening, and presents new progress in the ?eld of genome mining leading to the discovery of novel compounds and heterologous expression of biosynthetic gene clusters. Key words ：marine actinomycetes ； bioactive secondary metabolites ； genomics ；heterologous expression 收稿日期：2011-11-15 作者简介：蔡超靖，工程师，研究方向：微生物来源的新药筛选。放线菌是革兰阳性细菌，能产多种活性化合物，从20世纪50年代，人们开始研究和筛选陆生放线菌，得到许多重要的抗菌药物（两性霉素B ，红霉素，万古霉素），抗癌药物（柔红霉素，博莱霉素，丝裂霉素）和免疫抑制剂（雷帕霉素）。但近几年由于分离和筛选方法的限制，导致发现的化合物重复性高，人们转而开始研究极端生境微生物[1]，以期发现新属种与新化合物。目前已经从海洋放线菌中分离到了许多结构新颖并具有多种生物活性的化合物，因此开发海洋放线菌资源，寻找新型活性先导化合物成为当前的研究热点[2]。1 海洋放线菌及其分离技术海洋放线菌的分离早在1969年[3]就开始，但由于与陆生放线菌的分离方法没有太大区别，因此未得到新的属种。随着采样和分离、培养方法的改进，许多海洋固有放线菌实现分离培养，海洋环境成为新的放线菌和新天然产物的来源。Fenica 和Jensen [4]从热带太平洋海域发现了包括嗜盐产孢菌属Salinispora (MAR1类群)和海孢菌属Marinispora (MAR2类群)在内的至少13个海洋放线菌

