南方医科大学微生物实验报告

2016年南方医科大学医学微生物学实验报告

日期2016年5月22号

一、实验目的

1、掌握培养基制备的原则和一般方法。

2、掌握病原菌的分离与培养方法。

3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。

4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。

5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。

6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。

7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。

二、实验器材

1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、

5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯

2、脓汁标本1支，粪便标本1支；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个，伊红美蓝平板2个，接种环，酒精灯

3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）

4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1 本，载玻片4张，染色瓶，染色架

5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4 个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把

6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。

三、方法与步骤

1、培养基的制备：

（1）营养琼脂培养基的制备：称量11.4g琼脂，置于三角烧瓶中，加入300ml蒸馏水，分2瓶装，用于倒平板。

（2）营养琼脂培养基的制备（用于制作斜面）：称量2.9g琼脂，置于三角烧瓶中，加入75ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管5ml。

（3）肉汤培养基的制备（用于制作液体培养基）：称量1.1g琼脂，置于三角烧瓶中，加入50ml蒸馏水，放在电炉上，煮沸1次，分15支小试管装，每支试管5ml。

（4）半固体琼脂培养基的制备：称量1.7g琼脂，置于三角烧瓶中，加入60ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管4ml。

2、细菌的分离培养

平板划线分离法

甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）

丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）

步骤：①接种环烧灼灭菌。②取标本3～6ul。③平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。

④接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。⑤烧掉接种环上多余的标本。⑥转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。⑦转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。

⑧转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。⑨划第五区。

3、细菌的纯培养

斜面接种分工

甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面

丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面方法：接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。

4、细菌的形态学检查

涂片→干燥→固定→染色

(1)涂片→干燥→固定

甲→黄色，紫黑。乙→白色，粉红。

丙→黄色，紫黑。丁→白色，粉红。

方法：涂片：①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm 小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。→干燥→固定：手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2?3秒钟。

(2)革兰染色

涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。

油镜使用方法：10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3)混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。

5、液体培养基接种（肉汤接种）

甲→金黄色，乙→白色，

丙→紫黑，丁→粉红。

方法：（1)接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；（2)在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌；（3)标记：组号，颜色6、细菌的生化试验等

（1）细菌的糖发酵实验：

①在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好标记

②在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标记

③在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好标记

④在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标记

步骤：①用砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处，切割一道切痕。②两手握住发酵管将管子折断。管口烧灼灭菌。③接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。退出接种针，烧灼灭菌。④管口朝向相同，放置在平皿内。

（2）抗菌素敏感性试验

纸片扩散法

甲→黄色菌液乙→白色菌液

丙→紫黑菌液丁→粉红菌液

方法：①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;?作标记：青、先、庆；?镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。

（3）血浆凝固酶试验

步骤：①取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。②分别用接种环取白色和金黄色菌苔(约2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8～10mm的一层薄菌膜。③立即观察结果。

（4）半固体穿刺接种法

①用接种针取紫黑色菌落垂直刺入半固体培养基，再按原路返回，并做好标记

②用接种针取粉红色菌落垂直刺入半固体培养基，再按原路返回，并做好标记

步骤：①接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。②管口、接种针经火焰烧灼灭菌③37℃下培养18~24小时。

7、细菌的血清学试验、结果分析

玻片凝集试验

①取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远

端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul，

②用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。

③载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。

④观察记录结果：菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性。

四、结果与讨论

（一）实验结果

1.洗手前后对比

图片分析：洗手图不是很理想，上面同学的洗手后与消毒后与预期的不一致，可能是操作不当引起的。

2.细菌的分离培养结果：

(1 )脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。

(2 )粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水

溶性的，不是细菌本身的颜色，紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径2?3mm；粉红色菌落淡粉红色，半透明，直径1?2mm.

