腹膜透析相关性腹膜炎病原菌的精准诊断

Accurate diagnosis of pathogen of peritoneal dialysis associated

peritonitis

Abstract

Objective:1.To observe the pathogenic distribution of bacteria in Peritoneal dialysis-associated peritonitis(PDAP).2.Exploring the application of Droplet Digital PCR,ddPCR)to detect and identify pathogenic bacteria in PDAP.

Methods:The article included two parts.Part one:Retrospectively analyzed distribution of pathogenic bacteria in318peritonitis from January2009to September 2016in PD center.Part two:1.Primary bacteria which are epidermis staphylococcus aureus,staphylococcus aureus,escherichia coli,and enterococcus faecalis were found out according to pathogenic bacteria distribution of318PDAP in eight years in PD center.2.Four specific primers and probes were designed according to references. Target fragments were amplified and verified by PCR after extracted DNA of standard strains.3.PD fluids specimens were collected in duplicate in30PDAP patients,one for traditional bacterial culture,another for subsequent ddPCR detection and kept in -80°C refrigerator.The DNA extract of standard strains and sterile double distilled water(ddH2O)were positive control and negative control respectively. Results:Part one:185cases were positive cultured in318PDAP(58.1%),a total of 194strains of pathogenic bacteria were identified,included131Gram-positive strains （67.5%）,49Gram-negative strains(25.2%)and14fungi(7.2%).Among Gram-positive strains,staphylococcus epidermidis,staphylococcus aureus and enterococcus faecalis were leading pathogens,25.9%,10.6%and8.4% respectively.Escherichia coli was major pathogens(40.8%)in gram-negative strains. Part two:(1).Bacterial culture results:the positive rate of30PDAP specimens culture was43.3%(13/30).3cases of staphylococcus aureus,2cases by staphylococcus epidermidis and1case of e.coli,2cases of staphylococcus hemolysis in,1case of walter type staphylococcus aureus,1case of verdigris false single spore fungus,1 case of nearly smooth candida,1case of e.sakazakii,1case of microbe were

identified in13positive cultured specimens.(2).digital PCR results:the detection results of specific probe primers in4kinds of bacteria were same as traditional culture. One case of staphylococcus aureus and enterococcus faecalis were identified in culture negative specimens by digital PCR.(3).The time for traditional bacterial culture is82.57±14.13hours,the detection time of digital PCR is about6.5hours. Conclusion: 1.The main pathogenic bacteria are staphylococcus epidermidis, staphylococcus aureus and enterococcus faecalis in Gram-positive bacteria and escherichia coli in gram-negative strains.2.Digital PCR method is a timeliness, sensitivity and specificitymethod compared to traditional culture.

Key Words:peritoneal dialysis associated peritonitis;pathogenic bacteria;digital PCR;bacterial culture

前言

腹膜透析是慢性肾功能衰竭尿毒症期替代治疗的重要手段，近些年终末期肾脏病的发病率越来越高，腹膜透析也得到了广泛的应用。但是腹膜透析相关性腹膜炎是导致腹透治疗失败的重要原因和主要并发症，严重影响着腹膜透析的治疗效果,制约着腹膜透析技术的发展[1-3]。尽管近年来随着操作技术的改进和连接系统的提升，其腹膜炎发生率已较前明显下降，但仍然是PD的主要并发症，是导致PDF透析失败及威胁PD患者生命的主要问题。为了提高PDAP的治愈率，

尽早明确病原菌显得非常重要。

腹膜透析相关性腹膜炎是患者透析操作不慎引起腹透液污染或肠道微生物发生移位而导致的腹膜腔感染。发生腹膜炎的原因主要为换液时接触污染、肠源性感染、隧道和出入口感染。国内外多数文献报道如杨念生、郑旋、王静[4-6]等发现病原菌主要以表皮葡萄球菌为主等，金黄色葡萄球菌次之。王增四、王亿平[7-8]等研究发现，大肠杆菌在的革兰阴性致病菌中占主要地位，铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等次之。偶有报道发现，大肠埃希菌为其腹透相关性腹膜炎最主要的致病菌[9]。真菌性腹膜炎的发生率较低，但症状重、预后差。国际腹膜透析协会(ISPD)关于腹膜透析相关感染的指南提出，对于诊断明确的真菌感染的腹膜炎，需要立即做出拔管处理[1]。宋江勤、霍飞蛟等报道显示真菌感染以假丝酵母菌为主[10-11]。

