杆状病毒

杆状病毒

关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒

杆状病毒就是一类在自然界中专一性感染节肢动物得DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究得不到20种。杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。DNA复制后组装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源DNA 插入，因此就是表达大片段DNA得理想载体。其中，用作外源基因表达载体得杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m得包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：

一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，

另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形式，昆虫往往就是食入污染OV得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10、5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究最深入得就是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。 AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。

1、杆状病毒基因组得结构与功能研究

杆状病毒基因组为双链环状DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装

在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白与髓核(COle)。其中衣壳蛋白就是杆状病毒粒子得主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子与与其密切相关得碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序得超螺旋结构。

目前已知基因组全序列得杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。目前AcMNPV基因组得研究最为深入，它就是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。AcMNPV基因组得基因组织(gene organization)较为复杂，基因组得不同区域具有功能分化，基因得分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等得重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间得不完整回文序列及其两侧各约20bp得序列构成。同源区就是杆状病毒基因组普通存在得功能域结构，对于基因表达得调节具有增强作用，同时也就是DNA复制得原点。

杆状病毒中现已鉴定得基因近70种，可分为结构蛋白基因与非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如polh、P10、gp64、p6、9、gp41、vp39等基因。非结构基因中，与DNA复制相关得重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用得基因主要有ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。这些代表性基因与其功能得关系见表1。

2．杆状病毒载体表达系统得特点

AcNPV病毒用作外源基因得表达载体，通常就是通过体内同源重组得方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录与翻译，一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒得感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒得功能。杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白得表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。相对其她表达系统它具有以下几个方面得特点：

①组蛋白具有完整得生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达得

外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键得搭配及寡聚物得形成提供良好得环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

②②能进行翻译后得加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整

得翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段得切割与分解等，修饰得位点与天然蛋白在细胞内得情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生得糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰得寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目得蛋白得活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面得理想模型。

③③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出得特点

就就是能获得重组蛋白高水平得表达，最高可使目得蛋白得量达到细胞总蛋白得50％。④能容纳大分子得插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大得基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳得外源基因长度得上

限。

④⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时

表达多个基因得能力。既可采用不同得重组病毒同时感染细胞得形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性得异源二聚体或多聚体。另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切得功能，能表达基因组DNA；还有对重组蛋白进行定位得功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性得蛋白时可能优于其它系统。

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3．杆状病毒载体得重组与筛选

杆状病毒由于基因组庞大，外源基因得克隆不能通过酶切连接得方式直接插入，必须通过转移载体得介导．即将极晚期基因(如多角体基因及其边界区)克隆入细菌得质粒中，消除其编码区与不合适得酶切位点，保留其5’端对高效表达必需得调控区，并在其下游引入合适得酶切位点供外源基因得插入，即得到转移载体。将要表达得外源基因插入其启动子下游，再与野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。而将外源基因整合到病毒基因组得相应位置，由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体得病毒空斑区别开来，这就就是最初得筛选重组病毒得方式。但由于重组效率较低(0、1％-1％)，表型差别不显著，应用上有一定得困难。为此，经过不断探索，在重组杆状病毒得筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。

3.1．半乳糖苷酶得蓝白筛选

1990年，Vialard等在多角体基因得上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒得筛选。1990年，Kins提出了线形化技术，其原理就是线形化得杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内得同源序列进行同源重组得能力。如果同源序列位于线形化杆状病毒得两端，则基因组即可环化恢复完整得感染性，使阳性重组率大大提高。

蓝白斑筛选

蓝白斑筛选就是一种基因工程常用得重组菌筛选方法。

野生型大肠杆菌产生得β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖与深蓝色得物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化就是鉴定与筛选得最直观有效得

方法。

设计适用于蓝白斑筛选得基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌得染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶得基因突变，造成其编码得β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸得短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选得载体具有一段称为lacz'得基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶得启动子；编码α肽链得区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链得区段中，就是外源DNA得选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链得功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性得β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'得质粒后，质粒lacz'基因编码得α肽链与菌株基因组表达得Ｎ端缺陷得β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同得作用X-gal生成蓝色物质得能力，这种现象即α-互补。