图片分析：由于同学都是第一次划线，所以划线都不是很好。

3.细菌的纯培养：

在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本，从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。

从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明，后者透明。

图片分析：中间两组效果不好，可能来自于采菌过少或者划线操作不当

4.细菌的形态学检查:

脓汁标本（左边为白色菌苔，右图为金黄色菌苔）

粪便标本（左图为粉红菌苔，右图为紫黑色菌苔）

镜下观察：

用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。

用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。

6.细菌的生化试验等:

（1）半固体穿刺接种法

图片分析：实验效果与预期一致，但是拍摄效果不是很好。

四组的半固体培养接种的培养图，由于拍摄效果不好，但是依然可以分辨生长的情况。 直线生长的表明无鞭毛。

(2)细菌的糖发酵试验

糖发酵实验结果图.从下至上分别为：

（④粉红→乳糖③粉红→葡萄糖 ②紫黑→乳糖 ①紫黑→葡萄糖）

编号

菌苔 糖发酵管 反应现象 结果描述 符号 甲 紫黑 糖发酵管变黄色有气泡 分解X 糖产

酸又产气

⊕ 乙 紫黑 糖发酵管变黄色有气泡 分解X 糖产

酸又产气 ⊕

丙 粉红 糖发酵管变黄色无气泡 分解X 糖产

酸不产气 +

丁 粉红 ④ 糖发酵管变紫色无气泡 分解X 糖产

酸不产气 -

+：产酸或阳性 ⊕：产酸产气 -：阴性

紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm 和

17mm ，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。

(3)抗菌素敏感试验结果:

图片分析：.3号同学划线最好，本人4号划线不好，还是没有划好。2号同学效果不好，可能取菌过少。

4：浓汁标本中白色菌落3：浓汁标本中金黄色菌落

2：粪便标本中粉色菌落1：粪便标本中紫黑色菌落

药敏试验结果分析

青霉素 头孢曲松 庆大霉素 金黄色 + + +

① ② ③

4

白色+ ±+

紫黑- + +

粉红- + + -：耐药±：中度敏感+：敏感

白色细菌对对青霉素敏感，对头孢曲松中度敏感，对庆大毒素敏感

金黄细菌对青霉素敏感，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感

紫黑细菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感

粉红细菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感

（4）血浆凝固酶实验结果：

金黄色（左）与白色（右）菌苔

1、白色菌苔不发生凝块，容易涂抹。呈均匀乳白状态。

2、黄色菌苔能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋

白,附着于菌体表面,形成凝块，涂抹不开。说明黄色细菌为致病菌。

7.玻片凝集试验：

由实验结果图可看到，生理盐水一端（左）不出现凝集，福氏志贺菌诊断血清一端（右）菌液虽然不是很不明显，但是可以看到任有少量絮状沉淀，表明为阳性。说明粉红菌为福氏志贺菌。

8.结论：

对照对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，血清学分析，说明黄色菌落是金黄色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大肠埃希菌；粉红色菌落是福氏志贺菌。

(二）实验讨论

1.分析：

制备好培养基后，首先采用平板划线分离法，从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。显微镜下，这两株细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落或菌苔颜色，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。最后通过药敏试验，可见不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中金黄色葡萄球菌对青霉素最敏感，而紫黑和粉红细菌对青霉素耐药。

用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固体动力试验，血清学试验结果鉴定，它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。

2.实验的不足之处：

我们的实验在操作上也产生了许多错误和不足。例如平板划线操作失误，导致有的培养基不能分离出单菌落或只有第一、二区有菌落生长。

3.注意事项：

在培养基配制好后，我们需要检查培养基是否合格。

接种环使用前后必须灼烧灭菌：接种环使用前，长期暴露于空气中，会带有许多空气中的杂菌，不灼烧灭菌则会导致实验过程中杂菌污染;使用后接种环上带有实验中的相关细菌，若不及时灼烧灭菌会导致前一菌种对后一菌种造成污染,且实验细菌接触外界污染实验室内的相关物品，同学们接触后很可能带来疾病的危险。

平板储存待用或做细菌培养时，需要倒置:防止平板水分蒸发丢失；防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成；冷凝水中可能含有杂菌，如果滴入平板表面，会影响实验结果。

④用革兰氏染色法染色过程中要严格控制四种染料染色的时间（大约一分钟)，其中涂片与脱色是关键步骤，如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性，如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。流水冲洗时注意水流大小与速度适宜均勻。