ISPD指南建议单中心的病原菌培养阳性率应≥80%[1]；而我国众多腹透中心细菌培养阳性率多在50.0%-70.0%之间[12-13]，达不到ISPD指南要求。目前国内外针对病原菌检测的主要方法是细菌培养，即采集标本后先将其接种于培养基，待出现细菌生长后分离单个菌落，通过形态学、生物化学、免疫学等方法最终鉴定病原菌。腹透液细菌培养受到有效接种细菌的数量、培养的温度、PH值、氧含量、培养基等多种因素的影响。尽管此方法准确率较高，但培养阳性率低，并且培养时间较长，不能及时指导抗感染治疗，临床应用具有一定局限性，也是国内外腹透液培养阳性率不高的原因之一[14]。

临床上一直在探索一些新的方法以提高PDAP患者细菌检测的阳性率。聚合酶链式反应（PCR）是目前病原菌检测中一项热门技术，它通过放大扩增特定的DNA片段，以分析鉴定菌种。新一代的核酸定量检测技术，即数字PCR(droplet

digital PCR,ddPCR)技术，它利用终点PCR和泊松分布原理，对核酸样本进行绝对定量，具有准确度、精密度等优点，可以检测低至单拷贝待目标基因片段的绝对数值[15-17]。因其特异性和敏感性较高，且能检测低拷贝DNA。目前在食品卫生、细菌鉴定、真菌鉴定和肿瘤突变基因检测方面已取得一定成果[18-21]。但是目前尚无使用微滴式数字PCR技术对腹膜透液中的致病菌进行快速鉴定的文献报道。

本研究中，我们应用微滴式数字PCR技术检测PDAP的腹透液病原菌种类并对核酸分子进行绝对定量，以期达到对腹膜透析相关性腹膜炎致病菌的精准诊断，旨在探讨数字PCR在检测腹膜透析相关性腹膜炎致病菌中的临床应用价值。

第一部分腹膜透析相关性腹膜炎患者病原菌分布

1材料与方法

1.1研究对象

本研究纳入2009年1月至2016年9月期间在我院住院的312例腹膜透析相关性腹膜炎的患者。所有的患者均完成我院专业人员的标准培训课程，并且考试通过后才能进行腹膜透析操作。所有研究对象均于受试前签署知情同意书。本研究方案经我院临床试验机构伦理委员会批准。所有研究对象均于受试前签署知情同意书。

1.1.1纳入标准

所有入选病例均符合以下条件：

(1)符合2010年国际腹膜透析协会(ISPD)有关腹膜透析相关性腹膜炎的诊断：

(a)患者出现腹痛，伴或不伴发热等症状,腹膜透析液出现浑浊；

(b)腹膜透析液中白细胞计数>100/μl,且多形核细胞>50%；

(c)透析液病原菌涂片或培养阳性；

以上3条标准中符合2条即可诊断。

(2)为本中心长期腹膜透析随访患者。

1.1.2排除标准

(1)非感染（如化学性、生物性）因素所致的腹膜炎。

(2)临床资料不完整者。

1.2方法

1.2.1搜集一般临床资料

收集所有入选病例的临床资料，包括姓名、性别、年龄、基础疾病、透析模式、透析时间、腹透液病原学培养结果、培养时间等。

1.2.2标本留取方法

当患者出现PDAP或者高度怀疑为腹膜炎时，使用无菌注射器严格遵守无菌操作抽取10ml腹膜透析液（腹膜透析液留腹时间＞2h)，透出液标本立即送检。

1.2.3病原菌培养和检测

将留取的腹膜透析液标本进行细胞计数及分类检测，并在无菌操作下注入血培养需氧瓶和厌氧瓶中，每瓶10ml，将血培养瓶放至全自动微生物培养仪中培养(35～37℃)。培养7天若无细菌生长则视为培养阴性。血培养阳性后由梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定分析系统进行细菌鉴定。

1.3统计学方法

使用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料如腹膜透析治疗时间、年龄以均数±标准差表示，计数资料如病原菌分布以率或构成比表示。率或构成比的比较采用卡方检验或Fisher’S精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1患者一般资料

