门冬酰胺酶的制备与分析

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定

赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山

1 原理

本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。

目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。

本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。

2 实验材料

实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。

表1.1 实验仪器或装置

仪器名称型号生产厂家

超净工作台

PCR扩增仪

恒温培养箱

超低温冰箱

台式离心机

恒温摇床

涡轮振荡器

高压灭菌锅

蛋白电泳仪

核酸电泳仪

凝胶成像仪

紫外分光光度计

高效液相色谱仪

扫描型紫外分光光度

计

制冰机

超声清洗机

实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现

有条件核定。

表1.2 试剂和材料

试剂或材料材质或规格来源

E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存

pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司

pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司

Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司

Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司

DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司

胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl

60mmol/L 实验室储存

2

PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯

Taq 酶 Mix 分析纯

(NH

4)

2

S

2

O

8

分析纯

C 2H

6

OS 分析纯

CH

4

O 分析纯冰乙酸分析纯

C 2H

6

O 分析纯

氨基丁三醇分析纯

考马斯亮蓝分析纯

SDS 分析纯

Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯

L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋白胨分析纯

甘氨酸分析纯

琼脂糖分析纯

葡萄糖食品级

TEMED 优级纯

溴酚蓝分析纯

IPTG 优级纯

丙三醇分析纯

3 实验思路与步骤

本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。后分别构建重组克隆载体和表达载体，将克隆载体导入宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。后将

构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养，利用IPTG诱导表达重组蛋白，对重组蛋白进行提取纯化。再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳测定分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较。同时，实验过程中以纳氏试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活力，并计算回收率。

3.1大肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取

3.1.1 大肠杆菌ansB基因的选择与引物

从NCBI中查找获取大肠杆菌ansB的基因序列，其Gene ID为947454，基因长度为1047bp,序列如下：

1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca

61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac

121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg

181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc

241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat

301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc

361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc

421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat

481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt

541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct

601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc

661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat

721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc

781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg

841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc

901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac

961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag

1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa

根据该基因序列，使用Primer 5.0 设计引物，并考虑到后续构建克隆载体和表

达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如下：

上游引物P1 ：GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA

下游引物P2 ：GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG

上游引物P1 中包含一个Nde Ⅰ酶切位点，下游引物中包含一个Xho Ⅰ酶切位点。所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成。

3.1.2 大肠杆菌全基因组DNA的提取

使用大肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA，具体步骤如下：

(1)从实验室斜面保存的E.coli野生型菌株CPU21009上，取接种环，挑单菌落，转移到50 mL的液体LB培养基，在温度37Ⅰ、180 r／min发酵过夜。

(2)取菌液1 mL至1.5 mL的离心管管中，离心机参数调至12000离心2 min，离心3 min，弃去上清液。

(3)加入0.2 mL GA缓冲液，用漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮。加入 4 μL RNaseA(100mg／mL)溶液，用涡旋振荡器振荡振荡15 s，室温放置5 min。

(4)加入0.02 mL蛋白酶K，混合均匀。

(5)加入0.02 mL GB缓冲液，混合均匀，将水浴锅调到70Ⅰ，把离心管放入10 min，短暂离心除去离心管管盖和管壁的水珠。

(6)加入0．22 mL分析纯乙醇，在15 s内充分混匀，此时会出现絮状物，短暂离心除去EP管盖和管壁的水珠。

(7)将(6)中所得絮状物和液体均加入安装进收集管的吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，弃去柱底液体，安装好吸附柱。

(8)加0.5 mL GD缓冲液至吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。

(9)加0.6 mL PW漂洗液至吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。

(10)再加0.5 mL GD缓冲液，离心机参数调至12000离心1 min倒掉柱底液体。

(11)将吸附柱放入收集管中，离心机参数调至12000离心2 min，倒掉柱底液体。在室温下静置20 min吸附柱，完全晾干漂洗液，使吸附材料干燥。

(12)将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离心机参数调至12000离心2 min，收集溶液。

(13)将(12)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离心机参数调至12000离心2 min。

(14)将提取后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以便用于后续操作。

3.1.3 PCR扩增ansB基因

(1)在PCR扩增仪上设计如下反应程序：

①模板DNA预变性94Ⅰ 5 min；

②变性：94 Ⅰ条件下45 s；

③退火：58 Ⅰ条件下30 s；

④延伸：72 Ⅰ条件下1 min；

⑤循环步骤②～④30次；

⑥最后在72 Ⅰ延伸10 min。

(2)在PCR管建立整体为0.05 mL的PCR扩增反应体系：

大肠杆菌总DNA模板0.003 mL

上游引物P1 0.001 mL

下游引物P2 0.001 mL

Taq酶Mix 0.025 mL

ddH2O 0.02 mL

(3)将样品混合后稍作离心，将反应管放入PCR扩增仪中进行PCR反应。

(4)结束PCR扩增，取0.005 mL溶液，进行1％Agarose gel electrophoresis鉴定，判断是否有基因片段存在于PCR中，以及其大小。

3.1.4 PCR扩增产物的纯化

(1)将0.04 mL PCR扩增后体系用双蒸水调整至0.1 mL，加入0.5 mL结合液DB，充分混匀。

(2)将(1)中得到的溶液加入安装好的吸附柱，在室温下静置1 min，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉管底的液体。

(3)加入0.5 mL用于洗涤的溶液，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉管底

的液体。

(4)加入0.5 mL用于洗涤的溶液，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉管底的液体。

(5)将吸附柱重新安装好，空管离心2 min，尽最大可能得除去用于漂洗的液体，防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响。

(6)取吸附柱，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离心机参数调至12000离心2 min，收集溶液。

(7)将离心管中的双蒸水，重新加入吸附柱中，室温放置2 min后，离心机参数调至12000离心2 min。

(8)将PCR纯化产物进行1％Agarose gel electrophoresis鉴定，以用于后续操作。

3.2 重组克隆载体的构建

为了大量准确扩增目的基因片段，采用构建克隆载体的方法。由于PCR扩增时采用的DNA聚合酶为Taq酶，故扩增序列带有一段“A”，采用TA克隆连接载体。载体选择T载体，且要求载体在宿主细胞内为高拷贝，能够稳定自主表达。这里选用pMD 18-T载体。构建好的克隆载体导入宿主中后，要进行阳性克隆筛选与鉴定，并用双酶切回收。

