凝胶层析技术——葡萄糖凝胶的使用

凝胶层析技术——葡聚糖凝胶的使用

摘要：本文综述了凝胶层析技术中所使用的葡聚糖凝胶的使用方法，及注意事项。关键词：凝胶层析，葡聚糖凝胶，使用，注意事项

引言：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。1959年，Porath和Flodin 首次用一种多孔聚合物——交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，成为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚乙苯烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，成为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等很多领域。此项技术中，凝胶的选择尤为重要，因此凝胶的使用及使用时的注意事项尤为重要。

1、凝胶层析原理

凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，他们经历的流程短，流动速度快，所以先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

2、葡聚糖凝胶的化学和物理性质

葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。

化学稳定性

葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂(除非它被化学降解)。它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。

物理稳定性

葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。

3、葡聚糖凝胶的种类

（1）、葡聚糖凝胶 G-10 分离范围：蛋白质相对分子质量小于700，应用于缓冲液交换、脱盐、分离小分子、取出小分子。

（2）、葡聚糖凝胶 G-15 分离范围：蛋白质相对分子质量小于1500，应用于缓冲液交换、脱盐、分离小分子、取出小分子。

（3）、葡聚糖凝胶G-25 分离范围：蛋白质分子质量1000-5000，应用于工业上脱盐及交换缓冲液。

（4）、葡聚糖凝胶G-50 分离范围：蛋白质相对分子质量1000-30000，应用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。

（5）、葡聚糖凝胶G-75 分离范围：蛋白质相对分子质量2000-70000，应用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。

（6）、葡聚糖凝胶G-100 分离范围：蛋白质相对分子质量2000-120000，应用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。

（7）、葡聚糖凝胶G-150 分离范围：蛋白质相对分子质量5000-300000，应用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。

（8）、葡聚糖凝胶G-200 分离范围：蛋白质相对分子质量5000-600000，应用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。

四、葡聚糖凝胶的使用方法

1. 乙醇浸泡：

在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;

2. 无盐水浸泡：

室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；

3. 盐酸浸泡：

在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性；

4. 将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；

5. 上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值)；

6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可；

7. 洗脱方法：

可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl 等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；

8. 在位清洗(CIP)

凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。

备注: 其它规格葡聚糖凝胶处理方法类似。

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用 引言 蛋白FITC标记以及葡聚糖凝胶柱是生物科学研究中常用的实验技术。蛋白FITC标记可以通过将荧光染料FITC（荧光同种异构体）与蛋白质结合，实现对蛋白质的追踪、定位以及分析等应用，并广泛应用于分子生物学、细胞生物学、免疫学等领域。葡聚糖凝胶柱则是一种常见的柱层析技术，可用于分离和纯化蛋白质、核酸以及其他生物大分子。下面将详细介 绍蛋白FITC标记的步骤以及葡聚糖凝胶柱的使用。 一、蛋白FITC标记步骤 1.准备荧光染料FITC溶液：称取一定量的FITC粉末，加入适量的溶 剂（如溶于碳酸氢钠缓冲液），使其溶解成一定浓度的FITC溶液。 2.准备蛋白质样品：选取需要标记的蛋白质样品，可以是纯化的蛋白 质或者生物标志物。 3.标记蛋白质和FITC：将一定比例的FITC溶液与蛋白质样品混合， 通常在暗处、低温水浴条件下反应一定时间（如1-2小时）。注意控制反 应温度和时间，不同的蛋白质可能需要不同的条件。 4.清除未反应的FITC：使用一种合适的方法（如柱层析、超滤等） 将未反应的FITC分离出来。 5.测定标记效率：通过分光光度法测定FITC标记蛋白质的浓度和 FITC的浓度，计算标记效率。

1.制备葡聚糖凝胶柱：按照柱层析的要求，准备合适大小的玻璃柱子，并将葡聚糖填充于柱子内。葡聚糖填充量可根据样品的分离要求进行调整，通常在0.5-1.5倍柱子体积的范围内。 2.提前平衡柱子：将平衡缓冲液（可根据实验需求选择）加入柱子中，持续流通一定时间，达到柱子内外平衡。 3.样品加载：将待分离的样品溶液均匀地加入柱子上部，并加入一定 量的平衡缓冲液，形成样品层。 4.柱洗脱：将平衡缓冲液加入柱子顶部，形成洗脱缓冲液流动，逐步 冲洗样品。 5.收集分离后的样品：分离后的目标物质将会以不同时间点流出柱子，可以根据需要采集不同时间段的洗脱液。 6.分析和应用：通过分析采集的洗脱液，可以进一步对目标物质进行 定性和定量的分析。 结论 蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是一些常见的生物分子实验技术。蛋白FITC标记可以实现对蛋白质的定位、追踪和分析，而葡聚糖凝胶柱 则可以用于分离和纯化生物大分子。这两种方法在生命科学研究中具有广 泛的应用价值。通过掌握和运用这些技术，可以为生物科学研究提供强大 的支持和帮助。