8年间共312例患者发生了318例次腹膜透析相关性腹膜炎。其中男性172例，女性140例，年龄17~81岁，平均年龄(53.4±12.6)岁，腹膜透析治疗时间0.5~138月，平均透析时间(22.3±18.8)月。其肾脏基础疾病分别为慢性肾小球肾炎98例，糖尿病肾病80例，高血压肾病58例，痛风性肾病7例，IgA肾病4例，多囊肾3例，梗阻性肾病2例，狼疮肾炎2例，原因不明58例。腹膜炎发生率为0.125次/病人年。患者基本情况见表1。

表1病人基本情况

指标性别

（男/女）年龄

（岁）

透析时间

（月）

腹膜炎发生率

（次/年）

腹膜炎患者（n=312）172/14053.4±12.622.3±18.80.125

2.2腹膜炎病原菌分布情况

312例腹膜炎患者共发生318例次腹膜透析相关性腹膜炎，培养阳性185例次，阳性率58.1%。共培养得细菌194株，其中革兰阳性菌131株（67.5%），革兰阴性菌49株（25.2%），真菌14株（7.2%）。

培养出的革兰阳性菌以凝固酶阴性的葡萄球菌为主，包括表皮葡萄球菌34株，金黄色葡萄球菌14株，粪肠球菌11株。其次为溶血链球菌、沃式葡萄球菌、

缓症链球菌、路邓葡萄球菌、草绿色链球菌等。

培养出的革兰阴性菌中以大肠杆菌为主，肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌次之。

真菌中以白假丝酵母菌为主，、其次为近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌等。（详见表2）

各类细菌以革兰阳性菌所占比例最高约67.6%，革兰阴性菌所占比例次之（25.2%）、真菌占（7.2%）。（详见图1）

表2我院腹透中心病原菌分布情况

病原菌菌株数构成比（%）革兰阳性菌131

表皮葡萄球菌3425.9%

金黄色葡萄球菌1410.6%

粪肠球菌118.4%

溶血链球菌8 6.1%

沃式葡萄球菌7 5.4%

缓症链球菌7 5.4%

路邓葡萄球菌7 5.4%

草绿色链球菌5 3.8%

唾液链球菌4 3.0%

血链球菌3 2.3%

其他细菌3123.7%革兰阴性菌49

大肠杆菌2040.8%

肺炎克雷伯菌510.2%

铜绿假单胞菌3 6.1%

鲁式不动杆菌3 6.1%

鲍曼不动杆菌2 4.1%

其他细菌1632.7%真菌14

白假丝酵母菌428.6%

近平滑假丝酵母菌214.3%

光滑假丝酵母菌17.1%

其他细菌750%

图1各细菌总平均构成比

3讨论

腹膜透析相关性腹膜炎是腹透患者在腹膜透析过程中因接触感染、消化道炎症、导管相关性感染和医源性操作等原因导致相关病原菌侵入腹腔引起的急性感染性疾病。近年来，通过对患者知识宣教的加强和腹透管路连接系统的改进，腹膜透析相关性腹膜炎的发病率较前已明显降低，但仍是患者透析失败，甚至死亡的重要原因[22-24]。

本研究中，腹膜透析相关性腹膜炎患者病原菌培养阳性率为58.1%，低于ISPD 指南提出的培养阳性率（＞80％），但与国内较多大型腹膜透析中心公布的数据相似[25-29]。我们分析培养阳性率偏低的原因一方面与部分患者在入我院前已接受抗感染治疗有关，另一方面与我中心没有对腹透液进行离心后再接种培养有关。

本研究中革兰阳性菌占主要地位，以表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌为主。这与国内外较多研究报道一致[30-32]，这提示我中心G+球菌是腹膜透析相关性腹膜炎的主要致病菌。表皮葡萄球菌作为一种条件致病菌易使机体发病，且容易形成生物膜，导致复发[33]。金黄色葡萄球菌则易由接触感染引起。本腹透中心地处西部，经济卫生条件相对落后，患者无菌观念差，因此加强对腹膜透析相关性腹膜炎患者腹透知识及感染预防的宣教，可在一定程度上降低G+菌所致的腹膜感染。