3.2.1 目的基因与载体的连接

pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产

物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。载体酶切图谱如图1.1。

本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。此外，高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。实验操作如下：

(1)在一个标准的10μL连接反应体系中加入：

pMD18-T载体1μL

PCR纯化产物 1.5μL

ddH2O 2.5μL

Solution I5μL

(2)16 ℃连接2 h。

图 1.1 克隆载体pMD 18-T的酶切图谱

3.2.2 大肠杆菌Top 10感受态细胞的制备

大肠杆菌TOP10菌株来源于MC1061菌株，是目前实验室最常用的基因工程宿主细胞之一，基因型与DH10B高度类似（DH10B为galE15型，而TOP10为galU型），具有链霉素抗性。其适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

(1)从实验室保存的大肠杆菌Topl0菌株斜面上，用接种环挑取单个菌落，转移至液体的50 mL LB培养基中，37 Ⅰ下180 r/min摇床过夜发酵。

(2)取0.01 mL菌液转移到液体的50 mL LB培养基中，37 ℃下150 r/min振荡约

3.5 h左右，至菌液对数期。

(3)将液体培养基全部移入50 mL离心管中并配平，4 Ⅰ下离心机参数调至3000离心10 min，弃去上清液。

(4)添加15 mL预冷的氯化钙溶液轻轻吹打。4Ⅰ下离心机参数调至3000离心10 min，弃去上清液。

(5)添加1.5 mL预先冰浴的氯化钙(60 mmol/L CaCl2、质量分数为15％的甘油、pH 7.2)溶液，用枪轻轻吹至完全悬浮，分装至干净的EP管，每管0.2 mL，放在80Ⅰ超低温冰箱。

3.2.3 重组克隆质粒的转化

(1)含有Ampicillin l00 mg/mL的LB培养基的制备。

(2)取一管200μL的大肠杆菌Top l0感受态细胞，在冰上化冻，加入重组质粒的连接产物10μL，轻轻用枪吹打混匀。

(3)另做一个宿主菌阴性对照，即200μL的感受态细胞，加10μL无菌水，混匀。

(4)冰浴30 min。

(5)迅速放入在42Ⅰ下热击90 s，再迅速放回冰中冰浴3 min。

(6)加入到1 mL的液体LB培养基混合，37Ⅰ 150 r/min培养1 h，细胞恢复正常生长，并表达Ampicillin抗性基因。

(7)将上述菌液摇匀后，分别取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL在含有Ampicillin的LB 培养基板上均匀涂布。

(8)将上述平板37Ⅰ倒置培养过夜(不超过24 h)，观察菌斑的出现效果。

3.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定

(1)从Ampicillin LB培养基板上挑取单个的菌落，液体Ampicillin、LB培养基中振荡过夜，取5 mL过夜菌液加入离心管中，离心机参数调至12000离心1 min，弃去上清废液。

(2)使用离心柱型质粒提取试剂盒。向菌体沉淀管中加入0.5 mL Pl溶液(含溶菌酶、核糖核菅酸酶)，用移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(3)向离心管中加入0.6 mL P2溶液，翻转6-8次，充分裂解菌体。在这一点上。菌液变得澄清、黏黏的，时间不超过5 min，以免损坏质粒。如果不澄清，可能是由于过量加菌液，未能彻底裂解，应减少细菌生长量。

(4)向离心管中加入0.6 mL P3溶液，马上轻轻地翻转6-8次，混合彻底，会有白色絮状物出现。离心机参数调至12000离心10 min后，离心管底有固体出现。加入P3，立即翻转，避免局部沉淀。若上清液有微小白色固体，再离心取上清。

(5)将上清液加进平衡过的吸附柱中，吸附柱安装好，离心机参数调至12000离心2 min，小心地将离心管中的溶液分次加入原有吸附柱，安装好吸附柱。(6)加入0.6 mL PW漂洗液，将台式离心机参数设置为12000，离心1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(7)加入0.6 mL PW漂洗液，将台式离心机参数设置为12000，离心1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(8)将台式离心机参数设置为12000，将组件离心2 min，除去吸附柱中的残留的用于漂洗的液体。吸附柱在室温下静置5 min，防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响。

(9)将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜

的中间部分，在室温静置5 min，离心机参数调至12000离心2 min，收集溶液。

(10)将(9)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离心机参数调至12000离心2 min。

(11)取5 μL质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳。

(12)克隆载体中含有Nde I和Xho I两种限制性酶酶切位点，构建10μL双酶切反应体系：

Nde I 0.5μL

Xho I0.5μL

10 × H buffer 1μL

pMDl8-T-ansB质粒8μL

37℃酶切2 h后，取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳。

3.3 重组表达质粒的构建

3.3.1 重组克隆载体质粒的提取

(1)从相应的培养基上挑取含有重组克隆载体pMDl8-T-ansB质粒

的菌种的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基，用180 r/min的参数，在37 Ⅰ下培养12 h以上。在离心管中加5 mL收获的菌液，离心机参数调至12000离心l min，留下沉淀。pMDl8-T-ansB质粒提取过程同1.3.2.4的(2)-(11)。

(2)5μL质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳，其余-20Ⅰ保存。

3.3.2 重组克隆载体和表达载体的分别双酶切反应

(1)Nde I、Xho I双酶切重组克隆载体pMDl 8-T-ansB质粒反应体系：

pMDl8-T-ansB质粒40μL

10× H buffer 5μL

Xho I 2.5μL

Nde I 2.5μL

总体积50μL

(2)pET-22b Plasmid酶切反应体系：

pET-22b Plasmid 40 μL

10× H buffer 5 μL

Xho I 2.5μL

Nde I 2.5μL

总体积50 μL

(3)分别将两个体系置于37Ⅰ水浴中酶切2 h后，取5μL此进行1％琼脂糖凝胶电泳。

3.3.3 酶切片段的胶回收

(1)经琼脂糖凝胶电泳确认酶切结果后，剩下的45μL酶切反应产物中均匀加入5 μL l0×上样缓冲液，再全加到大孔胶的上样泳道中。

(2)在100 V电压下电泳至条带跑至总胶长的2/3处。将胶块放入EB浓度为0.5μg/mL的溶液中染色，大小为1000 bp(ansB)、5000 bp(pET-22b)左右。