海洋放线菌代谢产物蒽环类化合物研究进展

药物生物技术 Pharmaceutical Biotechnology2011，18（6）：559 562 海洋放线菌代谢产物蒽环类化合物研究进展马毅敏，陆园园，邢莹莹，奚涛* （中国药科大学生命科学与技术学院，江苏、南京210009）摘要海洋放线菌代谢产物是抗肿瘤活性物质的重要来源。近年来，从海洋放线菌中分离到很多新化合物，其中许多结构新颖的蒽环类代谢产物具有良好的抗菌抗肿瘤活性。文章对近年来从海洋放线菌中分离得到的蒽环类代谢产物进行了归纳，并展望今后海洋天然产物的发展方向。关键词海洋放线菌；蒽环类化合物；抗生素；抗肿瘤活性中图分类号Q514．3文献标志码A文章编号1005-8915（2011）06-0559-04 海洋放线菌作为海洋微生物中一个重要的类别，被认为是生物活性代谢产物的重要的来源。据报道大约有23000个具有生物活性的次级代谢产物由微生物产生，其中超过10000个化合物由放线菌产生，即所有微生物来源的活性代谢产物，45%来自于放线菌。根据不完全统计，在21世纪分离自海洋放线菌的新型化合物的数量是上个世纪的两倍还要多。跟陆生放线菌一样，海洋放线菌也将成为医药产业的另一个重要的微生物来源。微生物代谢产物是最重要的肿瘤化学治疗药物［1］，它们最早出现在1940年，海洋放线菌中，大部分的化合物由链霉菌属产生，其中许多次级代谢产物都是有效的抗生素。备受关注的抗生素有：放线菌素D，多柔比星、柔红霉素、丝裂霉素、博莱霉素和平阳霉素、烯二炔类抗生素力达霉素等。其中多柔比星，柔红霉素等蒽环类抗生素是最有效的抗肿瘤化合物，比其他的化学治疗药物能够更有效的治疗各种癌症［2］。它们被用于治疗多种癌症，包括白血病，淋巴瘤，乳腺癌，子宫癌，卵巢癌以及肺癌［3］。 1海洋放线菌来源的蒽环类化合物蒽环类化合物都拥有醌类的骨架，由芳香环状结构组成的刚性平面再通过一个氧-糖苷键连接一个氨基糖［4］。蒽环类化合物是通过插入DNA双链，形成复合物来抑制DNA或者RNA的形成。它们也能通过拓扑异构酶Ⅱ触发DNA的降解，最终引起细胞凋亡。它们的不良反应是呕吐和具有心脏毒性，心脏毒性会部分限制这类化合物的效用。第一个被成功发现的蒽环类抗生素是1966年的柔红霉素，由海洋放线菌Streptomyces peucetius中分离得到。阿霉素在1967年被发现。在柔红霉素和阿霉素之后，一系列半合成的化合物（如伊达比星和表柔比星）诞生了并且进入了临床应用。表柔比星在1999年通过FDA认证，在化学治疗过程中要优选于多柔比星，因为它表现出更少的副作用。表柔比星的糖的4位碳上有一个独特的空间取向，这可能决定了它快速的功效及较少的毒性。表柔比星最早用于乳腺癌，卵巢癌，胃癌，肺癌和淋巴癌。戊柔比星是多柔比星的半合成类似物，在1999年作为化学治疗药物，用于治疗膀胱癌。近年来许多蒽环类化合物及蒽醌类物质展现出很好的生物学活性，如抗真菌活性，抗病毒活性，抗肿瘤活性以及抑制蛋白质合成的活性。很多新型的蒽环类抗生素及醌类物质成功的从海洋放线菌中分离出来，见表1。 Lomaiviticins A和Lomaiviticins B分离自一株嗜盐放线菌（LL371366）［5］。这两个化合物都被证明具有较强的DNA损伤活性，而且Lomaiviticins A能够裂解双链DNA，对许多肿瘤细胞株具有细胞毒活性。这两个化合物对金黄色葡萄球菌和屎肠球菌表现出了有效的抗菌活性。 Komodoquinone A及Komodoquinone B分离自链霉菌Streptomyces sp.KS3，其中Komodoquinone B是Komodoqui-none A的苷元［6］。Komodoquinone A是一个特有的蒽环类抗生素，其结构中有一个未知的氨基糖连接在4位碳上，而不是连在我们普遍知道的蒽环类抗生素的7位碳上［7］。研究发现Komodoquinone A在浓度为1μg/mL时，能够诱导成神经瘤细胞（Neuro-2a）分化。以Komodoquinone A治疗癌症时，能在G1期就阻止Neuro-2a细胞分裂，这些数据表明连在4位碳上的氨基糖对于Komodoquinone A在神经细胞中的作用十分重要［8］。 955 收稿日期：2011-03-28修回日期：2011-05-06 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（No．81001395）。作者简介：马毅敏（1985-），女，汉，江苏南通人，硕士研究生，主要从事海洋放线菌代谢产物研究。E-mail：zdj123727@https://www.wendangku.net/doc/cb13802789.html,。*通讯作者：奚涛，男，中国药科大学，教授，博士生导师。Email：xi_tao18@https://www.wendangku.net/doc/cb13802789.html,。

放线菌资料

放线菌资料的总结放线菌资料的总结放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其形态如下图所示。下图：链霉菌的一般形态和构造（模式图）正文：放线菌是怎么生长的，需要什么条件，我指的不是培养基，而是在植物体内。植物内生放线菌在植物的韧皮部、木质部和韧皮部之间的缝隙有生长，分离植物的内生菌通常在这两个部位可以分离到。主要是靠植物组织提供营养，有很多内生菌能够分解纤维素作为炭源，无机盐和氮源可以由植物组织中的无机盐和含氮物质获得，他们在植物中生长很缓慢。通常来说，植物或者植物的组织器官的生长时间越长内生菌的种类和数量越多，你如果要分离可以选择树龄在百年以上的树。植物器官粉末中会有放线菌存在吗？干燥的，经辐射灭菌后的粉末会把放线菌杀死吗？适宜的条件还会长出菌吗？辐射灭菌和50-60度的干燥都不能杀死所有的放线菌。另外植物当中不只有放线菌，植物的内生菌大多数是真菌，有的内生真菌产生孢子能够抵御不良环境，生存能力很强。如果你是做植物组织化学可以采用高温处理，杀死植物当中的微生物，再分析植物组织的成分。如果你要的成分不能高温处理，可以用容易挥发的消毒剂处理植物样品，杀死微生物然后，在无菌环境下使消毒剂挥发。建议你采用75%乙醇。如何分离内生菌？