随着预防感染宣教的加强以及抗生素的广泛使用，患者腹膜透析液致病菌的分布发生了一定变化。G-菌的培养阳性率呈现逐渐升高趋势，在某些腹透中心甚至成为最主要致病菌[34-35]。本研究共培养出G-菌49株，最常见为大肠杆菌（20株），其次为肺炎克雷伯杆菌（5株）。郭群英等[36]对单个腹膜透析中心的腹膜透析相关性腹膜炎患者的病菌谱进行15年回顾分析发现，大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌是其常见G-致病菌，大肠杆菌腹膜炎的发生率逐渐上升，但肺炎克雷伯杆菌性腹膜炎的发生率逐渐下降。

大肠埃希菌感染主要与肠道感染、菌群失调有关，在临床上凡是有恶心、呕吐等消化道症状的患者均应警惕腹膜炎的发生。近年来，腹膜透析相关性腹膜炎患者真菌的培养率较前有所上升，真菌感染的患者往往病情重、预后差。本研究共培养出真菌14株（7.2%），以白假丝酵母菌（4株）为主。这与国内宋江勤[1]的研究结果相似。ISPD指南指出，一旦确诊真菌感染需立即拔管。

虽然随着培养技术的不断提高，通过留取腹透液标本时离心取沉渣然后注入培养瓶[1]，或使用可中和抗菌药物的血培养瓶[37]可以一定程度提高培养阳性率，但仍不能达到ISPD指南的要求，故进一步加强无菌操作和尝试新的鉴定病原菌的技术显得尤为重要。

4结论

综上所述，本腹透中心腹膜透析相关性腹膜炎的病原菌以革兰阳性菌占主要地位，其中最常见的致病菌是表皮葡萄球茵，其次以金黄色葡萄球菌和粪肠球菌为主。腹膜炎革兰阴性致病菌中以大肠杆菌为主。

第二部分利用数字PCR检测腹膜透析相关性腹膜炎病原菌1材料

1.1主要实验设备仪器

水浴恒温箱北京中兴伟业

satorius电子天平德国satorius公司

移液器德国eppendrof公司

8×Eppendrof排枪德国eppendrof公司

离心机德国eppendrof公司

电泳仪美国BIO-RAD公司

电泳槽美国BIO-RAD公司

My cycler PCR仪美国BIO-RAD公司

4℃冰箱青岛海尔特种电器有限公司

-20℃冰箱青岛海尔特种电器有限公司

凝胶成像系统美国BIO-RAD公司

1.2主要实验试剂和耗材

细菌基因组DNA提取试剂盒中国TIANGEN公司

D2000Marker北京聚合美生物科技有限公司

2×M5Taq PCR Mix北京聚合美生物科技有限公司

上下游引物成都擎科梓熙生物技术有限公司

探针引物成都擎科梓熙生物技术有限公司

无水乙醇成都科龙化工

琼脂糖西班牙Biowest公司

枪头与离心管美国Axygen公司

96孔PCR板美国Axygen公司

QX200数字PCR仪美国Bio-Rad伯乐公司

1.3培养基

平板培养采用布式血琼脂平板，液体摇瓶采用LB液体培养基。LB液体培养基（g/瓶）：胰蛋白胨1g，酵母膏0.5g，氯化钠1g，加蒸馏水至100mL，pH 值7.0，121℃灭菌15min。

1.4标准菌株

根据我中心PDAP病原菌分布情况（论文第一部分研究结果），选取最常见的4种病原菌为实验菌（约占41%），分别为表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌。由ATCC公司提供4种细菌的标准菌株，分别为传代ATCC 1228、ATCC25923、ATCC25922、ATCC25921。

标准菌株培养和细菌菌悬液制备：选取实验室甘油保存的ATCC菌株，在血平板上划线活化。从血平板上挑数个单菌落，置于10mL的液体LB培养基中，随后振荡培养24h(37℃，200r/min)。

2实验方法

2.1研究对象

收集2017年3-10月我院肾内科腹膜透析相关性腹膜炎病人的腹透液标本。参照2010年ISPD指南，PD患者具备以下3项中的2项以上者诊断腹膜炎：(1)患者出现腹痛，腹膜透析液出现浑浊,伴或不伴发热等症状；(2)腹膜透析液中白细胞计数>100/μl,且多形核细胞>50%；(3)透析液病原菌涂片或培养阳性。满足腹膜炎诊断为纳入标准，非感染性腹膜炎为排除标准。

