取小鼠脑组织完整版
取小鼠脑组织
HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：
1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；
2.?步骤：处死小鼠，取头颅；
剪开皮肤，漏出颅骨；
用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；
再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；
当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；
然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；
用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；
去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；
取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；
若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。
先麻醉小鼠
剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳
先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了
再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬
小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。
具体操作如下：
实验操作步骤：
1)??小鼠称重，以每克小鼠 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。
2)??将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。
3)??解剖小鼠，暴露心脏。
4)??找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。
5)??将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
6)??将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。
7)??灌流大约5分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。（小鼠的用量没这么多）8）??取材。取实验所需的标本。
9）??将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。
我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还有一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多
开胸时要把肋骨提起，大U字剪开左右肋弓后掀起，血管钳固定一下（以免挡遮视野）；平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈的右心耳（可见血涌出），用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定再推（但滴速也不能太快以免血管被冲破，使灌流液流进肺里）。另：开胸时动作尽量要快；针头可以不插入主动脉，留置于左室也行。
试剂名称：4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
所需药品及剂量：A液：多聚甲醛40g
蒸馏水400ml
B液：Na2HPO4·2H2O
蒸馏水300ml
C液：NaOH
蒸馏水200m
操作过程：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制，至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至～，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合
应用范围：光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛
保存期限及温度：4℃冰箱保存备用，长期保存
我在很多方面是个新手，经常在园子里逛，学到了很多东西，但同时也看到了关于同一个问题有很多不同的回答，我想结合自己的实验，希望各位老师能就我提出的问题说说自己的经验看法，给我启示，因为很多自己未做过，怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果，非常感谢各位老师的不啻赐教！
首先，我做的是大鼠（体重约230-250g），模型是大脑中动脉栓塞，在不同的时间点取脑标本，准备做荧光实时定量PCR、Western blot和冰冻切片，我提的问题主要是在于脑标本的取和存方面。
问题如下：
荧光实时定量PCR方面：
1、标本需要灌注么，有战友说不需要，你是怎么做的，有灌注的话什么溶液灌注，温度？
2、标本取下后液氮速冻，然后转-80度冰箱，这样保存一般可以多久？
3、抽提后的中RNA放-80度冰箱会很容易降解么，还是说要放液氮？
Western blot方面：
4、标本用什么溶液灌注，温度？
5、同一个标本可以同时用于RT-PCR和Western blot检测么？（如果灌注手段一样的话）
冰冻切片方面：
6、灌注冲血用什么溶液，温度？
7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？
8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？
9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？
