烟草基因相互作用实验步骤

瞬时表达

本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。

1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。

注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。

2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。

3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：

0.5M MES 1ml

20mM Na3PO4 1ml

D-葡萄糖50mg

1M 乙酰丁香酮1ul

水（一般情况下最先加入）补齐至10ml

注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。注射缓冲液需要现配现用。

4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。注射缓冲液重悬。

5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。

注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。若叶片内残留的菌液过多，会导致叶片完全萎蔫，所以吸去多余菌液是非常必要的。

6.两天后取小叶烟草叶片，撕下注射部位的表皮，观察荧光的亚细胞定位；或者撕去注射部位的表皮，进行GUS染色或者其他蛋白水平分析。

注意：表皮容易观察，所以荧光观察时选取表皮最为合适；而表皮较为致密，导致GUS染色步骤中的固定液与染色液难以渗透，所以一般情况下撕去表皮，留下叶肉细胞进行检测。

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入 工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时 称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制 鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的

实验一-DNA提取

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

整个基因克隆实验流程完整

一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养 一、实验原理与实验步骤 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 植物材料：烟草植株 药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞 仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子 二、实验方法与步骤

注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。 （2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。 三、培养基配制和灭菌 本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

临床基因检测实验室建设要求

临检实验室建设标准与要求 一、高通量测序（NGS）实验室简介 1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。NGS是下一代测序技术(N EXT G ENERATION S EQUENCING)即高通量测序技术的简称。高通量测序技术是 对传统S ANGER测序（称为一代测序技术）革命性的改变,可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,也称为深度测序 (D EEP SEQUENCING)。 1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污 染导致检测结果准确性下降；另外NGS技术要求高、影响因素多，实验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 二、NGS实验室临床应用的基本条件 2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。 2.2检测设备必须符合标准NGS实验室设置要求：高通量测序仪及配套服 务器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。 2.3检测人员必须通过专门的技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门 颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。NGS实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文

件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。 2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。 三、NGS实验室建设基本要求 3.1主体结构 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。 3.2标准的各区分隔和气压调节 将检测过程分成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个检测实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。 可打开缓冲区和PCR扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。 3.3消毒 在每个实验区和缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在各区还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。 3.4机械连锁不锈钢传递窗

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒

亚细胞定位之烟草转化方法

本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法： 一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间： 烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度： 推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

转基因烟草方法

2．材料与方法 2.1实验材料 植物材料：K326烟草种子 药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等； MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0 预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml 分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml. 生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基 2.3实验方法 2.3.1浸染菌液制备 将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。 挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。 活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。 取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。加入100ml的MS0培养基，混匀。 2.3.2烟草转化 按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养

第四章基因检测相关的实验

第四章基因检测相关的实验 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。其中分子诊断技术已在许多临床领域得到运用，这必将为二十一世纪人类医疗保健带来福音。因此，从分子水平上了解医学遗传学相关的实验技术对于现代医学教育与医学实践具有十分重要的意义。 实验4-1 人基因组DNA的提取 一、实验目的 掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。 二、实验原理 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。制备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；②尽可能保持DNA分子的完整。 在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；④抑制DNA酶活性，使DNA 分子尽量完整地分离出来。 三、实验用品和材料 （一）试剂

1．抗凝剂：EDTA 2%（W／V）生理盐水抗凝剂。称取2g EDTANa2、0．85g NaC1，加双蒸水至100m1。1ml该试剂可抗10ml 全血凝结；亦可用医用人ACD抗凝剂抗凝。肝素能抑制限制性内切酶活性，因此一般不用肝素抗凝。 2．15mmo1／L Tris-HCl（pH8.0），15 mmo1／L EDTA（pH8.0），15 mmo1／L NaCl （简称TES溶液）；用lmo1／L Tris-HCl（pH8.0），0.5 mmo1／L EDTA（pH8.0），3mo1／L NaCl稀释成15 mmo1／L TES溶液。 3．10%（W／V）SDS。 4．15mmo1／L TES饱和酚，重蒸酚在热水浴（100℃）中溶化后加入1/3体积的15 mmo1／L TES溶液，充分混匀后，放冰箱中静置6h以上。酚层在下，水层在上。吸掉上层多余的TES溶液，冰箱中避光保存备用。为防止酚被氧化成酮，可加少量8-羟基喹啉（2 mmo1／L～5mmo1／L）。 5．氯仿／异戊醇（24：1，V/V），现配现用。 6．蛋白酶K。 7．10mmo1／L Tris-HCl，1mmo1／L EDTA（pH7.5）（简称TE溶液）。用1mo1／L Tris-HCl（pH7．5），0．5mo1／L EDTA （pH 7．5～8．0）稀释配制。 （二）用品：Eppendorf试管、离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽。 四、实验方法和步骤 1．白细胞的分离 （1）抗凝血用1～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。 （2）在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。