(3)在紫外灯照射下，判定DNA位置，用干净的刀子分别切下的含有要回收DNA 的胶块。

(4)取1.5 mL EP管，放到分析天平上称重后，加入切下的胶块再称重，计算胶块的质量。

(5)每100 mg胶块加入0.6 mL DB溶胶液，按(4)中称取的重量加入相应体积的DB，在55℃下反应10 min，使胶块彻底溶于液体。安装好组件，离心机参数调至10000离心1 min，收集沉淀。

(6)安装好吸附柱，加0.5 mL用于漂洗的液体，离心机参数调至10000离心1 min。重复漂洗，去除废液。离心2 min，弃去废液。

(7)在室温下静置吸附柱，开启盖，待乙醇气味完全消失后放入干净的EP管，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜的中间部分。在室温静置 5 min，离心机参数调至12000离心2min，收集溶液。

(8)将(7)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离心机参数调至12000离心2 min，EP管中的即为胶回收产物。

(9)胶回收产物5μL进行1％Agarose gel electrophoresis。

3.3.4 构建表达载体pET-22b-ansB

下图所示为表达载体pET-22b的酶切图谱。

图 1.2 表达载体pET-22b的酶切图谱

pET-22b是一种大肠杆菌表达载体，载体大小在5500bp左右。其含有多克隆位点，其中就含有我们目的基因引物片段构建中引入的Ned Ⅰ和Xho Ⅰ两种限制性酶切位点。它含有氨苄青霉素抗性标记，且含有PelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。

(1)取一支1.5mL的干净EP管，按如下加样后混匀：

胶回收双酶切pET-22b质粒产物18μL

胶回收双酶切ansB片段 6 μL

T4 DNALigase 3 μL

10×Ligase buffer 3 μL

总体积30 μL

(2)用离心机甩一下，使溶液集中于底部。

(3)16Ⅰ恒温连接3 h后，4Ⅰ暂时保存，用于转化BL21感受态细胞。

3.3.5 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备

从实验室保存的大肠杆菌Topl0菌株斜面上，用接种环挑取单个菌落，转移至50 mL液体LB培养基，37Ⅰ，180 r/min隔夜发酵。感受态细胞的制备步骤同1．3．2．2的(2)-(5)。

3.3.6 表达载体pET-22b-ansB的转化

(1)含有Ampicillin l00 mg/mL的LB培养基板的制备。

(2)取一管200μL的大肠杆菌BL21感受态细胞，在冰上化冻，加入T4 DNA连接产物10μL，轻轻用枪吹打混匀。

(3)另做一个宿主菌阴性对照，即200此的感受态细胞，加10 μL无菌水，混匀。

(4)冰浴30 min。

(5)迅速放入在42Ⅰ下热击90 s，再迅速放回冰中冰浴3 min。

(6)加入到1 mL的液体LB培养基混合，37Ⅰ 150 r/min培养1 h，细胞恢复正常生长，并表达Ampicillin抗性基因。

(7)将上述菌液摇匀后，分别取0.1mL在含有Ampicillin l00μg/mL的LB培养基板上均匀涂布。

(8)将上述平板37Ⅰ倒置培养过夜(不超过24 h)，观察菌斑的出现效果。

3.3.7 阳性表达载体pET-22b-ansB的筛选与鉴定

(1)从Ampicillin LB培养基板上挑取单个的菌落，液体Ampicillin、LB培养基中振荡过夜，取5 mL过夜菌液加入离心管中，离心机参数调至12000离心1 min，弃去上清废液。

(2)向菌体沉淀管中加入0.5mL Pl溶液(含溶菌酶、核糖核苷酸酶)，用移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(3)向离心管中加入0.6 mLP2溶液，翻转6-8次，充分裂解菌体。在这一点上。菌液变得澄清、黏黏的，时间不超过5 min，以免损坏质粒。如果不澄清，可能是由于过量加菌液，未能彻底裂解，应减少细菌生长量。

(4)向离心管中加入0.6 mL P3溶液，马上轻轻地翻转6-8次，混合彻底，这时会有白色絮状物出现。离心机参数调至12000离心10 min后，离心管底会有固体出现。加入P3，立即翻转，避免局部沉淀。如果上清液有微小白色固体，再离心，取上清。

(5)将上一步获得的上清液加进平衡过的吸附柱中，吸附柱安装好，离心机参数调至12000离心2 min，小心地将离心管中的溶液分次加入原有吸附柱，安装好吸附柱。

(6)加入0.6mLPW漂洗液，将台式离心机设置为12000，离心1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(7)加入0.6 mLPW漂洗液，将台式离心机设置为12000，离心1 min，倒掉管底废液，安装好吸附柱。

(8)将台式离心机设置为12000，将组件离心2 min，除去吸附柱中的残留的用于漂洗的液体。吸附柱在室温下静置5 min，防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响。

(9)将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离心管参数调至12000离心2 min，收集溶液。

(10)将(9)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离心管参数调至12000离心2 min。

(11)取5μL质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳。

(12)构建10μL双酶切反应体系：

Nde Ⅰ0.5μL

Xho Ⅰ0.5μL

10 ×H buffer 1 μL

pET-22b-ansB质粒8 μL

(13)双酶切成功，委托华大基因测序。

3.4 AnsB蛋白的诱导表达与纯化

3.4.1 IPTG诱导重组蛋白AnsB的表达

IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白，并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。

(1)在无菌环境下，用接种针挑取重组工程菌(pET-22b-ansB)单菌落，转入50 mL

液体LB培养基(终浓度为100μg/mL Ampicillin)中，在37Ⅰ恒温摇床中150 r/min 培养12 h以上。从上述细菌菌液中接种0.1mL到新鲜的50 mL终浓度为100μg/mL Ampicillin的LB液态培养基中，在37Ⅰ摇床中250 r/min恒温振荡约4 h至生长指数期，测定菌液在600 nm波长下吸光度值为0.8至1.0之间。