操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中得β-半乳糖苷酶得启动子，在含有X-gal得固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上就是携带空载体得菌株产生得表型。当外源DNA（即目得片段）与含lacz'得载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中得X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。

实验中，通常蓝白筛选就是与抗性筛选一同使用得。含X-gal得平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应得抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化得菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒得菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒得菌，即目得重组菌，长成白色菌落

3、2．体外酶促定位重组

Cre-Loxp系统最早由Sternberg等最早建立，噬菌体Pl含有1个重组位点Lox(1ocus of(rossover)与1个Cre酶基因，其产物(Cre酶)为重组所必需：Cre酶已被克隆纯化；Lox序列已被测定由34个核苷酸组成，其两端为13 bp 得反转重复序列。中间为8 bp得非回文序列。将此序列引入AcNPV基因组即得vAclox，转移载体引入lox后可获得plox。

vAclox与plox在Cre酶存在条件下，两者即可发生体外定点重组，而将载体上得相应序列转到病毒得基因组中(这就是1个可逆酶促反应)，将反应混合物转染草地夜蛾(spodoptera frugiperda)sf细胞中，即可得到高比例得重组子代病毒。这个方法得特点就是体外重组，通过控制反应得条件可达到很高得重组率。但由于重组就是位点特异性得，反应产物往往就是转移载体多次插入亲代病毒得结果，因而要进行多轮空斑实验纯化病毒。

3.3.Bacmid

后来Luckow等又发明了一种新得杆状病毒重组技术。她们根据F因子载体原理，用类似于酵母体内重组得方法，构建了一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。Bacmid含有F因子复制子(可在大肠杆菌中复制)、卡那霉素抗性基因及Tn7转座位点attTn7。转移载体中，外源基因置于杆状病毒启动子之下，两端分别为Tn7得左右端。以其转化含Bacmid得E coli菌株，由辅助质粒提供反式作用发生转座，而将外源基因转到Bacmid得attTn7位置。这种重组了外源基因得Bacmid转染得昆虫细胞，可得到100％阳性重组病毒。这种方法都就是在大肠杆菌中进行得，非常简便，由于没有本底干扰，同样不需进行空斑纯化。

缺点就是F因子提取不很方便，其稳定性也有待于观察。

英文全称 Baculovirus plasmid 中文解释杆状病毒质粒 [带有杆状病毒基因组得质粒，可在细菌与昆虫细胞之间穿

梭]

Baculovirus plasmid简易提取方法：

挑白斑摇菌8h左右（一般会过夜摇），取2ml菌液，12000rpm ，30s，弃上清即可

1．溶液I—溶菌液：（加 300ul 将离心完得菌液混匀）

溶菌酶：它就是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁得主要化学成分肽聚糖中得β-1,4糖苷键，因而具有溶菌得作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液得粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA得降解作用（DNase作用时需要一定得金属离子作辅基）;（2）EDTA得存在，有利于溶菌酶得作用，因为溶菌酶得反应要求有较低得离子强度得环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液(加300ul ，裂解5min，轻柔混匀，最好不要拿枪吹，上下颠倒混匀就行)：NaOH：核酸在pH大于5，小于9得溶液中，就是稳定得。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键得解离而变性。在溶液II 中得NaOH浓度为0、2mo1/L，加抽提液时，该系统得pH就高达12、6，因而促使染色体DNA与质粒DNA得变性。

SDS（2%）：SDS就是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上得脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中得核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质得复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但就是SDS能抑制核糖核酸酶得作用，所以在以后得提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3、溶液III--3mol/L NaAc（pH

4、8）溶液（主要就是沉淀蛋白得，加后轻柔混匀，冰上放置15min）： NaAc得水溶液呈碱性，为了调节pH至4、8，必须加入大量得冰醋酸。所以该溶液实际上就是NaAc-HAc得缓冲液。用pH4、8得NaAc溶液就是为了把pH12、6得抽提液，调回pH至中性，使变性得质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐得3mol/L NaAc有利于变性得大分子染色体DNA、

RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者就是因为中与核酸上得电荷，减少相斥力而互相聚合，后者就是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小得钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4、将冰上放置得混合液12000rpm，10min离心，取上清加异丙醇（1：1），然后冰上放20min左右，再12000rpm离心10min