10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？
11、还有什么需要注意的地方或tips。
6、灌注冲血用什么溶液，温度？
7、用的是含有肝素钠的生理盐水。每瓶500ml的生理盐水加入80mg的肝素钠，肝素钠要避光保存，而且必须使用前临时加入到生理盐水中。肝素钠生理盐水需要用4度预冷。我们用注射器推，大概推100ml，10min。就可以将血液冲干净。速度要自己掌握。
每支肝素钠每亳升含12500U，相当于100mg，用20ml生理盐水稀释，分装成40支，消毒备用（4℃贮存）。临用时，注射器吸取肝素钠溶液一支，而后将肝素液来回抽动，使针筒局部湿润，多余肝素液全部排出弃之，注射器内死腔残留的肝素液即可抗凝。
纯的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100个国际单位，10个国际单位能抗凝1ml血液计）。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。用于试管内抗凝时，一般可配成1%肝素生理盐水溶液，取加入试管内，加热80℃烘干，每管能使5～10 ml血液不凝固。作全身抗凝时，一般剂量为：大鼠～3 mg·(200～300g体重)-1,兔或猫10 mg·kg-1,狗5～10 mg·kg-1。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。
7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？
一般多聚甲醛灌注20min，100ml。标准是动物的尾巴会甩动，全身四肢收缩（这是因为蛋白变性所致），一般看起来像动物活过来了一样。随后就可以将动物的头断掉，来取脑了。
8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？
这个不一定。对于石蜡切片，可以固定很久。但是对于冰冻切片，估计是隔夜或者24h。但是先固定一晚上后再取出来，将不需要的大脑组织切掉，比如脑干、小脑等等。擦干，放在蔗糖溶液里。
9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？
蔗糖用的PB配置。我一般配20%和30%两个浓度。我个人感觉每个浓度需要沉糖
48h。至少我发现24h是不够的。沉糖必须完全沉底。
10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？
我不知道你是看哪个部位的表达。如果是海马的话，我建议从前囟到前囟左右。
确实提的问题很多，看样子还是有所思考，值得赞扬，我也只能说出我个人的经验，讲几个大概的原则，具体细节还要你自己在实验中体会。
RT-PCE与WB都是分子生物学方面的实验，可以共用一个标本，一般不需要灌注，文献上都如此，需要新鲜的脑组织，液氮速冻，-80度保存，半年应该没问题，既然是MCA栓塞，那就要取MCA供血区域，嗅极后3-9mm，如果要分半暗带，园子里有类似的帖子，可查找。至于不灌注，存留的血液可能会影响结果，我一般断头后用生理盐水把血液冲洗干净，然后再敲开露骨取脑，这样，效果会好些。
至于你的脑组织灌注固定，蔗糖脱水3天还没沉底，可能与脑组织太大及梯度脱水有关，我一般在脱水前用双面刀片沿冠状面将多余的脑组织休掉，20%蔗糖1天，30%蔗糖2天，总共3天就足够了，希望对你有帮助。
你在断头后用生理盐水把血液冲洗干净，然后再敲开露骨取脑，我想没通过灌注应该没办法冲掉脑内血管的血吧？
我现在取RT-PCR和WB的标本的做法是：用临床上用的静脉留置针（相对会比较粗些，而且质软不会刺破血管）插到升主动脉快速灌注冰PBS 50ml左右（一般1分钟内灌完），然后快速取脑放入液氮速冻，尽量缩短时间，不知这种做法是否尚可？（个人觉得灌注后的脑标本相对未灌注的会好取些，视野感觉也更好，不会血淋淋的）
至于冰冻切片标本的灌注固定已经是按照你和甲醛版主的方法去做了，期待会有好的结果。
我也说两句冰冻切片，灌注用生理盐水还是PBS这个问题不是主要问题，主要作用在于你能否冲干净血管内的血液，而且一般观点认为灌注液最好在10分钟之内冲完（原因可能在于缺血后脑细胞在10分钟后会大量死亡），而且灌注液最好不要用冰冻的（原因有时候冰冻的液体也会使老鼠抽搐，造成你的判断失误）冲洗液的速度越快越好，量要适当控制，过量的话细胞会肿大，一般我们以肝脏变白为标准，如果还不放心的话，再稍微延长点时间，但是最好不要超过10分钟。灌注时，有一点小技巧，就是把心脏稍微往大鼠的右边向上扭一点，以进针没有阻滞感为佳。
后固定我认为时间不宜太长，因为过多的甲醛会增加片子的背景颜色。一般以6到12小时为佳。还有一种方法就是当你的老鼠灌注的不好时，可以后固定以及脱水两个步骤一起进行。这是别人介绍的，个人没有试过。脱水我们一般是30%的蔗糖水（pbs 配置）等它沉底了就可以切了。脱水不好的话会使片子出现冰晶。
该切片了，其实切片时冰冻的过程是最容易出现冰晶的，我解决的办法比较简单就是速冻，让标本快速的变白。但是问题也不要太低了，太低的话容易碎片，一般在-20左右，脑组织的话最好不要低于-35度。
另外大家可有去找找莱卡CM1850的冰冻切片机说明书，里面有详细的介绍切片过程。其它类型的切片机我想原理也应当差不多。弄明白了一台其它的也就相应的熟悉了。
冰冻切片方面：
灌注冲血可以用生理盐水、的PB 的PBS都可以（注意调pH值）。我们实验
室灌注的时候用常温的，我们认为冷的会引起血管收缩。快速冲到肝脏变白或者右心耳流出的液体变白为止。
多聚甲醛灌注固定速度先快后慢。灌得好就会看到老鼠抽搐、四肢变硬。如果只取脑，可以夹住腹主动脉，这样灌注固定的快，而且省液体。
我们后固定和沉糖都在4度进行。4%多聚甲醛和蔗糖溶液也是4度保存。
关于多聚甲醛灌注以后，确实对于石蜡切片可以固定很久，但是如果做组化的话，一般都是24小时，时间长的话，比如超过1周，可能抗原就会丢失，不容易出结果。
对于大脑：灌注取脑后是继续放到4度多聚甲醛进行24小时后固定，24h之后进行蔗糖梯度脱水，那么下一步的保存，假如2天后已经沉底。因为没有做过大脑，所以我的问题是：