(2)取5 mL的上述重组工程菌(pET-22b-ansB)发酵液保存，以便进行后续SDS-PAGE凝胶电泳对照实验。

(3)向剩余发酵液中加入异丙基硫代半乳糖苷使浓度至0.6mmol/L，3Ⅰ下250 r/min 引诱重组AnsB蛋白表达5 h。

3.4.2 蔗糖溶液提取L-天冬酰胺酶

大肠杆菌能产生两种天冬酰胺酶。无抗癌活性的天冬酞胺酶Ⅰ存在于细胞质中，有抗癌活性的天冬酞胺酶Ⅰ则分泌到细胞周质中。以往对L-天冬酰胺酶的提取纯化常采用丙酮破碎细胞，有机溶剂反复分级沉淀的方法,酶活力损失较大。据中国药科大学刘景晶等研究报道，用蔗糖溶液抽提细胞，主要是提取位于细胞周质中的酶。提取结束时，多数细胞并未发生破裂，因此提取液粘稠度不大，可以用8000r/min离心除去细胞。并且该法的提取收率高于超声波破壁法、冷丙酮干燥破壁法及反复冻融法。

向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40% ,溶菌酶200mg/L , EDTA 10 mmol/L , pH 7.5)，在30Ⅰ振荡2小时, 8000r/min离心30分钟，收集上清酶液。

3.4.3 硫酸铵分级沉淀和透析

为了保护酶的活性在固相分离沉淀时采用较为温和的硫酸铵分级沉淀。具体方法为用蔗糖溶液提取法获得的酶液，加入硫酸铵至55%饱和度，调pH至7.0，

室温搅拌1小时，离心除去沉淀。上清液中加入硫酸按到90%饱和度，离心收集沉淀。实验验证破壁液中酶浓度高于378 IU/ml时,酶易与杂质-起沉淀,回收率下降,但过低时,虽然回收率增高,但杂质的去除率必定会下降,故应选择378 IU/ml左右进行沉淀。在pH为4.9时,盐析的沉淀效果最好,回收率达89.1%。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。

3.4.4 离子交换层析

（1）CM-Sephadex层析柱纯化。将酶液过用10mM、pH6.0的磷酸缓冲液平衡的CM-Sephadex层析柱，用50mM、pH8.8的磷酸缓冲液洗脱，收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液。

（2）DEAE-Sepharose层析柱纯化。将洗脱液调pH7.0，过用10mM、pH7.0的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱，用50mM的磷酸缓冲盐洗脱，收集OD280大于0.1的含有L-天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液。

3.4.4 亲和层析

(1)连接组件

将数控层析冷柜、核酸蛋白检测仪、自动部分收集器以及Ni-NTA Sefinose Resin Kit层析试剂盒中的相应组件正确组装好，并通好电源。设定层析柜温度为4Ⅰ。

(2)柱平衡

实验室已配置好的柱子，用将母液稀释后的1×PBS buffer使柱平衡。

(3)调零

向柱中流加1×PBS缓冲液进行调零，并调节核酸蛋白仪检测仪至波长280

nm、透过率T为100％，灵敏度为0.2 A。

(4)上样

用移液器吸取粗酶液进行上样。

(5)洗涤杂蛋白

上样后，用含有5 mmol甘恶啉、0.5mol氯化钠、20 mmol氨基丁三醇(pH8.0)的WB洗脱液洗掉柱子上的杂蛋白，同时收集A280下各示数的穿透液，当核酸蛋白检测仪示数在A280下降到不再变化时结束，结束洗涤过程。

(6)洗脱AnsB蛋白

用含有60 mmol咪唑、0.5 mol氯化钠、20 mmolTris(pH 8.0)的洗脱液通过层析柱洗脱吸附在柱子上的AnsB蛋白，同时自动采集A280下不同数值的WB，当一直在A280下降的示数不再变化，收集相应示数下的蛋白洗脱液。

(7)柱处理

向柱中加入5个柱容积的1×PBS缓冲液，再加入3个柱体积的纯度为0.2的酒精，柱子保存在冰箱冷藏室中。

3.4.5 AnsB蛋白浓缩除盐

将Pall超滤管进行预处理，并使用它对AnsB蛋白洗脱液浓缩除盐。向Pall 管内加入20 mL蛋白洗脱液，在4000 r／min下离心60 min，使浓缩液约为2 mL，取出超滤装置。将样品储层的浓缩样品转移到干净EP管中，置于-80℃保藏。

3.5 AnsB蛋白的鉴定

3.5.1 Bradford 测定ansB蛋白浓度

重组门冬酰胺酶II的表达及制备

重组天冬酰胺酶II研究进展 摘要L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广。目前，利用重组DNA技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述。 关键词L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化 Ⅰ引言 L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有30年了[1]。L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3），此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2]。由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶），而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3]。 目前，L-天冬酰胺酶分为I型和II型，尤其是II型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶II）。天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2]。本文主要就L-天冬酰胺酶II的表达与制备进展进行综述。 Ⅱ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究 1961年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5]。目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1]。 尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开。 1．表达菌株的构建 1995年，为了填补国内空白，刘景晶[8,9,10]等率先进行工程菌E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了天冬酰胺酶高效表达的基因工程菌