5、弃上清，加预冷得75%乙醇1ml洗一下（加完后应该能瞧到在EP管底部有一小块白色得沉淀）

6、然后弃乙醇，留下白色沉淀（如果沉淀飘起，可以再12000rpm离心），凉干，加50ul左右TE或双蒸水

溶解片刻即可。（一般情况下应该有80-100ng/ul）

3、4．TK基因

胸苷激酶可将核苷类似物转变成得有毒得中间体而抑制病毒得复制。该核苷类似物作为疱疹病毒编码胸苷激酶(HSV—TK)得底物，能特异性地抑制单纯疱疹病毒、巨细胞病毒与EB病毒得复制。由于这些类似物对病毒得胸苷激酶有高度得选择性，而细胞自身胸苷激酶对这些类似物得结合常数很低，故能选择性地杀死表达HSV-TK基因得细胞。

Loss of the tk gene TK基因缺失

TK基因编码区大片段缺失 tk基因（包括HSV－tk，VZV－tk）编码胸苷激酶（TK），病毒得TK除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸普酸，还可以催化一些核苷类似物磷酸化，这些磷酸化后得核苷类似物对哺乳细胞有根强毒性。近年，许多学者用多种载体将病毒止基因转入肿瘤细胞，配合核苷类似物作为前药治疗肿瘤，动物实验效果肯定，现正进入临床研究。

3.5．Neo基因

Neo抗新霉素得抗药基因,一般用来作为基因表达载体得筛选、表达目得基因得载体同时带有该基因、这样在培养液加入新霉素、没有被转染得细胞没有抗药性,就不能存活、

Neo就是经典得显性选择标记，这就是一种细菌编码得磷酸转移酶基因，可使氨基糖苷类抗生素G418失活。后者又就是一种蛋白质合成抑制剂，可干扰真核细胞80S功能。Neo曾被引入几种脊椎动物病毒(如痘苗病毒与EB病毒)得基因组中，作为选择标记。1989年，Jarls将Neo引入sf细胞染色体中而得到G418抗性得细胞系，说明Neo可作为选择标记用于重组病毒得筛选。本方法与TK基因相

比较略显繁琐，需经连续传代，但其不用改造辅助病毒，只需在转移载体中引入Neo基因即可。其它如 PCR、DNA斑点杂交及有限稀释法等，也可用于筛选重组病毒。

以上方法各具特点。虽然有些新方法需一定得条件，但一旦建立起来后就可方便、迅速地得到重组病毒，为杆状病毒表达系统得普及应用创造了良好得条件

4 ．影响外源蛋白表达得因素

达与调控，但有关病毒晚期基因高表达与其调控机制目前还不十分清楚。利用多角体基因得启动子表达外源基因，影响表达水平得因素除与病毒本身得因素有关外，还与受感染细胞得种类与生理状况乃至培养基得质量有关。

4、1．病毒得稳定性杆状病毒在细胞中多次传代后，可能引起基因组得变化。最明显得变化就就是形成ov得能力降低。由于细胞间不需要ov形成感染，只需通过BV病毒感染即可。多次传代得病毒也可能出现少多角体(few polyhedfin，FP)表型得变化，一般每个感染细胞只含有10个多角体病毒。其中突变病毒多角体得表达水平也有所降低，应用这种突变病毒会对外源基因得表达带来不利。若重组前病毒就是变异FP，通过肉眼分辨重组与非重组病毒时，有可能发生假象。另外，长期多次传代得病毒也往往引起表达水平得降低，为避免上述情况得发生，要限制病毒得传代次数，一般控制在2-3代以内。

4、2．在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达虽然目前大部分工作就是在细胞培养条件下进行得，当需要大量制备某类表达产物时，最好采用昆虫蛹。因为培养昆虫幼虫远比培养细胞简单、便宜，而且在昆虫体内培养可以提高表达量。一般在幼虫体内得淋巴液中，蛋白含量较在细胞培养基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3得表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高500倍，可能就是细胞培养基中含有得蛋白酶使之降解所致。