第一：蔗糖溶液是否需要和多聚甲醛溶液一样一般是20倍体积于组织？
第二：这个时候的脑组织是否是和石蜡块里的脑组织一样，保存时间可以很长，会不会很快出现抗原丢失的问题。
第三：保存的条件是什么，石蜡块可以室温，最好4度，甚至-20度。但是其外面包
有石蜡。而大脑还是裸体的，我见到多用OCT包埋后。那么是否必须包埋，不包埋的话该如何处理；包埋之后是放到-20度，还是-80度，还是？？？
第四：这样作出来的冰冻切片在做免疫荧光的时候，是否需要抗原修复吗？？？我觉得是需要的，因为是多聚甲醛固定的吗，抗原都被封闭了。但是没有做过，所以急切想听听大家的看法。
第五：可否不进行灌注和固定，直接动物麻醉，断头处死，然后直接-80度冰箱，用
的时候取出，OCT包埋，切完片子后丙酮固定5-10min啊，我做心肌组织的时候就是
这样做的，结果非常好。而且少了多聚甲醛固定这一步，就不用考虑抗原修复的问题了。
但是看文献上好像做脑的组化都进行了灌注固定，不知其中有何奥秘？？
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
组织病理学技术
组织病理学技术 组织病理学技术 一. 实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二. 实验目的 1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变 3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二.实验材料 1. 实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2. 实验试剂：福尔马林、酒精（50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四.实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1. 取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区域和可疑 灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。
组织病理学技术
组织病理学技术 一．实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二．实验目的 1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2.掌握病变器官的代谢和机能的改变 3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二．实验材料 1.实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2.实验试剂：福尔马林、酒精（50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四．实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1.取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区 域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。 2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。为此，切取组 织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。 3.组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜，必要时可 增大到2×1.5×0.5cm，以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些，待固定几小时后在家以修整，切到适当的大小。 4.对于特殊病灶要做适当标记。 5.注意避免类似的组织块混淆。 6.制片的组织块，越新鲜越好。 7.接受送检标本时，须依据送检单详细检查送检物。 （二）固定和固定液 将组织浸在固定液内，使细胞组织内的物质成为不溶性，让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。 1. 本次试验的固定液为：10%福尔马林液（实验室常用固定液） 福尔马林 100ml 自来水 900ml
小鼠灌注取脑
成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤 实验步骤： 1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。 2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。 3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA#流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为5min。 （固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。 取脑及脱水:
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。 4、将剥离出来的脑浸泡在4%PF/中，过夜固定。 5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。
组织病理学技术
组织病理学技术