培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病临床应用中的安全性评估

·论著· 培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病临床应用中的安全性评估 李颖宪莹苏庸春温贤浩管贤敏肖莉王玥于洁 作者单位：400014重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤科 通讯作者：于洁，Email ：yujie167@yahoo．com 【摘要】目的评估培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL ）临床应用中的安全性。方法本研究中所有ALL 患儿都使用CCLG 2008方案规范诊治；接受培门冬酶治疗的条件是：（1）左旋 门冬酰胺酶（L- Asp ）皮试阳性；（2）L-Asp 使用后出现不良反应。先后共有32例患儿由于对大肠杆菌L- Asp 过敏而使用培门冬酶替代化疗共46次。使用培门冬酶治疗前和治疗后1周检查肝肾功能、凝血功能、淀粉酶、心肌酶谱、心电图和腹部B 超，临床观察和检测使用培门冬酶后脏器功能和不良反应发生的情况。结果46例次中无一例发生致死性不良反应。8例（17%）有转氨酶异常；总胆红素增高4例，以直接胆红素升高为主；血清总蛋白降低5例。8例（17%）有血浆纤维蛋白原 浓度异常，7例降低，临床无凝血功能障碍和血栓等表现。7例（15%）有心血管系统受累，包括血 压升高（1例）、 心率减慢（2例）、CK-MB 增高（5例）、肌钙蛋白增高（1例）、心电图异常（4例）。7例（15%）出现肾功能异常，以尿素氮增高（6例）为主，临床未发现肾功能不全的表现。3例（7%）发生高血糖症，无急性胰腺炎的病例发生。46例次培门冬酶治疗中，仅1例（2%）发生了典型的过 敏反应， 以明显的风团样皮疹伴瘙痒为主要表现，有一过性喉头异物感，经吸氧、镇静等处理后很快缓解。结论培门冬酶在很大程度上克服了L- Asp 过敏反应致使用受限的弱点；培门冬酶的不良反应发生率低，发生不良反应的程度轻，安全性较高。推荐培门冬酶作为对L- Asp 过敏的ALL 患儿的替代治疗。其疗效有待进一步观察。 【关键词】培门冬酶；急性淋巴细胞白血病；儿童；安全性 Safety assessment of pegaspargase in the clinical treatment of acute lymphoblastic leukemia in children LI Ying ，XIAN Ying ，SU Yongchun ，WEN Xianhao ，GUAN Xianmin ，XIAO Li ，WANG Yue ，YU Jie．Department of Hemooncology ，Children's Hospital ，Chongqing Medical University ，Chongqing 400014，China Corresponding author ：YU Jie ，Email ：yujie167@yahoo．com 【Abstract 】Objective To observe and evaluate the safety of pegaspargase in the clinical treatment of acute lymphoblastic leukemia （ALL ）in children．Methods All the patients in our study were treated with CCLG2008．The indications of pegaspargase is ：（1）positive skin test of L-Asp ；（2）adverse reaction after L-Asp treatment．A total of 32cases with Escherichia coli L-asparaginase allergy were treated with pegaspargase 46times instead of chemotherapy．The liver and renal functions ，coagulation ，amylase ，myocardial enzyme spectrum ，electrocardiogram （ECG ）and abdominal ultrasound were detected before and after treatment．The adverse reactions of pegaspargase was also observed．Results All the patients were treated with pegaspargase．No fatal adverse reaction was observed．Abnormal transaminase levels were · 751·中国小儿血液与肿瘤杂志2012年8月第17卷第4期J China Pediatr Blood Cancer ，August 2012，Vol 17，No．4

培门冬酶治疗ALL患者过程中的不良反应分析

培门冬酶治疗ALL患者过程中的不良反应分析 发表时间：2017-12-29T09:39:03.630Z 来源：《中国误诊学杂志》2017年第24期作者：吕丽娜 [导读] 左旋门冬酰胺酶是一种用于化疗的关键药物之一，在应用于治疗ALL患者中具有重大的意义[1]。 右江民族医学院附属医院广西百色 53300 摘要：目的：观察培门冬酶（PEG-ASP）应用于初治急性淋巴白血病患者（ALL）中，并对其不良反应发生进行分析。方法：随机选取本院自2014年12月至2016年12月间诊断为急性淋巴细胞白血病（BCR-ABL阴性）的80例成人患者作为研究对象，并根据诱导化疗中培门冬酶的用药次数将其分为培门冬酶1次组（n=40）与培门冬酶2次组（n=40），对预后差组患者应用2次培门冬酶，对预后好组患者应用1次培门冬酶，观察并记录化疗后疗效，以及治疗期间培门冬酶的不良反应发生及严重程度。结果：经VDCLP化疗后，两组疗效无显著差异（P>0.05），且所有患者均未出现较为严重的不良反应发生。结论：在诱导化疗ALL患者的VDCLP方案之中，应用1次与2次培门冬酶治疗患者均具有治疗效果，但应用2次培门冬酶不良反应较为明显。 关键词：急性淋巴细胞白血病；培门冬酶；不良反应 左旋门冬酰胺酶是一种用于化疗的关键药物之一，在应用于治疗ALL患者中具有重大的意义[1]。国内外被广泛应用的门冬酰胺酶制剂为天然大肠杆菌源性L-asp、天然菊欧文菌源性L-asp以及培门冬酶。培门冬酶是新一代的门冬酰胺酶制剂，为聚乙二醇与L-asp的共价结合物。它既保存了L-asp的活性，同时又显著的降低了L-asp免疫原性[2]与半衰期较长[3]等的特点。本次研究，通过对培门冬酶应用诱导化疗ALL患者过程中的不良反应进行观察分析，取得了满意效果，报告如下。 1 一般资料与方法 1.1 一般资料 随机选取本院自2014年12月至2016年12月间诊断为急性淋巴细胞白血病（BCR-ABL阴性）的80例成人患者作为研究对象，并根据诱导化疗中培门冬酶的的用药次数将其分为培门冬酶1次组（n=40）与培门冬酶2次组（n=40），对预后差组患者化疗过程中应用2次培门冬酶，对预后好组患者化疗过程中应用1次培门冬酶。其中男47例，女33例，年龄为22-70岁，平均年龄为（36.44±3.13）岁，按预后危险度分组预后好组40例，预后差组40例。经核实，两组ALL患者基线资料无显著差异（P>0.05），具有可比性。 1.2 方法 对所有患者进行VDCLP方案进行化疗，其中培门冬酶1次组具体方案为：应用药物长春新碱，剂量为1.4mg/m2，方式为静脉注射，应用时间为d1与d8；应用药物柔红霉素，剂量为40mg/㎡，方式为静脉注射，应用时间为d1、d2、d3；应用药物环磷酰胺，剂量为750mg/㎡，方式为静脉滴注，应用时间为d1；应用药物强的松，剂量为40mg/m2?d，方式为口服，应用时间为d1-d14；应用药物培门冬酶，2500U/（m?次），方式为肌内注射，应用时间为d7。 培门冬酶2次组具体方案为：应用药物长春新碱，剂量为1.4mg/m2，方式为静脉注射，应用时间为d1、d8、d15、d22；应用药物柔红霉素，剂量为40mg/㎡，方式为静脉注射，分别于d1、d2、d3、d15、d16、d17应用；应用药物环磷酰胺，剂量为750mg/㎡，方式为静脉滴注，应用时间为d1、d15；应用药物强的松，剂量为40mg/m2.d，方式为口服，应用时间为d1-d28，d15开始减量；应用药物培门冬酶，2500U/（m?次），方式为肌内注射，应用时间为d7、d21。 1.3 判定标准 观察并记录两组患者在化疗过程中出现的相关消化道症状、皮肤粘膜损伤及过敏等常见的不良反应。根据《血液病诊断及疗效标准》，对患者诱导缓解情况进行记录，分为完全缓解、复发以及死亡。 1.4 统计学处理 SPSS19.0处理数据，计量资料以（ ±s）计量资料以表示，行t检验，计数资料以（%）表示，行X2检验，检验标准以P<0.05为数据比对有统计学意义。 2 结果 2.1 两组疗效比较 根据结果表明，两组疗效比较无统计学差异（P>0.05），对比详情见表一。 2.2 两组不良反应比较 两组患者在接受培门冬酶治疗期间，d7、d15及d21各时间的血尿淀粉酶及血脂肪酶均为正常水平，且无胰腺炎发生。血糖检测未发现有血糖增高病例，而2次组有14例（35.00）与1次组有10例一过性低血糖（25.00）。2次组共发现有7例（17.50）恶心呕吐与4（10.00）例厌食，1次组共发现5例（12.50）恶心呕吐与2例（5.00）厌食，组间比较无显著差异（P>0.05）。 3讨论 L-ASP是通过将门冬酰胺水解为门冬氨酸与氨，从而将血浆中的Asn消耗殆尽，以此对肿瘤细胞蛋白质合成进行阻断，有效的发挥抗肿瘤效应。由于正常人细胞中含有Asn合成酶，自身能够进行蛋白质合成且不会受到血浆中Asn水平的影响[4]，因此L-ASP对正常细胞不会造