4、3．启动子类型在构建转移载体时，使用不同得启动子就需构建相应得同源序列。目前最常用得启动子有晚期Polh(polyhedrin)启动子与P10启动子，还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一目得基因在不同启动子控制下，表达水平会有很大差异。研究发现，分泌类蛋白使用PIO启动子或碱性启动子得效果更好。

4、4．外源基因序列得本身因素能在重组杆状病毒有效表达得外源基因5’端及3’端非编码区越短越好，一般长度在3～400个核苷酸以内。

影响表达得其她因素包括：密码子得使用情况(就是否为昆虫细胞所常用)、mRNA 得稳定性及蛋白质得稳定性等。外源基因附近得序列很重要。Kozak分析了数百个真核序列，得出两点结论：首先，启动子下游第1个ATG常作为起始密码子；其次就是在 ATG附近得序列并不就是随机得。有95％表达得真核基因在ATG前-3位就是嘌呤(而且常就是A)，+4位就是G。如果-3得A或+4得G有1个被嘧啶替代，翻译水平就下降5~l0倍。如果-3位与+4位均被嘧啶所替代，翻译水平就下降20倍。因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G就是高等真核基因起始密码附近得保守序列，其中-3处A最为保守。

4、5．重组病毒基因得表达与调控

多角体启动子控制得外源基因得表达，紧靠上游得序列对基因得转录调节就是最重要得。许多研究表明，当外源基因5 端加有1～58个多角体蛋白得氨基酸序列以融合蛋白形式表达时，效果最好。用高、中与低3种表达得外源基因进行实验得结果表明，保留一部分多角体5’端序列与外源基因以相同得框架相融合，

表达水平最高；如果框架不同，那么从距启动子最近得起始码开始翻译，表达产物水平相对偏低。

5 ．昆虫杆状病毒系统表达外源基因得新进展

1 杆状病毒载体及其表达系统进展

昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时，存在得一个问题就是筛选带有外源基因得重组病毒得效率较低(最初仅0、1％～1％)，而且产物较难纯化。为此，人们设计了各种方法来改进病毒载体，如NPV DNA线性化，体外定点酶促重组，以及酵母-昆虫细胞与大肠杆菌-昆虫细胞得穿梭载体得开发等。其中Posse 等设计得重组-救活可线性AcNPV病毒载体BacPAK6得重组效率较高，高达80％以上，具有重要得应用价值。

该重组技术得基本原理为：先找一个在AcMNPV基因组中不存在得Bsu36 I 酶切位点，采用体外突变，在多角体基因两侧得非必需基因ORF603基因与必需基因ORF1629基因中各引入一个Bsu36 I位点，然后通过重组将突变了得由ORF603基因、多角体基因启动子控制得半乳糖苷酶基因、ORF1629基因引入AcNPV 基因组，获得重组病毒载体BacPAK6。(BacPAK6)DNA经Bsu36 I酶切而破坏了必需基因OBF1629，因而靠自身环化不能成活，必须与携带多角体蛋白基因启动子控制得外源基因与OBF1629基因得转移载体发生重组，病毒才能复制而救活，因此，该法得重组率很高。这一系统现已扩展到了BmNPV表达系统。

易咏竹等副通过克隆得家蚕核多角体病毒解螺旋基因DNA，与重组救活可线性化得苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒(BacPAK6)DNA在昆虫细胞中发生重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf-21得宿主域扩大得昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因得转移载体Pvl1393phy在家蚕细胞中得重组率达90％以上。

此外，Bac—to．Bac表达系统就是效率很高得表达系统，它利用穿梭质粒bacmid 在大肠杆菌中高效复制后，再提纯用于转染昆虫细胞，大大缩短了时间。王汉中等根据BactoBac表达系统得基本原理，也构建了一种新颖得棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统(HaBac—to—Bac)。该系统中供体质粒pFastPhP10中插入了带有多角体启动子序列得完整得多角体蛋白基因，因而多角体蛋白基因得表达与包涵体得形成也可作为转染成功得重要识别标记等，这就是商品化得AcBac—to．Bac系统所不具备得。