组织病理学技术 一．实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二．实验目的 1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2.掌握病变器官的代谢和机能的改变 3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二．实验材料 1.实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2.实验试剂：福尔马林、酒精（50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四．实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1.取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区 域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。 2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。为此，切取组 织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。 3.组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜，必要时可 增大到2×1.5×0.5cm，以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些，待固定几小时后在家以修整，切到适当的大小。 4.对于特殊病灶要做适当标记。 5.注意避免类似的组织块混淆。 6.制片的组织块，越新鲜越好。 7.接受送检标本时，须依据送检单详细检查送检物。 （二）固定和固定液 将组织浸在固定液内，使细胞组织内的物质成为不溶性，让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。 1. 本次试验的固定液为：10%福尔马林液（实验室常用固定液） 福尔马林 100ml 自来水 900ml
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色 步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1. 75%乙醇50分钟 2. 85%乙醇50分钟 3. 95%乙醇(I) 30分钟 4. 95%乙醇(II) 30分钟 5. 100%乙醇(I) 30分钟 6. 100%乙醇(II) 30分钟 7 1/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 &二甲苯（I）20分钟 9 .二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。（三）浸蜡、包埋与修蜡块 1.浸蜡：将60C恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将组织块转入石蜡里，放置于60 C恒温箱120分钟。 2 .包埋：将60 C的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板 上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90 C左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3 .修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8卩m，将切片在55C左右水浴中展开，展开程度 以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37C烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上， 进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1.脱蜡 （1）二甲苯（I）15分钟 （2）二甲苯（II）15分钟 （3）100%乙醇2分钟 （4）95%乙醇（I）1分钟 （5）95%乙醇（II）1分钟 （6）蒸馏水浸洗1分钟 2 .染色
小鼠急性脑缺氧实验
本文通过小鼠急性脑缺氧实验、大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型、对脑血流量影响实验、抑制血小板聚集及血栓形成实验、小鼠不完全脑缺血模型、沙土鼠全脑缺血再灌注损伤等实验和模型，分别从扩张脑血管、抑制血小板聚集及血栓形成、抗水肿、抗缺血再灌注损伤、抗自由基和兴奋性氨基酸损伤等角度，系统的研究了三七中人参三醇皂苷(PTS)对缺血性脑中风的防治作用及其机制。方法1.小鼠急性脑缺氧实验小鼠i.p.给药，每天一次，共3次，末次给药后30min 将小鼠逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间作为耐缺氧指标。 2.大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型雄性SD大鼠，i.p.预防给药两次，每天一次，造模前O.5h i.v.给药1次，造模后4h和10h i.p.给药两次。模型建立：分离、结扎右侧颈总动脉，参照Berdson法用4-0尼龙线阻断大脑中动脉。造模成功能够存活24h的大鼠确定为最后实验对象，并进行行为学评分后，快速取右脑，并切成三片，将脑前部用于脑含水量测定，中部用于脑梗死面积测定，后部用于病理组织学检查。 3.对脑血流量影响实验犬静脉滴注给药，分别在给药前和给药后5、10、15、30、60、120以及180min测定平均动脉血压(MAP)、心率(HR)、脑血流量(CBF)和脑血管阻力(CVR)等指标。4．抑制血小板聚集及血栓形成实验抑制血小板聚集：大鼠i.p.给药，共3次，每天1次。于末次给药30min后，分别自颈总动脉放血，在血样中加入5μl已稀释的ADP(终浓度为50μmol／L)反应5min后测定最大聚集度。抑制血栓形成：大鼠经4％戊巴比妥钠i.p.麻醉，舌下静脉给药后20min，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉。把插入丝线的聚乙烯管的两端分别插入右侧颈总动脉和左侧颈外静脉，打开动脉夹开放血液15min后，中断血流，迅速取出聚乙烯管中的血栓，在分析天平上称重，求出血栓抑制率。5．双侧颈总动脉结扎的不完全脑缺血模型给小鼠i.p.给药，共3次，每天1次；于末次给药后30min，麻醉后分离双侧颈总动脉，各组经尾静脉注射1％伊文思蓝溶液，并分别在注射10min后结扎双侧颈总动脉。在结扎3h后断头取出脑组织，称重后测脑组织内伊文思蓝含量并计算脑指数。6．沙土鼠全脑缺血再灌注损伤模型采用结扎沙土鼠双侧颈总动脉15min再灌注24h制备全脑缺血再灌注损伤模型，动物随机分成假手术组、模型组、PTS 30mg／kg组、PTS 60mg