2.2传统细菌培养

将留取的腹膜透析液标本在无菌操作下注入血培养需氧瓶和厌氧瓶中，每瓶10ml，将血培养瓶放至全自动微生物培养仪中培养(35~37℃)。培养7天若无细菌生长则视为培养阴性。血培养阳性后由梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定分析系统进行细菌鉴定。

2.3标本细菌DNA提取

使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，进行腹透液标本细菌DNA提取,具体如下:

2.3.1取30例腹透液标本和标准细菌培养液5ml，10000rpm（～11500x g）离心1min，尽量吸净上清。

2.3.2向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮。

2.3.3向管中加入20ul Proteinase K溶液，混匀。

2.3.4加220ul缓冲液GB，震荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

2.3.5加220ul无水乙醇，充分震荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，剪短离心以去除管盖内壁的水珠。

2.3.6将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（～13400x g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

2.3.7向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm（～13400x g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

2.3.8向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm（～13400x g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

2.3.9重复操作步骤8。

2.3.10将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（～13400x g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱残余的漂洗液。

2.3.11将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（～13400x g）离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.3.12取1ulDNA于Nanodrop测量DNA浓度及OD值。

2.3.13对所有样本进行编号，并存放于-80℃冰箱中保存。

2.4引物、探针的设计与合成

2.4.1引物、探针的设计

根据我院腹透中心318例次腹透相关性腹膜炎病原菌的分布情况，和国内外相关文献，确立4种细菌作为检测菌种，找到其特异性引物、探针。使用普通PCR法进行检测确定是否能扩增出目标片段根据GenBank数据库基因序列，按照Primer6.0软件使用教程，遵循设计原则：引物片段的长度为18-25碱基，GC

含量40%-60%，错配少，目的基因片段小于300碱基。纳入细菌的特异性引物探针目的片段长度分别为：表皮葡萄球菌161bp、金黄色葡萄球菌110bp、大肠杆菌80bp、粪肠球菌137bp。（各菌种引物及探针序列见表3）。

2.4.2引物、探针的合成

引物、探针的合成由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。引物、探针使用说明：由于DNA呈干粉状附在管壁上，故使用前应先离心，溶解DNA时参照报告单上标示的量稀释为浓度100μM，上下充分振荡5分钟后方可使用。

表3四种实验菌种引物和探针序列

细菌引物序列5’-3’荧光探针5’-3’

表皮葡萄球菌

F：TTCCGCTCTCGTTTCCGT

R：ATTGCACGTTCTTCAGGTGT TGCTTGTTGAAGCACAA CTTGACTTACTCA

金黄色葡萄球菌F：TGATACACCTGAAACAAAGCAT

R：ACTCGACTTCAATTTTCTTTGC TGGTCCTGAAGCAAGT GCATT

大肠杆菌F：CTTCGAGACGGGCTACGC

R：GAACGCTTATGGTCACGGTCT CGTCAGCATCGGGGAG CGTT

粪肠球菌F:CCGAGTGCTTGCACTCAATTGG

R:CTCTTATGCCATGCGGCATAAAC AGCACCTGTTTCCAAGT GTTATCCC

2.5引物、探针在标准菌株下的PCR检验

2.5.1聚合酶联反应（PCR）体系

表4PCR体系（20μl）

试剂名称用量M5Taq PCR Mix10μl 上游引物1μl 下游引物1μl 模板DNA8μl

2.5.2聚合酶联反应（PCR）条件

表5PCR反应条件

步骤温度时间

预变性95℃3min

变性94℃25s

退火55-64℃25s

36循环

延伸72℃1min

终延伸72℃5min

2.5.3四种实验菌PCR反应退火温度

表6聚合酶联反应退火温度

细菌表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌粪肠球菌

温度57℃55℃55℃60℃

2.5.4PCR产物进行琼脂糖电泳

2.5.4.1主要溶液的配制

1.电泳缓冲液：

用242g三羟甲基氨基甲烷（Tris base）、57.1ml乙酸（acetic acid）和37.2g 乙二胺四乙酸（EDTA）混合配制成总量为1L的50×TAE储存液。需要进行电泳时则稀释为的工作液。