目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统得细胞系较多，但应用较多得细胞系就是秋粘虫s、frugiperda卵巢组织得细胞系sf-9，以及家蚕细胞系。洪华珠等建立了一株高水平表达重组蛋白得昆虫细胞系HNU—Tn、FB1。它就是粉纹夜蛾Trichoplusia ni脂肪体得传代细胞系。在辅以5％胎牛血清得商品无血清培养基Excell400中，该细胞群体得倍增时间为22、9h，最高密度可达2、2×106／ml，表达由AcMNPV构建得重组p、半乳糖苷酶得水平达(225、5±13、4)IU/ml。该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好得“高五”细胞(BTI．Tn．5B1-4)相当，就是一株很有价值得细胞系，具有广阔得应用前景。

另外，一些影响杆状病毒系统表达外源基因产物得因素在近两年得到了研究。杆状病毒吸附宿主细胞得动力学参数就是影响细胞感染效果与表达物产量得因素之一。

Petricevich等以表达轮状病毒得重组蛋白VP4为例，对病毒吸附动力学得参数进行了研究，发现影响细胞感染效果得主要参数就是胎牛血清浓度。不用胎牛血清或经高温处理后再使用，反而可以获得更高浓度得表达产物。

重组病毒感染sf-9得效果与细胞周期有关，Saito等对GFPuv基因在杆状病毒系统中表达得研究表明，当在宿主细胞得G、期感染时，细胞内得荧光强度就是在G2／M期感染得1、3倍，同时在宿主细胞得G。/S期感染时，感染量就是在G：/M期感染得1．5-1．8倍。该研究结果对于选择病毒感染宿主细胞得时期有一定得借鉴意义。

01ejnik等讨论了高渗透压对昆虫细胞表达重组蛋白产量得影响。采用补料分批培养发现，Trichoplusia ni BTI、TN、5B1-4(Tn-5)细胞具有很强得耐高渗透压能力，表达得重组核蛋白产量比等渗环境下得高出72％。该结果对于提高重组蛋白得产量具有重要意义，可能得原因就是高渗透压下，葡萄糖得比耗率增加，细胞内重组蛋白得合成代谢更加旺盛。

另外，杆状病毒易被紫外线钝化，Dustin等将海藻病毒得嘧啶特殊二聚物糖基化酶(CV．PDG)用杆状病毒(AcMNPV)表达后，发现重组AcMNPV受紫外线钝化得影响比野生型降低了3倍。该研究为提高杆状病毒抗紫外线能力提供了一个可行得办法。

备得翻译后加工修饰系统与高效表达外源基因得能力等特点，现已广泛用于一些在其它表达系统表达有困难得高价值蛋白质得表达。新近报道得如人骨骼肌基因突变而产生得a-辅肌动蛋白，一直未找到较好得系统来表达它。Akkari等首次采用杆状病毒系统实现了它得高效表达与纯化。钙运转调节肽(caltfin)在动物授精过程中可以抑制钙流人精子，避免过早地产生顶体反应而导致授精失败。目前获取它得唯一方法就是从动物体内提取，但如能通过生物技术手段大量生产，无疑具有广阔得应用前景。Phan等首次用昆虫杆状病毒系统高效表达了cahrin，并筛选出了有效得纯化方案。新近用杆状病毒表达系统表达成功得其它一些高价值蛋白

由于昆虫杆状病毒表达系统独特得性质，现已被广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域中。近几年得研究发现，AcNPV病毒也可以将外源基因导入哺乳动物得细胞，如人得肝细胞。这意味着AcNPV病毒可能成为哺乳动物基因治疗得媒介载体，因此杆状病毒有望在未来人类得基因治疗中得到应用。另一方面，利用昆虫杆状病毒系统进行重组杆状病毒杀虫剂得研究也仍然具有十分重要得意义。由于昆虫杆状病毒对人、畜安全，不易引起广泛规模得生态平衡得破坏等特点，昆虫病毒杀虫剂已成为当今生物农药研究与开发得热点。但野生型杆状病毒有必要进行重组改造，因其杀虫速度较慢。