取小鼠脑组织
丁香园上面总结得方法,排版有点乱、 其实过程与大鼠近似,我得经验就是:?1。材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;?2。步骤:处死小鼠,取头颅; 剪开皮肤,漏出颅骨;?用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;?再 用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨; 当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜与血管;?然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。 3。注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;?用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;?去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;?取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;?若留病理,建议一定要取完整无损得大脑。 做免疫组化得话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定得好,就需要先灌注。?先麻醉小鼠?剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来得水清亮了?再改用固定液(一般就是４%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了,我做得25～3５g得小鼠一般用50mLNＳ+3０mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好得生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺与肝得颜色都变成灰白色即可、然后用多聚甲醛灌流,针孔最好就是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下:?实验操作步骤:?1) 小鼠称重,以每克小鼠０、00２5ｍl 4％戊巴比妥钠剂量得实施腹腔麻醉、也可以用10％得水合氯醛,3－5ｕl/g腹腔注射麻醉。?２) 将麻醉得小鼠仰放在操作台上,去毛、 3) 解剖小鼠,暴露心脏。 4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cｍ(最好就是用小点得针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳、? ５) 将灌流器得导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出得液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器得用注射器或者吊瓶都可以。?6) 将灌流器得导管小心得移至4%多聚甲醛或２、5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果瞧到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。 7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束、(小鼠得用量没这么多)?８) 取材、取实验所需得标本、 ９) 将取出得材料放到事先准备得多聚甲醛(戊二醛)中固定2—-4小时后移至3０%蔗糖中4度冰箱保存过夜。
小鼠pcr基因扩增及鼠灌注取脑操作
小鼠PCR基因鉴定 一、取材：小鼠出生后3-4周，给小鼠打耳标，并依照雌雄分笼饲养， 需要鉴定的小鼠剪尾部、脚趾或耳部边缘，放置好在印管中，并做好相应的标志，放置标本与标志混乱。 处理: (1)将A液一定量加入带有样本的印管中，在98℃孔板中煮1小时 （2）取出印管后，再加入B液75 μl 二、扩增 1.反应体系 Mix 5μl H20 3μl Primer1 0.5ml Primer2 0.5ml 2.加样 先计算出所需总量，加入印管中，混合均匀，离心，摆放好单个PCR管，将上述混合液放入PCR仪，每管9 μl盖紧。 3.扩增 打开PCR仪并设置好程序，将PCR管放入PCR仪，扩增，40多分钟可以完成。 4.保存 扩增后，取出PCR管，放入冰中保存。 三、琼脂糖凝胶电泳
1.制胶：电子天平称取计算后的琼脂糖，小心倒入干净的锥形瓶内（锥 形瓶内保持干净）。加入TAE缓冲液，盖上锡箔纸，加热。取制胶模具、梳子，安装固定，保证不会漏胶。戴上手套，取出锥形瓶，掀开锡箔纸，冷却3-4分钟，加入染色剂，贴着远梳子端的制胶模板壁缓慢倒入琼脂糖溶液，若有气泡。室温放置凝固。 2.上样：胶凝固后，双手缓慢垂直地拔出梳子，避免破坏梳孔。将胶 板放上电泳槽，注意正负极变化，加入1×TAE缓冲液，从胶表面开始缓慢倒入，自然流向两边，然后依次对孔加入对应的DNA样品，剩余样品放入冰箱储存。 3.电泳：合上电泳槽，正负极对好，检查底部是否有气泡升起。有气 泡则电泳开始。 4.成像：观察是否出现条带，若出现条带，则停止电泳，打开凝胶成 像系统，对结果进行比对、记录并拍照。关闭系统，登记实验记录，取出胶并清洗仪器器材。
成年小鼠心脏灌流