目前内生菌的分离主要还是表面消毒，建议你最好不要把植物组织研磨成粉末。可以将组织用75%乙醇表面消毒，在无菌室中的超净台中将植物组织吹干，用消毒的手术刀，把植物组织切割成0.5*1cm的小块。直接把组织块接入培养基，同时将组织小块在空培养基中滚动，然后取出，作为对照平板。如果对照平板有菌长出，说明消毒不彻底，如果对照平板无菌生长，说明消毒彻底。（将菌回接以后菌能够在植物中生长，不能准确说明该菌就一定是内生菌。只是有一些人的推测，并不具有权威性。而且对于大多数植物回接不实际。）请问在用金标法检测霍乱弧菌的时候，怎么样才能确定细菌的浓度已经达到最低检测限1000000/ml？ 1.梯度稀释，平板培养，计算单菌落数 2.分光光度计测定光密度，制定标准曲线；测定某一光密度下的菌体浓度 3.比浊荧光染色技术最准确稀释---甲醛固定（可放置起来，以后一起分析）---过滤到核孔滤膜0.22---丫叮橙染色--荧光显微镜检测计数--或者数码相机照相---相关软件分析，可快速大量计数缺点是所有细菌--不分死活另外还有一种专门检测活菌数的荧光计数我手头上的一株放线菌因暂不应用而予以保存（砂土管、液体石蜡），历时半年，现给以复活，所得菌落皆呈衰败样。试问各位高人，如何补救？关键不知道你的放线菌是不是真的退化了，放线菌的退化表现主要有：在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；还有菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降。如果是真的退化了，可以对其进行复壮。具体的菌种的复壮措施如下：纯种分离采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。复壮好的菌株可以继续保存。还有一种可能会不会是培养基和培养条件的问题，如果培养基中缺少某中元素，

放线菌

土壤中放线菌的提取与分离环境科学与工程学院环工13实验班杨健3130206323 【摘要】:放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。放线菌[1] 是一群革兰氏阳性、含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。从土壤中提取放线菌主要用高氏一号培养基进行培养。【关键词】：原核微生物，高氏一号，革兰氏阳性，孢子等。【Abstrat】：Actinomycetes is a kind of main assumes the hypha growth and to spore reproductive land was more powerful prokaryotes. Named after the deep in radiating growth on solid medium. Most have developed branch hyphae. Hyphae slender, width to rod-shaped bacteria, about 0.5 ~ 1 micron. Can be divided into: vegetative hyphae, also known as the substrate mycelium, main function is to absorb nutrients, some can produce different colors, is important basis of species identification; Aerial hyphae, fold, was born in the vegetative hyphae, also known as secondary hyphae. Actinomycetes [1] is a group of gram positive bacteria, content (> 55%). Actinomycetes by colony is put a line of its name. It is a prokaryotic organisms, is widely distributed in nature, mainly by spore reproduction, followed by rupture of reproduction. As the common bacteria, and more for saprophytic, a few stray. Extracted from the soil actinomycetes mainly use high's number one medium for culture. 【Key words】: procaryote microbiology, coates, number one gram positive, spores, etc. 引言放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。本次实验所取的放线菌都来自于土壤,用高氏一号培养基进行对土壤放线菌的分离和培养。一、高氏一号合成培养基的制备

实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。实验6土壤中放线菌的分离（实训）实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。 2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤： 1.高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。 2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的

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