基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

烟草瞬时转化相关文献

Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for ef?cient transient expression in plants Sylvestre Marillonnet 1,2,Carola Thoeringer 1,2,Romy Kandzia 1,Victor Klimyuk 1&Yuri Gleba 1 Plant biotechnology relies on two approaches for delivery and expression of heterologous genes in plants:stable genetic transformation and transient expression using viral vectors.Although much faster,the transient route is limited by low infectivity of viral vectors carrying average-sized or large genes.We have developed constructs for the ef?cient delivery of RNA viral vectors as DNA precursors and show here that Agrobacterium–mediated delivery of these constructs results in gene ampli?cation in all mature leaves of a plant simultaneously (systemic transfection).This process,called ‘magnifection’,can be performed on a large scale and with different plant species.This technology combines advantages of three biological systems (the transfection ef?ciency of A.tumefaciens ,the high expression yield obtained with viral vectors,and the post-translational capabilities of a plant),does not require genetic modi?cation of plants and is faster than other existing methods. Viral vectors designed for expression of recombinant proteins in plants hold great promise because of high absolute and relative yields,and because of the speed provided by transient expression.Most of the results of practical interest achieved so far have been obtained with vectors built on the backbones of plus-sense RNA viruses such as tobacco mosaic virus (TMV)or potato virus X 1–4. We have recently shown that TMV-based vectors can be delivered to plant tissues using A.tumefaciens 5(agroinfection).However,one step of this process,namely the formation of active replicons from the primary nuclear transcript,is inef?cient.In a standard leaf transfec- tion experiment,this inef?ciency is masked by the subsequent ability of the replicons to move to neighboring cells by cell-to-cell movement.Here we show that this bottleneck can be fully remedied by incorpora-tion of silent nucleotide substitutions into the vector and by addition of multiple introns.We demonstrate that such modi?cations provide for ef?cient processing of the DNA information into active replicons in almost all cells (as high as 94%)of Nicotiana benthamiana ,an up to 1,000-fold improvement over nonoptimized TMV-based vectors,and an even higher improvement (4106-fold)in Nicotiana tabacum (tobacco).Finally,we show that the resulting vectors allow the development of a fully scalable and versatile whole-plant transfection protocol,that we term magnifection,for production of heterologous proteins in plants. RESULTS Viral replication following agroin?ltration of TMV-based vectors Agroin?ltration of a TMV-based viral vector containing the gene encoding green ?uorescent protein (GFP)(pICH16707,Fig.1a )into N.benthamiana leaves leads to the formation of foci of GFP ?uorescence 3d post-in?ltration (d.p.i.)(shown in ref.5and in Supplementary Fig.1online).T o quantify the proportion of cells initiating viral replication,a 489-bp deletion was made within the movement protein (MP)coding sequence,resulting in construct pICH14833(Fig.1a ).Replicons derived from this construct cannot move from cell-to-cell but are able to replicate autonomously within each infected cell.Three days after agroin?ltration of pICH14833in N.benthamiana leaf (OD 600of the A.tumefaciens in in?ltration solution was 0.7),a small number of cells expressing GFP appeared (see Supplementary Fig.1online),and the same pattern was still visible 2weeks after in?ltration.By counting protoplasts prepared from the in?ltrated area (Figs.1and 2),we found that 0.6–1.6%of cells initiated viral replication. There are several reasons why RNA viral vectors might have dif?culties starting the replication cycle.First,RNA viruses,such as TMV ,replicate in the cytoplasm and never enter the nucleus,and have therefore evolved in an environment where they are not exposed to the nuclear pre-mRNA processing machinery.As a result,pre-mRNA transcripts made in the nucleus from viral constructs may not be re-cognized and processed properly.Second,viral vector constructs encode very large transcripts (B 7.6kb for the primary transcript of a viral vector containing a GFP gene),a size much larger than the average size (1–2kb)of plant genes.Moreover,in nature,large eukaryotic genes often contain numerous introns that facilitate processing and export of the pre-mRNAs from the nucleus 6.We therefore hypothesized that modi?cations of the constructs that would increase the ef?ciency of processing and export of primary transcripts from the nucleus to the cytoplasm could lead to an increase in the number of cells that would initiate viral replication.Two types of modi?cations were made: Published online 8May 2005;doi:10.1038/nbt1094 1Icon Genetics,Biozentrum Halle,Weinbergweg 22,D-06120Halle (Saale),Germany.2These authors contributed equally to this work.Correspondence and requests for materials should be addressed to Y.G.(gleba@icongenetics.de).A R T I C L E S ?2005 N a t u r e P u b l i s h i n g G r o u p h t t p ://w w w .n a t u r e .c o m /n a t u r e b i o t e c h n o l o g y