培门冬酰胺酶化疗的不良反应及其护理

培门冬酰胺酶化疗的不良反应及其护理 发表时间：2013-04-25T13:30:00.200Z 来源：《医药前沿》2013年第8期供稿作者：赵静徐晓军严桂芳 [导读] 培门冬酰胺酶是近年来应用于急性淋巴细胞白血病（ALL）化疗的新药。 赵静徐晓军严桂芳（浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科浙江杭州 310003） 【摘要】培门冬酰胺酶是近年来应用于急性淋巴细胞白血病（ALL）化疗的新药。本文通过对我院20例应用培门冬酰胺酶化疗的ALL患儿临床资料的回顾性分析明确护理要点。培门冬酰胺酶注射后90%患儿出现低纤维蛋白原血症，一般在注射后7天左右降至最低点。此外还可出现过敏反应、低蛋白血症、高血糖等表现，严重者出血过敏性休克。因此，培门冬酰胺酶化疗过程中应警惕过敏反应。要定期监测凝血功能、生化指标、血糖，做好饮食控制及对症支持治疗。 【关键词】急性淋巴细胞白血病培门冬酰胺酶护理儿童 【中图分类号】R473.73【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）08-0234-02 左旋门冬酰胺酶是急性淋巴细胞白血病治疗中的关键药物，对于提高患者的长期生存率具有重要作用[1]。但由于其为异种蛋白，化疗过程中需要反复应用，因此存在较高的过敏率（可达25～30%）[2]。培门冬酰胺酶（PEG-Asp）是由水溶性人工合成的化学聚合体PEG与门冬酰胺酶蛋白共价连接而成，它能有效降低门冬酰胺酶过敏反应的发生，且疗效相当[3]。本文总结了本院近半年来20例应用培门冬酰胺酶化疗的病例，对其副反应及护理措施报道如下。 1.临床资料 1.1 病例：201 2.7-2012.11在我院血液肿瘤科住院应用培门冬酰胺酶化疗的急性淋巴细胞白血病患儿20例。其中男性13例，女性7例，中位年龄7.3岁（2.1岁～15.3岁）。 1.2 应用方法：培门冬酰胺酶根据体表面积给药，剂量为2500 IU/m2，每14天应用一次。用法为肌内注射（一般选择双臀部肌肉），单一部位注射剂量应小于2ml，若使用量超过2ml，则需要多部位注射。 1.3 不良反应监测：注射后严密观察有无过敏反应表现。每日监测血糖，每周至少两次监测生化（白蛋白、球蛋白、肝功能、肾功能、淀粉酶）、凝血谱（纤维蛋白原，凝血酶原时间[PT]，活化的部分凝血活酶时间[APTT]，出血时间，D-二聚体）和血气电解质。 1.4 结果：20例患儿中，18例（90%）患儿在培门冬酰胺酶注射后1-2周内出现不同程度的低纤维蛋白原血症，15例患儿的最低水平在1.0g/L以下。纤维蛋白原一般在注射后7天左右降至最低点，虽然反复输注血浆或纤维蛋白原，但90.9%患儿的低纤维蛋白原血症持续至2周或更长时间（图1）。14例患儿出现APTT延长，5例患儿出现出血时间延长，本组患儿汇总并未出现PT延长的患儿。3例患儿出现低白蛋白血症。1例患儿出现继发性高血糖，经过饮食控制后血糖降至正常水平。3例患儿出现过敏反应，2例为皮疹，1例出现过敏性休克。本组病例未出现急性胰腺炎表现。 2.护理体会： 2.1 过敏反应： 2.1.1 药物准备：根据药物说明书，培门冬酰胺酶在注射前无需进行皮试。但临床应用过程中确实存在一定比例的过敏反应，严重者出现过敏性休克。因此在注射的时候，应准备好抢救用的药物和设备。如地塞米松等糖皮质激素类药物、肾上腺素、苏打等药物及供氧系统、吸痰器、加压面罩等设备。 2.1.2 过敏反应的观察：药物过敏反应的表现比较多样。轻者出现皮肤潮红、风团样皮疹伴瘙痒、眼睑口唇肿胀。有喉头水肿者出现刺激性咳嗽、胸闷、气急及喘憋症状。有过敏性休克者可表现为心悸、出汗、面色苍白、四肢厥冷、脉搏细速及血压下降。部分患者甚至以意识状态改变及神经系统症状为主要表现。 2.1.3 过敏反应的处理：对于单纯皮肤黏膜表现者，可根据医嘱口服非那根等抗过敏药物，外用炉甘石洗剂，继续观察有无病情进展。对于呼吸道症状者，立即给予吸氧，监测血氧饱和度，必要时根据医嘱给予激素、肾上腺素及支气管扩张剂的雾化吸入，乃至静脉应用激素及肾上腺素等抗过敏药物。对于出现过敏性休克者，应立即生理盐水扩容、静脉应用激素及肾上腺素等药物、吸氧、勤监测血压至病情缓解，并继续观察至少48小时以防病情反复。对于有过敏表现者，应常规监测血压。 2.2 凝血功能异常： 培门冬酰胺酶应用后，90%的患儿可以出现凝血功能异常，因此，需要加强凝血谱的监测，每周至少检查2次凝血谱，持续2周以上。对于单纯低纤维蛋白原血症者，可补充法布莱士或血浆，对于纤维蛋白原降低合并PT、APTT延长者，应积极输注血浆。护理过程中注意观察患儿有无鼻衄及牙龈出血、消化道及泌尿道出血、颅内出血征象。尽量减少有创操作机会，集中采血，采血后注意局部延长按压时间。但另一方面，由于门冬酰胺酶导致活性蛋白C的合成减少，从而引起纤维蛋白溶解能力下降，机体处于高凝状态，有导致深静脉血栓的风险[4]。因此，应用过程中需要测量深静脉置管附近及对侧肢体的周径，观察有无肿胀及疼痛不适。 2.3 继发性高血糖： 在化疗方案中，培门冬酰胺酶常与激素合用。因此，在应用培门冬酰胺酶前应检查血糖和/或尿糖，排除原发性糖尿病或化疗引起高血糖可能。应用过程中，每日晨起监测血糖，若 >7.0 mmol／L，立即报告医生进行必要的处理。出现血糖异常增高者，根据医嘱必要时停用化疗。一般首先采用饮食疗法进行控制，饮食应有规律，定时定量，少量多餐，控制每日摄入的热卡，宜食各种清淡新鲜蔬菜和豆类、低脂、高蛋白、适量纤维素的食物，禁忌进食辛辣刺激、油炸、食物。饮食控制不佳者，需要静脉应用胰岛素控制者。同时对于化疗后胃纳差的患儿应警惕发生低血糖。 2.4 急性胰腺炎： 临床研究表明培门冬酰胺酶应用期间胰腺炎的发生率在1.5%左右[4]。其主要的临床表现为腹痛，上腹部为主。故化疗期间应注意观察患儿有无腹部症状，必要时告知医生查血尿淀粉酶、腹部B超或CT。培门冬酰胺酶化疗期间的合理的饮食管理对于胰腺损害的预防具有重要作用。在应用培门冬酰胺酶过程中及用药前后应选择低脂蛋白、清淡易消化食物，然后逐步过渡到普通饮食。 2.5 出院宣教： 培门冬酰胺酶应用比较方便，只需一次肌注，效应可维持2周。部分病人会在化疗方案中其他药物疗程结束时选择出院，而此时培门