葡聚糖凝胶层析

葡聚糖凝胶层析 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤

1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果：

05 实验五 葡聚糖凝胶层析

实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。 【实验材料】 1.实验器材 层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计 2.实验试剂 (1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。 (2) 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。 (3) 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—200010毫克，溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。 (4) 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。 (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25) 【实验操作】 1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。 2.装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。 (5) 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。 再生以备下次使用。 6 分离的技巧，最后说说我的使用心得 （1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。 （2）柱子尽可能长，Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。 （4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质 （6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶

葡聚糖凝胶

(1)预处理 称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例）约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断裂等。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。 凝胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。直至降到满意高度为止，等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗脱过夜。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装。 (3) 加样 装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡，待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时（不能流干，否则会带入气泡），用滴管吸取样品溶液，在高于凝胶表面约1cm 处，沿管壁四周缓缓滴加样品液，加完后打开下面的出口，使样品渗入凝胶内。再关闭出口，用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，至溶液渗入柱内，再关闭出口。可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面（我一般不加），然后即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱，常用的洗脱剂是水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，一般根据自己样品的性质选择洗脱液，洗脱液可一直用单一梯度。凝胶色谱的共性是流速慢，每份一般体积较小。（内径1.3cm左右，长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml） (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱多次使用后，若污染严重，则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl 混合液浸泡后，再用水洗净即可。 通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后，就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染杂质过多，甚至变色，需经再生后才可使用。再生方法有多种：如（1）用水进行逆向冲洗，再用洗脱剂平衡，便可重新使用。又如（2）把凝胶倒出，用6mol/L脲浸泡凝胶半小时，抽滤，再用水漂洗数次，除净脲，必要时重复上述操作即可重新使用。 1.凝胶的预处理 交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。 2.装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的

分子筛凝胶层析

实验三分子筛凝胶层析 一、实验目的 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 二、实验原理 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。目前关于凝胶层析的原理有许多假设和理论，普遍接受的是分子筛效应。凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。对凝胶层析分离的简单过程可用图1表示。 小分子 大 分 子 凝胶颗粒 图1 小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留， 大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过 本实验是分子筛凝胶过滤法的初步训练，采用葡聚糖凝胶G-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子红葡聚糖和小分子维生素B12。 三、试剂和器材 试剂 蓝葡聚糖- B12混合液、葡聚糖凝胶Sephadex G-25 器材 层析柱：柱管（1厘米×20厘米），附有一小段乳胶管及螺旋夹 洗脱瓶（下口锥形瓶，250mL） 试管及试管架 量筒（10mL） T6新世纪紫外可见分光光度计 四、操作 （一）凝胶的预处理 为使样品通过凝胶时具有良好的流速并能很好的分离，应对凝 胶进行预处理。 （1）凝胶必须于使用前在过量的溶剂中充分地膨胀。 （2）用倾泻法除去混杂的细小颗粒，重复3-4次。