成年小鼠心脏灌流 实验材料：需要观察脑切片的小鼠 试剂/试剂盒：乙醚；生理盐水（37℃水浴）；4%PFA；30%蔗糖 仪器：蠕动泵；剪刀；镊子；针头；导管 实验步骤： 1、准备实验器材：两个锥形瓶（1个装生理盐水，一个装4%多聚甲醛，记得要用封口膜封口） 2、用生理盐水冲洗导管，并排除管内气体。（灌流时选用雄性动物比选用雌性动物要好，原因是雌性动物受其激素周期影响，雄性的结果更为可靠） 3、在密闭容器内加适量乙醚，麻醉小鼠。（需要注意的是，小鼠清醒一点比死掉要好，防止血液凝固给灌流带来阻力） 4、待小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。 5、一只手用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。 6、将注射针头插入小鼠左心室（如针头不稳可用镊子将其固定在泡沫板上），同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。灌流速度5.8rpm。（灌注生理盐水的时间维持在10min左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白） 7、对小鼠进行剪尾取样，以备测定其基因型。同时，将小鼠信息卡片上记录灌流信息，并将灌流小鼠的信息记录在自己的实验记录本上，以方便后续的重新基因型鉴定操作。 8、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，将导管始端从生理盐水中拿出，将其放入冰浴的4%PFA溶液（4℃）中，用4%PFA灌流固定时，当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度由5.8rpm调至4.8rpm，以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为20min。（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联） 9、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。 10、拿出一条纸巾，将小鼠尸体放在上面，沿颈部剪下头颅。 11、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 12、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 13、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。 14，将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。 15、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。
取小鼠脑组织0001
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。 先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液(一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25?35g的小鼠一般用50mLNS+30m多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h 后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g 腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm （最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5）将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。 6）将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。 7）灌流大约5 分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。（小鼠的用量没这么多） 8）取材。取实验所需的标本。 9）将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4 小时后移至30%蔗糖中4 度冰箱保存过夜。
最新组织病理切片以及HE染色
组织病理切片以及HE染色 （一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。 （二）实验步骤： 一、制作切片 1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。 2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋 组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。组织染色后也要进行透明。最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。 组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔
点为52-56℃。 组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。 3、切片、制片 石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。切片厚度一般为3-5μm。切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。 二、HE染色 1. 二甲苯脱蜡2×10 min； 2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min； 3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min； 4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min； 5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min； 6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏
大鼠灌注固定取脑
大鼠灌注固定取脑 具体方法： 1. 配4％多聚甲醛PBS缓冲液。配法：称取40g PFA溶于装有900ml PB或PBS的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，搅拌子速度从低到高，慢慢增加，至充分溶解。定容至1000ml，边搅拌边滴加1.0mol/L的NaOH直至7.0，过滤后室温或4℃保存备用。 2.制作灌注装置，一瓶生理盐水，一瓶灌入多聚甲醛，悬挂，输液器链接，远端结一个三通后到一个输液器粗针头端。 3.经心脏行灌注固定：麻醉，充分显露心脏（插针）和肝脏（判断），尽可能多暴露心脏，利于操作。首先快速滴入生理盐水或PBS，用止血钳（选把好的很关键）预夹住心尖少部，持针从心尖略偏左下进，插入有突破感即停（小鼠室壁厚约1mm），大头针或止血钳固定，若正确进入，右房充盈，剪破右房，此时液体较快下滴（调整针头朝向），红色血液从右房流出，快速冲尽全身血液（否则影响免疫反应），时间约4－5min，约40ml/只小鼠，80ml/只大鼠（取水冲洗切口，防血液凝固）。流出液变白即可，盐水过多细胞死亡多。正确的标志：右房充盈（但不是迅速充盈），肝脏逐渐变白，口鼻干燥。再注入4%多聚甲醛灌注30min 左右，多聚甲醛要偏快，100ml/只小鼠，200ml/只大鼠。大鼠不建议用灌注机（先排空管中空气，再行灌注。）它的灌流速度达不到。灌注正确标准：换多聚甲醛后身体反应，尤其尾巴竖起、四肢伸直变硬。PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常；另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。 4.取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边的顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。灌注成功则脑变白，无红色血管。 5. 最后在同样固定液中4℃固定12小时（包新民做的是一周），沉糖切片。 有几点体会：①． 4％多聚甲醛的配制：加热至60～65℃固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。在此强烈推荐：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。②．灌注时夹上腹主动脉只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。③．灌注时注意排空输液管中的气泡不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。 个人体会：1、多聚甲醛加热溶解很快，只需要15分钟左右，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！2、开胸时不要伤到心脏。3、心脏穿刺最好用留置针，软，不宜穿通室间隔,见血即退针芯。插针部位是心尖部，方向向中线（先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的）。 4、生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体。 5、多基甲醛固定成功的表现是刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。5、根据你实验设计，,需要切片的部位，有重点的取，常见的体表标志是前囟和外耳道。 6、去颅骨后脑表面有一层硬脑膜，要去掉。 7、后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。 恒流泵的方法 在心尖搏动明显的部位，朝向主动脉插入灌流针即从心尖插入灌流针，通过左心室直至主动脉；打开腹腔，结扎腹主动脉；剪开右心耳，插人聚乙烯管，用以液体回流。打开恒流泵以10 ml/min的速度开始从心脏灌注温生理盐水，以清除血液，并开始计时，直至回流管流出晶莹明亮的液体，记录时间和生理盐水的使用量。然后用4 % 多聚甲醛以5ml/min的速度灌流15min，并分别在第5 min、第10 min、第15min夹闭前腔静脉，暂停灌流1 min，
石蜡包埋(小鼠脑组织)
石蜡包埋 放入4%的多聚甲醛中过夜（12h）； 12小时（注意水流不需要太大，不可将水流直接冲击组织） 60%酒精4h白天（或者60%酒精4℃过夜12h）→ 第三天：→70%酒精4h→80%酒精4h→90%酒精4h→95%酒精4℃过夜(不一定12小时) → 第四天：→100%酒精Ⅰ2h→100%酒精Ⅱ2h→100%酒精Ⅲ2h→ 5+3 min→二甲苯Ⅱ5+3 min→二甲苯Ⅲ 5+3 min→二甲苯Ⅳ 3+2 min→ （此处注意，在透明过程进行到此处时，应在浸完后拿出脑组织观察一下透明是否彻底，一般来说透明完全的脑组织是呈现为一个通体琥珀状，如果是发现脑组织内部仍呈现不通透的白色则继续酌情追加浸泡（透明）时间） 2h→软蜡Ⅱ2h→软蜡Ⅲ 2h→ 备注：1、软蜡是指熔点48-50℃的石蜡，中蜡是指熔点58—60℃的石蜡。在包埋前应该提前将各种蜡准备好，放在对应的蜡缸里融好，注意不要加热太长时间。待蜡完全融好后关
上煤气，冷却至烧杯上沿不是太烫手且蜡也未凝固是将蜡挪到６０℃温箱里备用。在融蜡时要注意通风橱使用规范。 2、包埋组织块时要注意动作熟练紧凑，时间过长就会导致蜡温不够，影响包蜡质量。放组织块时要注意切面一定要放正确，待切的面朝向包埋铁框面。包埋时勿将气泡带入。可以稍微倾斜一些放置塑料包埋框。 3、酒精串缸结束后，可以将组织拿出一部分出来观察一下是否切面平整，是否厚薄一致，以免影响透明的整齐度，导致组织透明的时间不一致。 ４、酒精串缸结束后，把包埋盒用滤纸尽量弄干，然后再往二甲苯中放。 5蜡块包埋完成后不要急于挪动，待蜡块凝固后再将蜡块放到－２０℃冰箱里冷藏10ｍｉｎ，以利于将铁框和包埋盒分离。