2.琼脂糖凝胶：

根据制胶量和凝胶浓度（1.5%），在三角锥瓶中加入100ml1×TAE的工作液，再加入利用电子天平准确称量的1.5g琼脂糖粉，震荡数分钟以保证琼脂糖粉完全溶解，放入微波炉中高火加热2分钟。随后将已经加热融化的琼脂物放置室温至其冷却约60℃时，加入3ul溴化乙锭溶液使其终浓度为0.5ug/ml。将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。在室温下放置使其自然凝固（大约30分钟）后，拔出梳子，然后放置于电泳槽中进行电泳。

2.5.4.2加样

用微量加样器吸取8ulPCR产物，枪头伸进液面，对准加样孔，缓慢推出使其落入加样孔内。

2.5.4.3电泳

连接正负极，加样孔侧应连接负极，盖上电泳槽。根据目的片段大小，调节电泳仪电压为120V，电泳时间约为30分钟。

2.5.4.4观察结果

取出凝胶放于紫外凝胶成像系统下进行观察、摄图，判断结果。

2.6标本DNA进行数字PCR检验

2.6.1实验方法

将30例PDAP患者的腹透液标本送至成都仕康美生物科技有限公司分别用四种细菌探针引物行数字PCR检验，其标准菌株DNA为阳性对照，无菌双蒸水(ddH2O)为阴性对照。

（1）数字PCR工作原理

微滴数字PCR的工作流程一般为：配置反应体系、制备微滴、微滴的PCR 扩增、检测微滴、分析数据、显示结果。其中制备微滴是数字PCR的核心阶段。

将含有样品的ddPCR反应体系和油加入微滴发生卡中的指定位置，并放入微滴发生器内。每个样品（20μl）可生成20,000个大小均一的微滴。将生成的微滴转移到96孔PCR反应板相应孔中然后进行PCR扩增。此时每个微滴都是一个独立的反应单元。待PCR扩增结束后，将PCR反应板直接放入微滴分析仪，对所有样品中的每个微滴进行荧光检测。强荧光信号的记为阳性微滴，弱荧光信号的记为阴性微滴。

（2）数字PCR操作流程

配置反应体系：体系为20μl，包括腹透液离心后提取的5μl模板DNA，Bio-Rad公司提供的2×Droplet PCR Supermix，上下游引物各500nM和Taqman 探针250nM，随后将其充分混匀。

制备微滴：将20μl反应物体系和70μl droplet oil加入的油孔中，将此微滴发生卡放入QX200Droplet Generator（微滴发生器）中，启动仪器开始制备微滴。

微滴的PCR扩增：将生成的微滴转移置PCR96孔板中，板孔用铝箔盖住，放入Bio-Rad PX1Plate Sealer，180℃热封5sec。运行参数：预变性95℃，10min；变性95℃，10sec；退火延伸57℃，1min；共40个循环；热失活98℃，10min。

检测微滴：待PCR反应终止后，使用微滴分析仪对各阳性，阴性微滴进行检测。

2.7统计学分析

计量资料如腹透液培养时间以均数±标准差表示。率或构成比的比较采用卡方检验或Fisher’S精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。数字PCR检测的阳性、阴性微滴采用泊松分布原理，检测结果用QuantaSoft软件进行分析。

3结果

3.1传统细菌培养结果

30例PDAP患者腹透液细菌培养阳性13例，培养阴性17例，细菌培养阳性率为43.3%（13/30）。13例培养阳性标本中培养结果包括金黄色葡萄球菌3例，表皮葡萄球菌2例，大肠杆菌1例，溶血葡萄球菌2例，沃式葡萄球菌1例，铜绿假单孢菌1例，近平滑假丝酵母菌1例，阪崎肠杆菌1例，唾液链球菌1例。细菌培养报告结果需63-98小时，平均（82.57±14.13）小时。具体分布见表7。