糖侧链甘露糖得成分较高，而复合寡糖缺乏。在杆状病毒系统得基础研究与应用

技术方面，目前杆状病毒得基因组学，特别就是功能基因组学得研究相对薄弱，有关病毒晚期基因得高表达与调控机制等仍不明了。另外杆状病毒可能得其它宿主还不十分清楚，表达产物得纯化与多元表达等方面得技术还不够理想等，都需要今后进一步研究。当前应重点加强杆状病毒得基因组学，特别就是功能基因组学得深入研究，一就是有助于杆状病毒载体得进一步改良，二就是随着一些调节外源蛋白表达得基因结构与功能得深入了解，有利于外源基因得高效表达与调控。

昆虫杆状病毒表达系统安全性好，表达水平高，可进行翻译后加工及表达产物得异源性小，就是一种非常理想得真核表达系统。目前研究及应用最多得杆状病毒为AcNPV，尽管它可感染30多种细胞，但主要在sf细胞中繁殖，因此，对于其它细胞就是否易感，以及外源蛋白得表达水平、转录后加工等问题还需深入研究。如果在重组产物纯化过程中混有昆虫细胞得蛋白，则可能在应用时引起过敏反应。所以，如何进一步纯化表达产物，将其致敏原性降到最低限度就是值得重视与探讨得问题。

由于该系统独特得性质，使其被广泛地应用于基因工程、药物开发、疫苗生产、表达免疫活性分子与某些致瘤病毒蛋白以及基因表达调控研究等多个领域中。迄今为止，已有数百个基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达，为获得大量得类原型蛋白及其功能研究提供了可能。

杆状病毒表达系统简介

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。 昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。 近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。 杆状病毒基因组的结构和功能研究 杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角

昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制

Science of Sericulture 蚕业科学 收稿日期：2013－06－14接受日期：2013－06－30资助项目：国家自然科学基金项目（No．31272506）。第一作者信息：王国宝（1987－），男，博士研究生。 E-mail ：gbwang0216@163．com 通信作者信息：吴小锋，教授，博士生导师。 E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn * Corresponding author．E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn 2013，39（5）：1005－1010 ISSN 0257－4799；CN 32－1115/S E-mail ：CYKE@chinajournal．net．cn 昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制 王国宝吴小锋 （浙江大学动物科学学院，杭州310058） 摘要最近的研究发现杆状病毒感染能够诱导宿主昆虫产生行为变化，典型的表现为寄主运动能力的增强。从生物学的 角度分析，这是杆状病毒有利于自身传播的操控策略。本文综述了3种典型杆状病毒诱导宿主昆虫行为发生变化的现象以及其可能的分子机制。其中，舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV ）的egt 基因能够引起吉普赛舞毒蛾（Lymantria dispar ）出现异常活跃的攀爬行为；而家蚕（Bombyx mori ）与甜菜夜蛾（Spodoptera exigua ）幼虫分别被家蚕核型多角体病毒（BmNPV ）和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV ）感染后，出现爬行异常活跃的行为则是由于病毒中ptp 基因的存在。不同种类的杆状病毒对宿主昆虫行为的操控策略不同，对杆状病毒操控宿主行为的分子机制的探索是一个新的研究领域，其研究成果不仅有助于揭示杆状病毒与寄主的互作关系，而且将为农林病虫害的生物防治提供新的参考策略。关键词 杆状病毒；egt 基因；ptp 基因；昆虫宿主；行为 中图分类号 S884．5+1 文献标识码 A 文章编号0257－4799（2013）05－1005－06 Host Behavior Alteration and Its Underlying Molecular Mechanism upon Infection of Insect Baculovirus WANG Guo-Bao WU Xiao-Feng * （College of Animal Sciences ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，China ）Abstract Recent studies discovered that baculovirus infection could induce behavior alteration on their host insects．A typ- ical consequence of it is the enhanced locomotor activity．In view of biology ，it is a manipulatory strategy of baculovirus that favors its own transmission．This paper describes behavior alterations in host insect caused by three types of baculov-irus and possible molecular mechanisms underlying the alterations．Among them ，the egt gene of LdMNPV is essential for the hyperactive climbing behavior of Lymantria dispar ，while the ptp gene of BmNPV and AcMNPV is the cause of abnor-mal wandering behavior of Bombyx mori and Spodoptera exigua lavrae．Different types of baculovirus have various mecha-nisms in manipulating host insect behavior．Studies on the underlying molecular mechanisms of such behavior manipula-tions constitute a new and fascinating research field．It will not only uncover the interactive relationship between baculovirus and their host insects but also provide new strategy for biological control of agricultural and forestry pests /diseases．Key words Baculovirus ；egt gene ；ptp gene ；Insect host ；Behavior 杆状病毒是一个庞大的病毒家族，其基因组大 小在80 180kb 之间，为共价闭合环状双链DNA ，包含100多个基因。有趣的是，其中超过10%的基因是从原始宿主中通过水平转移获得的，这些基因 被利用后更加有利于病毒的复制和传播［1］ 。已发现的几百种昆虫杆状病毒分为杆状病毒属（NPV ）和颗粒体病毒属（GV ）2个属。杆状病毒在感染循环过程中会产生遗传物质完全一致但表型具有差