植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草

植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以霸占杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。但是，以往的工作重点多在容易做的模式植物上，从而使烟草、马铃薯、番茄、矮牵牛、拟南芥菜等植物的分子生物学和转基因技术发展很快。近年内以实用为目标的研究数目大大增加，在国外，主要的种子公司和一些小公司竞相开发重组 D NA技术，用于重要作物的商业应用，将研究机构和大学首创的原理和科技用于开发，导致植物基因工程向重要粮食和豆科作物遗传改良的实用化目标迈进。在1988年以前，重要谷类作物和豆科作物的转化十分困难，只是在一种生物技术的新工具——“基因枪”研制成功以后，才使得这些作物的转基因不但成为可能，而且常常可以做到不依赖于品种或基因型。基因枪是用火药爆炸、电容放电或高压气体作为加速的动力，发射直径仅1微米左右的金属颗粒。微粒表面用优选的基因包覆，高速射入植物细胞，并在细胞内表达产生有活性的基因产物，从而达到改良品种的目的。最初大豆基因工程的重点放在原生质体和胚性悬浮细胞的再生上，但进展很慢，获得转基因大豆是一个很大的难题。基因枪的出现，使大豆转基因成为现实，实际上目前大豆已成为许多难转化作物的模式作物。在1988至1990年仅两年时，建立了可实用的大豆转化体系，这是目前唯一的不依赖于基因型的大豆转化方法。抗除草剂 B astar和Roundup的基因也已转入大豆，并在过去三年中连续进行了田间试验，预期不久将可商业化，这将是豆科作物基因工程商业化应用的一个里程碑。大豆基因工程今后的目标可包括蛋白质和油脂成分的修饰、抗虫、抗病毒及其他病害抗性等。水稻为世界第二大谷类作物，但在我国则为最大的粮食作物，年产18992万吨（中国农业年鉴1993）。我国和印度的水稻产量占世界总产量的60％，全球几乎一半人口以稻米为主要热量的来源。水稻和爪洼稻、籼稻占栽培水稻的80％，供世界20多亿人食用。水稻得到转基因植始于1988年，最初均以原生质体为受体，采用 D NA直接转移法，再生出了可育的转基因植株。但是，原生质体再生体系的限制很大，粳稻上只有少数品种如台北309等，可由原生质体再生植株，大多数优良的粳稻品种和绝大多数籼稻品种都难以由原生质体再生。可由原生质体再生植株的籼稻品种迄今尚未获得转基因植株。由于水稻未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，几乎所有水稻栽培品种均能由未成熟幼胚再生。因此，一些科学家认为，原生质体转化在水稻上应用前景有限，最好是用基因枪转化水稻幼胚。最近

DNA实验

《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（4）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48

《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（5）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48

上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（6）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48

实验6 组织总RNA提取 实验目的 1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot 等。 2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。 3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。 4．获得某一特定组织或细胞全部RNA。 以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。 现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。 RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。 提取总RNA的方法有多种，比如： 1）本实验介绍的方法，类似于本实验的Trizol方法（今天我们会介绍这样的方法），均称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。 2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。 3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其它杂质，以后洗脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。 原理 本实验又称异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。 实验准备（略） 实验步骤 （参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒） 1．引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。 2．22℃，静置5min。 3．加入氯仿0.2ml，颠倒15s。 4．22℃，静置3min。 5．离心：4℃×15000转/分×15min。 6．取上清液0.5ml。 7．加入0.5ml异丙醇，混匀。 8．22℃，静置10min。 9．离心：4℃×15000转/分×10min。 10．弃上液。