左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴白血病的观察及护理

左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴白血病的观察及护理 发表时间：2013-10-12T08:44:55.670Z 来源：《医药前沿》2013年第27期供稿作者：王娟 [导读] 10例患儿有1例会出现过敏反应，4例胃肠道反应，2例肝功能损害，6例骨髓抑制，2例皮肤粘膜损害，无其它不良反应。王娟（山东省枣庄市市中区枣庄市立医院内六科 277100） 【摘要】观察左旋门冬酰胺酶治疗急性淋巴白血病毒副作用并实施有效护理。方法对10例小儿急性白血病患者进行门冬酰胺酶药物化疗，门冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病关键药物之一，并能提高疾病缓解率和患儿生存率但存在毒副作用。结果本组患儿病情缓解有效延长生存期。结论对应用左旋门冬酰胺酶的得患儿形精心护理，是减少毒副作用的主要措施。 【关键词】白血病急性左旋门冬酰胺酶毒副作用护理 【中图分类号】R473.72 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）27-0303-02 门冬酰胺酶是治疗急性淋巴性白血病的关键药物之一，在提高儿童急性白血病的持续完全缓解起着重要作用，并与ALL患儿的无病长期存活有着密切关系，但是门冬酰胺酶有多方面不良反应，如坏死性胰腺炎、血糖升高、血液系统异常、消化道反应、门冬酰胺酶相关脑病、过敏反应等。现我院血液科至2010年1月—2011年6月对10例患儿采用门冬酰胺酶治疗ALL进行观察及护理现报告如下： 1、资料与方法 1.1 临床治疗与方法：本组男4例、女6例，年龄3-10岁，平均6.5岁，10例均为两次使用门冬酰胺酶，均在诱导缓解巩固治疗阶段后，骨髓化验检查完全缓解后应用门冬酰胺酶治疗。 1.2 方法：于巩固治疗1—3周，血常规、尿常规，肝肾功能正常后经行10天一疗程。 2、结果 10例患儿有1例会出现过敏反应，4例胃肠道反应，2例肝功能损害，6例骨髓抑制，2例皮肤粘膜损害，无其它不良反应。 3、护理 3.1 心理护理：注射前医生与家属应进行沟通将门冬酰胺酶治疗的重要性及可能发生的不良反应告知家属，征得同意后方可进行，此时患儿及家长缺乏相关知识认识有局限性。尤其是儿童心理独特性在化疗过程中护士要体贴患儿及家属做好耐心细致的解释工作，分散患儿注意力与患儿交谈消除患儿恐惧，陪伴看图书，鼓励患儿及家属表达其情绪并耐心解答他们提出的相关问题，树立患儿及家属治疗的信心，并安排患儿信赖熟悉有良好沟通技巧的护士进行护理，使患儿对护士产生信赖感。 3.2 病情观察：门冬酰胺酶溶液是一种酶类制剂易容起变态反应。首先要严格执行无菌操作，正确配制皮试液现配现用，准确判断门冬酰胺酶皮试结果，每次门冬酰胺酶注射剂量严格标准执行，不能够过量，准确及时调节滴速，严密观察患儿病情变化及患儿反应，用药开始20分钟内有专门护士守护在床边进行观察，如无不良反应以后每15-20分钟巡视一次护士要与患儿沟通。听取不适主诉，询问时尽量不使用暗示性语言如是否感到心慌、胸闷、憋气、瘙痒等。主要通过客观表现观察患儿的过敏症状，观察患儿生命体征变化，如若出现皮肤发痒、心慌、面色苍白、烦躁不安等症状要立即停药，通知医生及早处理。因此用药后密切观察患儿病情变化以防过敏反映的发生。 3.3 皮肤粘膜损害：应用门冬酰胺酶化疗时如若多次注射或药物外渗会引起静脉炎或皮肤坏死固应注意：（1）保护血管：首先要选择大血管使用BD小号静脉留置针以防患儿易动而引起血管损伤，安排穿刺技术精湛，患儿信赖熟悉的护士给予穿刺，确保一次成功。静脉注射时要先用生理盐水冲洗，确定针头位置完全在静脉内方能注射药物。如果出现或疑有外渗，应立即停止注射并迅速回抽，由原位抽取3ml 血液后局部冷敷，然后用25%MgSO4湿敷，以防发生坏死，应用L-Asp化疗后引起口腔黏膜损害的要交替使用双氧水，洗必泰和制霉菌素护理口腔感染疗效好，能有效抑制口腔溃疡发生。 3.4 胃肠道反应：本组患儿有4例不同程度地恶心、呕吐和演示，要安慰患儿，分散患儿注意力，与患儿交谈，看图画书，用和蔼的语言与患儿交流（给患儿家属饮食指导，配合工作）用药前给予胃复安类药物静滴，较重者使用止吐剂口服恩丹西酮片或静推恩丹西酮。指导家属注意饮食卫生，少食多餐，宜进清淡、新鲜、少渣，刺激性小的饮食，勿进甜食和易产气食物如牛奶成豆制品等，进食前后休息一段时间，当患儿恶心、呕吐的不要让其进食。 3.5 肝功能受损，L-Asp对肝功能有损害作用，本组有2例用药后一至二月转氨酶升高，因此用药时应观察患儿患儿有无黄疸，用药前要检测肝功能，转氨酶偏高者慎用或不用，鼓励患儿饮水利于毒素排出，并使用护肝药物如甘利欣或谷胱肝肽等药物治疗，本组两例经治疗后肝功能恢复正常。 3.6 骨髓抑制：任何化疗药物均可引起，多数化疗药物抑制骨髓至最低点时间为7～14天，护肤时间为之后的5～10天，要将患儿安排在单人房间，限制过多谈事，保持环境舒适、安静，每天给予空气流通、紫外线消毒病室，从化疗开始到停止化疗2周应加强消防感染和出血措施，护理人员在操作时要严格无菌操作化疗中必须定期查血常规，每次疗程结束必要时做骨髓穿刺，及时观察疗效及骨髓受抑制情况，但白细胞<2.0X109/L，血小板<300×109/L时应给予提升白细胞药物，并加强营养。 参考文献 [1]贺秋平，张春霞.小儿左旋门冬酰胺酶过敏反应的抢救与护理8例，中原医刊，2005，32（22）：93. [2]卢愿，孙立荣，吕淑华等.左旋门冬酰胺酶的副作用及处理（附43临床病例分析），中国小儿血液，2004，9（1）：25-27.