取小鼠脑组织完整版
取小鼠脑组织 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2.?步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。 先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1)??小鼠称重，以每克小鼠 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2)??将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3)??解剖小鼠，暴露心脏。 4)??找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。
小鼠MACO模型制备步骤
小鼠称重，腹腔注射5%水合氯醛0.07ml/10g麻醉，约5min后麻醉，持续时间2h（大小鼠一样即350μg/kg，在小鼠发生呼吸急促，快苏醒时，可适当追加麻药的量，一般情况是原 剂量的10%~20%，现追加剂量为20%~30%） ↓ 仰卧位固定，用碘酒颈部消毒，颈部正中切口（稍偏向手术侧），将小鼠移至解剖显微镜下，调节至合适视野，钝性分离颌下腺体，用小勾拉向一侧，将手术侧用枪头垫起，便于操作 ↓ 钝性分离左侧ＣＣＡ，用活结结扎，可过血（注意：分离时先将动脉表面的鞘膜用镊子钝性分离，后取线结扎，避免损伤迷走神经、气管和颌下腺体背面的静脉窦，分离一个就用线结 扎） ↓ 游离出ＥＣＡ，结扎ＥＣＡ的远心端，在近心端做一个活结，可过血（便于暂时固定线拴，并在进线完成后结扎线拴）；游离结扎ＩＣＡ打活结，不过血 ↓ 拉紧颈总活结，不过血，用显微剪在ＥＣＡ主干上剪一小口，将线拴沿切口插入ＥＣＡ近心端至ＣＣＡ内，拉紧结扎线（插入栓线时，栓线头端与ECA开口处垂直插入，便于进线） ↓ 自远端剪断ＥＣＡ，将线拴轻轻回拉后翻转一定角度，使ＥＣＡ与ＩＣＡ成钝角（翻转时， 动作要轻，注意两支镊子间的配合） ↓ 经ＣＣＡ分叉处将线拴送至ＩＣＡ后，松开ＩＣＡ上的结扎线，将线拴缓慢推进（插入栓子时，可用镊子夹取颈外动脉段端，稍微向外侧牵拉，动作要轻，便于栓子进入颈内动脉；栓子假如进入翼腭动脉，将栓子轻轻回拉，用镊子将血管轻推向中心侧，辅助栓子进入颈内动脉，进线长度至颈总分叉处算起约９～１０ｍｍ，插栓子时，控制小鼠麻醉，否则小鼠挣扎 易使栓子脱出） ↓ 扎紧栓线进线端，防止线拴脱出 ↓ 剪断外部多余的结扎线，将腺体归位，闭合创口，用棉签头部棉头滴加生理盐水保湿 ↓ 脑缺血１ｈ后，缓慢拉出线拴（动作要轻柔，防止栓子脱落），结扎ＥＣＡ，解开并移去ＣＣＡ的结扎线，ＭＣＡ可恢复血流，实现缺血后血流再灌注（拔栓子时，一定要保证小鼠在麻醉状态，否则小鼠在拔栓子时挣扎，易使结扎线脱出，造成出血或牵拉扯断血管出血） ↓ 缝合皮肤，将鼠单笼放置复苏，注意术后保暖 ↓ 不定时观察小鼠状态，若出现死亡，马上解剖查找死亡原因 ↓ ２４ｈ后，对小鼠神经行为功能进行评估 ↓ 将小鼠麻醉灌流后取脑，放入－２０℃冰箱冷冻约１０ｍｉｎ后取出切片
神经实验5 小鼠脑片免疫组织化学
实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法） 实验 一、实验目的 了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验 操作步骤。 二、实验原理 免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。 三、实验器材 略 四、实验步骤 1. 载玻片准备 将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。盖玻片直接泡酸，其余处理步骤同载玻片。处理后的载玻片用稀释度为
2014-9 神经生物学实验报告-动物脑的立体定位技术
脑立体定位技术及切片制备 一、实验目的 通过本实验，了解动物脑立体定位及切片制备，并基本掌握动物脑立体定位技术及切片制作。 二、实验设备及要求 实验分两部分： Ⅰ大鼠脑立体定位（纹状体） [器材和药品] 立体定位仪、10％水合氯醛溶液、1ml注射器、手术刀、粗剪刀、组织剪、止血钳、牙科钻或骨钻、金属定位针、脱脂棉花、3%双氧水（H2O2）、生理盐水、75%酒精，墨水。 [实验动物] 雄性SD大鼠（200-300 g） Ⅱ大鼠脑切片制备 [器材和药品] 器械：手术刀、组织剪、止血钳、咬骨钳、无齿钳、5ml注射器、6号针头、灌注瓶、恒冷切片机 液体：4％多聚甲醛溶液 三、实验步骤 Ⅰ大鼠脑立体定位（纹状体） 1. 立体定位仪的一般校验
2. 动物麻醉：动物称重后，水合氯醛溶液按 3.6ml/kg作腹腔注射麻醉。 3.头部固定： （1）插入耳棒：先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样插入固定另一耳棒。检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否对称，轻移耳棒使两侧刻度一致头位完全居中，再次固定耳棒。三个 标准检测是否固定成功：鼻对正中，头部不动，提尾不掉。 （2）固定上颌：将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部，均不应出现移动。通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上，并使前后囟在同一水平线上。 4. 开颅：剪去头部的毛，用75%酒精棉球作头部皮肤的消毒，沿矢状缝作切口，剥离筋膜及肌肉，推开骨膜，并用3%双氧水洗净，用干棉球擦拭，暴露
骨缝，止血。 5. 脑内核团定位: （1）根据脑图谱，确定所要纹状体的立体位置，（纹状体：前囟前1 mm, 旁开2.5 mm, 深3.5 mm）。 （2）用定位针参照中线和前后囟在颅骨上标记进针的部位后，在指定位置钻孔，有突破（落空）感后，停止钻孔。 6. 定位标记及组织学鉴定： （1）定位标记：根据定位坐标，插入微量注射针，注入染料。