在膨胀时间内，应避免剧烈搅拌，以防止破坏交链结构。 （二）柱的选择 为了防止分离受管壁效应影响，一般应选用内径大于2.5厘米的柱。为了便于组织拆卸，下口可取一个适当削磨过的橡皮塞倒插入管底，这种装法亦可避免层析柱的死区而有利分离。橡皮塞上还覆盖一层尼龙绸或脱脂棉，以防止葡聚糖颗粒流出。（三）装柱 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作，实验时必须将凝胶床装得十分均匀。首先，将柱垂直地安装好。层析柱下端及尼龙绸必须充以溶剂，不能留有气泡，然后，将已膨胀的凝胶沿着玻璃棒小心地徐徐灌到柱中，尽量一次装完，以免出现不均匀的凝胶带，为此在装柱时需打开下口，并调节适应的流速。灌注时，凝胶悬浆切不可太稀或太粘。 若太稀，分几次装出的凝胶床往往不是均匀的，过于粘稠，会吸留气泡。 （四）加样 打开柱的下口，让溶剂（水）逐渐流出，（或由上面吸走，亦可），待到床面上只留下极薄的一层溶剂时，关闭出口管上的螺旋夹。 拧开柱的上阀，用胶头滴管吸取混合液，小心地将3~5滴此样品垂直加到凝胶床的表面上。注意加样时勿将床面凝胶冲起，亦不要沿柱壁滴加样品，因为这样样品易从柱壁与凝胶床之间漏下。 然后，打开出口管，待样品全部进入床后，关闭柱的下口，加入3cm水后，再打开柱的下罚，加水进行扩展洗脱。 在全部操作期间，要避免柱床流干。 （五）洗脱 加蒸馏水洗脱，用小量筒收集洗脱液，用螺旋零部件调节洗脱速度为0.5mL/分，每次1mL，依次倒入已预先编好号码的试管中，观察并记录洗脱中的现象。 收集15管左右，先收集的一部分溶液呈蓝色，后收集的一部分溶液呈红色。 每管加入蒸馏水1mL，稀释1倍，倒入比色皿中，于分光光度计测定光密度，蓝色溶液部分在680nm波长下测定，红色溶液部分在520nm波长下测定。以mL数（或管数）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘出洗脱曲线。 五、实验结果 溶液的吸光值为： 表1 680nm下吸光度 表2 520nm下吸光度 ml 数9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 ml 数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 吸光值0.00 5 0.00 7 0.00 9 0.01 3 0.01 5 0.06 4 0.09 7 0.11 3 0.06 5 0.02 1 0.01 4 0.01 1 0.00 7 0.00 6 0.00 4

凝胶层析技术——葡萄糖凝胶的使用

凝胶层析技术——葡聚糖凝胶的使用 摘要：本文综述了凝胶层析技术中所使用的葡聚糖凝胶的使用方法，及注意事项。关键词：凝胶层析，葡聚糖凝胶，使用，注意事项 引言：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。1959年，Porath和Flodin 首次用一种多孔聚合物——交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，成为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚乙苯烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，成为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等很多领域。此项技术中，凝胶的选择尤为重要，因此凝胶的使用及使用时的注意事项尤为重要。 1、凝胶层析原理 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，他们经历的流程短，流动速度快，所以先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 2、葡聚糖凝胶的化学和物理性质 葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。 化学稳定性 葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂(除非它被化学降解)。它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。 物理稳定性 葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。 3、葡聚糖凝胶的种类 （1）、葡聚糖凝胶 G-10 分离范围：蛋白质相对分子质量小于700，应用于缓冲液交换、脱盐、分离小分子、取出小分子。 （2）、葡聚糖凝胶 G-15 分离范围：蛋白质相对分子质量小于1500，应用于缓冲液交换、脱盐、分离小分子、取出小分子。 （3）、葡聚糖凝胶G-25 分离范围：蛋白质分子质量1000-5000，应用于工业上脱盐及交换缓冲液。

凝胶过滤层析

【实验目的】 掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法 【实验原理】 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵 2、试剂：SephadexG-25 【实验步骤】 （1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。 （2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。 （3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。 （4）凝胶的预处理： 将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。多洗几次，尽量洗干净。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。充分溶胀后，进行真空脱气。 （5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。 （6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。 （7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。 （8）上样：上样量在5%~10%。 （9）标准曲线的制作： 本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。得到理想的出峰情况后，根据出峰时间与分子量大小作出标准曲线，得到曲线方程。 （10）样品分子量的确定： 在与标准品层析的相同条件下上样，对样品进行凝胶过滤层析。从层析图上得到出峰时间，然后根据标准曲线方程便可以计算得到对应的分子质量。