表730例腹透液样本细菌培养病原菌分布

细菌例数

金黄色葡萄球菌3

表皮葡萄球菌2

大肠杆菌1

溶血葡萄球菌2

沃式葡萄球菌1

铜绿假单孢菌1

近平滑假丝酵母菌1

阪崎肠杆菌1

唾液链球菌1

3.2PCR扩增产物琼脂糖电泳

通过4种标准菌株（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌）做PCR反应检验该四种细菌的特异性引物。PCR扩增产物均进行琼脂糖电泳。如图所示（图2），PCR产物呈单一条带，无拖带或其它杂带等现象。

a b

c

d

图2PCR 扩增产物琼脂糖电泳结果注：图a.b.c.d ：分别为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌的标准菌株PCR 扩增产物条带及产物大小。

3.3标本数字PCR 检验结果

3.3.1数字PCR 的阳性+阴性对照实验结果

用4种标准菌株（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌）的DNA 做阳性对照，无菌ddH2O 做阴性对照。如图3所示，四种细菌特异性引物探针均能通过数字pcr 检验其所对应的病原菌。

137bp ?

80bp ?

?2000bp

?1000bp

?100bp ?250bp

161bp ?110bp ?

a b

C

图3阳性+阴性对照的数字PCR的一维散点图

注：图中红线代表阈值，阈值以上的蓝色区域代表阳性微滴，提示反应阳性，阈值以下的灰色区域代表阴性微滴，提示反应阴性。图a：G12表示表皮葡萄球菌标准菌株DNA，H12表示ddH2O；图b：G10表示粪肠球菌标准菌株DNA，H10表示ddH2O；图c：A12表示金黄色葡萄球菌标准菌株DNA，B12表示大肠杆菌标准菌株DNA，C12、D12均表示ddH2O。

3.3.2细菌培养阳性标本的数字PCR实验结果

细菌培养阳性标本13例均用四种探针引物做数字PCR检验，4种细菌的特异性探针引物数字PCR检测结果均与传统细菌培养结果相同。详见图4。

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图4细菌培养阳性标本的数字PCR一维散点图

注：图中红线代表阈值，阈值以上的蓝色区域代表阳性微滴，提示反应阳性，阈值以下的灰色区域代表阴性微滴，提示反应阴性。图a：E01、F01、G01表示检测出金黄色葡萄球菌阳性3例，A01-D01均提示检测阴性。图b：B07、G07表示检测出表皮葡萄球菌阳性2例，A07、C07-F07均检测阴性；图c：A04表示检测出大肠杆菌阳性1例，B04-G04均检测阴性。

3.3.3细菌培养阴性标本的数字PCR实验结果

细菌培养阴性标本17例均用四种探针引物做数字PCR检验，其中检测出金黄色葡萄球菌1例，粪肠球菌1例，另外15例标本ddPCR检测结果均为阴性。详见图5。

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图5细菌培养阴性标本的数字PCR一维散点图

注：图中红线代表阈值，阈值以上的蓝色区域代表阳性微滴，提示反应阳性，阈值以下的灰色区域代表阴

性微滴，提示反应阴性。图a：A02表示检测出金黄色葡萄球菌阳性1例，B02-G02均检测阴性。图b：A06

表示检测出粪肠球菌阳性1例，B06-G06均检测阴性。

3.4两种病原菌检测方法的时间

3.4.130例标本行传统细菌培养，检测时间平均约82.57±14.13小时，数字PCR 检测时间约6.5小时。

4讨论

腹膜透析相关性腹膜炎是导致患者腹透失败甚至死亡的主要并发症和原因。随着操作和透析管路技术的不断更新和对出口处护理的重视，PDAP的发生率近年来有明显下降趋势，但仍是使患者退出腹透的重要原因[38-40]。对于PDAP，尽早明确病原菌和使用抗生素是治疗的关键。目前检测PDAP致病菌的主要方式为细菌培养。此方法虽然准确率高，但花费时间长，且受多种因素影响导致其培养阳性率低[14]。随着科技的发展，检测病原菌的方法越来越多，燕雯雯、王婵媛等应用PCR技术检测腹透液中的病原菌[41-42]。近年来，数字PCR技术因其可以实现核酸的绝对定量和稀有碱基的富集，作为一种新的检测手段也逐渐应用到各个领域。例如镰状红细胞贫血，血友病以及胎儿RH血型检测[43]，肿瘤基因突变检测等[44-45]。另外，数字PCR技术在细菌、病毒鉴定方面也有一定运用[46]。对于腹膜透析来讲，透析液中因绝大多数为人类的组织、细胞或基因，病原菌及其少量。数字PCR相