杆状病毒介绍

杆状病毒 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

杆状病毒——昆虫细胞表达系统

实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 摘要 本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。 说明 定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。

杆状病毒表达蛋白

杆状病毒表达蛋白 1 donor vector的构建 1.1 外源基因的连接 1.2 转化 1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。 1.2.2 冰浴30min。 1.2.3 42℃，90s。 1.2.4 马上放入冰浴中，2min。 1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。（LB 37℃预热） 1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。 1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。 1.3 鉴定 1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。 1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。 1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。 1.3.4 取1ml菌液测序。 1.4 菌种的保存 1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。 1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。 1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。 1.4.4 -80℃保存。 2 转座 2.1 转座反应 2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。 2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。 2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。 pFastBac TM construct 1ng(5μL) pFastBac TM control 1ng PUC19 control 50pg 2.1.4于冰中放置30min。 2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。 2.1.6 马上放入冰浴中，2min。 2.1.7 加入900μL室温LB培养基。 2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。 2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。 2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。

杆状病毒表达系统(The Baculovirus Expression System)

Baculovirus Facility in Cambridge The Baculovirus Expression System The Baculovirus Expression Vector System (BEVS) has been widely used in research and scientific industrial communities for the production of high levels (up to 1000mg/mL) of properly post-translationally modified (folding, disulfide bond formation, oligomerization, glycosylation, acylation, proteolytic cleavage), biologically active and functional recombinant proteins. The Baculovirus Expression Vector System is based on the introduction of a foreign gene into nonessential for viral replication genome regio n via of homologous recombination with a transfer vector containing target gene. The resulting recombinant Baculovirus lacks one of nonessential gene (polh, v-cath, chiA etc.) replaced with foreign gene encoding heterologous protein which can be expressed in cultured insect cells and insect larvae. Baculovirus Facility in Cambridge offers services on protein expression and production - from recombinant baculovirus production to large scale protein expression. Several features make the Baculovirus Expression Vector System attractive for researchers: - High levels of heterologous gene expression are often achieved compared to other eukaryotic expression systems, particularly for intracellular proteins. In many cases, the recombinant proteins are soluble, post-translationally modified and easily recovered from infected cells late in infection when host protein synthesis is diminished. -The cell lines used for AcMNPV propagation grow well in suspension cultures, permitting the production of recombinant proteins in large-scale bioreactors. - Expression of hetero-oligomeric protein complexes can be achieved by simultaneously infecting cells with two or more viruses or by infecting cells with recombinant viruses containing two or more expression cassettes. - Baculoviruses have a restricted host range, limited to specific invertebrate species. They are safer to work with than most mammalian viruses since they are noninfectious to vertebrates.

杆状病毒表达系统及其应用进展

综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第10期 杆状病毒表达系统及其应用进展 韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳 (中国农业科学院生物技术研究所,北京100081) 摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。 关键词: 杆状病毒 BEVS 表达 Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng (B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081) Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e . K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on 收稿日期:2010 04 26 基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863?计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n 杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约 80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1] 。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V ) 和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2] 。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工 程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物 细胞表达系统)之一。 杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。 1 重组杆状病毒的构建和纯化 最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的