凝胶层析综述

凝胶层析 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 制备： Sephadex G200是分子筛填料（sephadex G-200葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定），上柱时只要恒定的流速，不用洗脱的，根据多糖的大小，出峰顺序不一样的，减少上样量、降低流速、增加高径比都能提高分辨率（如果从制备的角度，还要综合考虑分辨率和制备能力capacity ，必要时候需要牺牲一定的分辨率，在过载条件下操作。例如，流速就不是越低越好。） 在制备时，确实应该综合考虑resolution和capacity，如果两者不能很好协调的时候，应该牺牲的是capacity，而不是resolution。 分子筛一般主要是两大用途：除盐和分离，对于前者要求不是很严，sephadex G25 G50 都是专门用来除盐的，载量最高可以达到柱体积的20%，而且对于流速等条件的要求都不高。 分子筛层析如果用来分离不同大小的蛋白或多糖一般是用在后面的精纯化阶段。 平常纯化的时候不到万不得已是不会用到分子筛的，因为它的上样量很小，而且做一次需要的时间也很长，与离子交换、疏水或反向等比起来太费时费力，这时用分子筛来分离首先考虑的就是它的分辨率。当然在保证分辨率的情况下通过增加流速、增加上样量等方法来提高capacity是最好的。如果上述条件的改变影响了resolution和recovery，最好是在保证resolution和recovery的情况下少量多次进行层析分离。 离子交换色谱洗脱主要是两种方式，第一种是增加缓冲中的盐离子浓度，这些离子会和蛋白竞争性的与配基吸附，随着离子强度的增大，洗脱离子依靠数量上的优势优先与配基结合，从而使不同离子特性的蛋白洗脱；第二种方式是通过改变pH的方法改变蛋白自身的带电特性，这时由于蛋白自身带电性质的改变，不用盐离子竞争性吸附，它自身就会从配基上解离。一般离子交换洗脱的时候优先考虑用增加离子强度的方法进行洗脱，因为通过改变pH 的方法使蛋白解离一般会经过蛋白的pI，这时蛋白溶解度降低会降低，会存在沉积到填料上的危险（使用极高或极低的pH应能把蛋白洗脱下来，但同样涉及到蛋白在该pH的稳定性问题）。用增加离子强度的方法进行洗脱有时会使疏水性特别强的蛋白出现盐析，从而沉淀在填料上。这时一味增加盐离子强度无法使蛋白洗脱的，此时只能把盐离子强度降低，用改变pH的方式进行洗脱。 用g200填料分离纯化多糖不用恒流泵的话极慢，并且用恒流泵的话，g200的填料就会漏，在柱下面加了两层膜还有少许的填料漏出。是因为sephadex系列的填料刚性不好，g75以上的填料早就停止生产了，G后面的数字越大、刚性越差。是填料本身性质带来的，漏出来的是破碎的填料。这时难有分离效果的。建议更换填料，如sephacryl S 200或S300之类的刚性要好的多。 一般如果分离的多糖跟填料没有吸附作用的话用水洗托就可以了，如果有吸附可以用0.15的NaCl洗托。用盐还是水来洗脱，主要取决于多糖是否带电荷等情况。假设多糖是中性的，盐的存在与多少对于洗脱影响不大；但是，如果是酸性糖，则可能与基质的非体积排阻效应（主要是电荷相互作用）较大，需要用适当高些的盐溶液来完成。

葡聚糖凝胶G-25的使用方法

葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

葡聚糖凝胶层析实验报告

葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让

柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 序号 2 4 6 8 10 12 14 吸光 0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A 序号16 8 吸光 0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011 度A 2、蛋白质样品洗脱曲线：

葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)

葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1) 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化 后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂 组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳， 可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品 较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具 反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子 的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保 留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相 和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以 氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少 体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样 （一定要滤喔！要是把 Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗 脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你 的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极 性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留 在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使 其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。

凝胶层析实验步骤及细节

温州大学第四届生物学科实验技能大赛 血清凝胶层析 实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告 实验时间： 5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。下午1:30开始血清离心操作及层析操作。 实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具 实验后：清理实验器具 凝胶层析的实验步骤

实验试剂和用品 1. 试剂 Sephandex 4B 凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水 2. 主要实验用具 铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）<多孔板、筛板>（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒 凝胶层析定义 凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 实验原理 不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 凝胶柱的制备 在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

凝胶层析技术

凝胶层析技术 凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广， 商品名是sephadex型号很多，从G 10到G 200 ，它的主要应用范围是：①分级分离 各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。 （一）原理 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。 （二）葡聚糖凝胶的种类与性能 葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。 2550 和超细（10µ~40µ）。G 75～G 200 又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～ 40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。

1．凝胶的选择根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除 游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G 28或G 500 ，G 250 多用于分离蛋白质单体， G 200 多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。 2．凝胶的预处理称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。 20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。 3．装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。 装柱过程基本同离子交换层析柱。 4．加样与洗脱样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。 洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。 5．洗脱液收集同离子交换层析。 6．凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种： ⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N 2N 3 或 0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。 ⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。

葡聚糖凝胶层析法

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总

之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由g×Wr求得（g为干胶重量，单位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。 如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显着的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时Vo，出现洗脱峰。