杆状病毒对昆虫有什么危害

杆状病毒对昆虫有什么危害 杆状病毒感染会让昆虫患病，目前发现的有： 1.颗粒病体 根据39蜂疗网调查目前仅见于鳞翅目昆虫。其自然侵染过程与细胞病变均类似于核型多角体病，但病虫症状与核型多角体病不同，病虫皮色变灰或乳黄，虫尸以腹部前端1～2对腹足握持植物枝条，虫尸以“∧”型倒挂。幼虫被感染后至少至4日龄才发病，死于化蛹前，病虫生存期常大于21天。 2.核型多角体病 现已发现280余种核型多角体病，约占昆虫病毒病总数的40％，大多侵染鳞翅目昆虫。 核型多角体病的自然感染过程为：昆虫吞食了被病毒污染的食物，病毒即进入中肠，在昆虫中肠碱性消化液的作用下，多角体被溶解，释放出病毒粒子，游离病毒粒子的囊膜与中肠上皮细胞绒毛的膜融合，核衣壳侵入细胞中，脱壳后，病毒的DNA经细胞核膜的核孔侵入细胞核内，开始其增殖过程。 随病毒的增殖，细胞表现的病理变化为：细胞核内染色质凝集成块，核仁增大，数目增多，RNA合成旺盛，合成出的RNA不断转移到细胞质中；凝集的染色质块集中于细胞核中部形成网状结构的病毒发生基质，在病毒发生基质中病毒的DNA大量合成。随后，在病毒发生基质表面核衣壳开始装配，并不断移到细胞核周围，大部分包入新形成的囊膜内，成为成熟的病毒粒子。最后在病毒发生基质周围形成一个环状带，在带上开始多角体的结晶，病毒粒子随机地包入多角体中，多角体约到一定大小后停止生长，在其表面形成了一层难溶的多角体膜。从多角体开始形成时起，病毒发生基质开始缩小，待多角体充满细胞核后，病毒发生基质消失，核膨大，破裂，细胞随之崩解。 小部分未被包入多角体的病毒粒子，可随细胞崩解进入昆虫血体腔。血体胶中病毒粒子的靶细胞为：气管皮膜细胞，脂肪细胞，肌肉细胞，真皮细胞，血细胞及神经、生殖腺、丝腺等几乎所有组织的细胞。 最后新形成的大量多用体充满了昆虫整个血体腔。 蛀虫幼虫被感染后，4～5天体液是乳白色，厌食，不喜运动，多数移到植物枝条顶部后死亡，虫体软化，脚失去握持力，仅以1～2对臀足附着在植物枝条上，最后松弛倒挂死之。体内组织完全溶解，变成黑褐色，表皮完整但脆弱易破裂。从感染到处亡约1～2周。

杆状病毒

杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽 然已发现用于害虫防治。DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。插入，因此就是表达大片段。该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证 病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒 就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该 病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。 AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期 基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复 制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。 1、杆状病毒基因组得结构与功能研究 以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。DNA 杆状病毒基因组为双链环状 在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。 *一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CA T基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点： 使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白 选择pFastBac菌体（Vector）： 大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。

指南用途： 指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒 3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白 重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。 Bac-to-Bac表达系统 表达系统的成分： 表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA *系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac TM菌株。基于pFastBac TM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7 *第二个主要结构是Ecoli的DH10Bac TM品系，用来作为pFastBac TM菌株的宿主。DH10Bac TM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBac TM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBac TM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。 如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。 杆状病毒菌株： 病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括： *一个低拷贝的微型F复制子 *卡那霉素的抗性标记 *一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。 杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG 存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+） 辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。 图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达

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昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 ●杆状病毒表达系统介绍 ●杆状病毒蛋白表达系统的优势 ●杆状病毒表达载体系统（BEVS） ●杆状病毒表达宿主细胞 ●表达优化条件 ●翻译后修饰对蛋白表达的影响 ●高通量表达 ●总结

杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态： 一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另 一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期 ●早期（0‐6h PI） ?核衣壳迁移到细胞核 ?病毒DNA释放 ?开始早期基因表达 ●晚期（6‐24h PI） ?更多DNA复制 ?新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 ?的过程中得到囊膜蛋白 ?产生新的出芽病毒 ●极晚期 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia ?出芽病毒减少 ?核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs ?MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形 成包含体病毒。 多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。