注射用左旋门冬酰胺酶

注射用左旋门冬酰胺酶 【药品名称】 通用名称：注射用左旋门冬酰胺酶 英文名称：L-Asparaginase for Injection 【成份】 LEUNASE注，系1瓶中含左旋门冬酰胺酶冷冻干燥品5000K.U.临用时溶解的注射剂。LEUNASE注，系1瓶中含左旋门冬酰胺酶冷冻干燥品10000K.U.临用时溶解的注射剂。（1K.U.是指LEUNASE在37C分解左旋门冬酰胺并在1分钟产生μmole时的量。）【适应症】 急性白血病（包括慢性白血病的急性转化例）、恶性淋巴瘤。 【用法用量】 通常，将1日量每公斤体重50-200 KU连日或隔日静脉滴注。应随年龄及全身状态适宜增减。 【不良反应】 成人似较儿童多见。1较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退等，过敏反应的主要表现为突然发生的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿。严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至致死。在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药为低。过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有在皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。另在某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。患者如感觉剧

烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。其他尚有食欲减退、恶心、呕吐、腹泻等。2少见的有血糖过高、高尿酸血症、高热、精神及神经毒性等。血糖过高患者有多尿、多饮、口渴症状，其血浆渗透压可能升高而血酮含量正常。高血糖经停用本品，或给适量胰岛素及补液可以减轻或消失，但少数严重的可以致死。高尿酸血症常发生在开始治疗时，由于大量肿瘤细胞快速破坏，致使释放出的核酸分解的尿酸量增多，严重的可引起尿酸性肾病、肾功能衰竭。取自大肠杆菌的门冬酰胺酶含的内毒素可引起高热、畏寒、寒战，严重的甚至可致死。精神及神经毒表现为程度不一的嗜睡、精神抑郁、精神错乱、情绪激动、幻觉，偶可发生帕金森综合征等。其他尚有白细胞减少、免疫抑制、口腔炎等。3罕见的有低纤维蛋白原血症、凝血因子Ⅴ、Ⅷ等减少、颅内出血或血栓形成、下肢静脉血栓及骨髓抑制等。凝血因子减少与本品抑制蛋白质合成有关。4其他：尚有血氨过高、脱发等。对出现的不良反应的性质要仔细分析，凡有可能引起严重后果的，应立即停用本品，并结合具体表现给相应的治疗措施，危急的要积极抢救。食欲不振，恶心，呕吐，腹泻，头晕，头痛，嗜睡，精神错乱.血浆蛋白低下和血脂质过高或过低，氮质血症和肝功损害。骨髓抑制，白细胞及血小板减少，贫血，凝血障碍，局部出血，感染等.有心血管系统症状，脱发，蛋白尿。个别可发生胰腺炎。可引起过敏反应，用前须作皮试。本品可引起过敏反应，且可发生于最初疗程，皮试并不能完全预测过敏反应的发生。反应包括：皮疹、荨麻疹、关节炎、呼吸窘迫等，半数患者可出现骨髓抑制症状。其他副作用包括发热、出血、消化道反应、肝肾功能损害、胰腺功能障碍、精神神经症状等。因可出现过敏反应，初次使用及经1周或1周以上间隙再次使用时，均应作皮内试验。皮试阳性反应者作初次治疗以及对过敏反应属高危对象而仍有必要再次使用本药作重点治疗者，给予首剂前均应进行脱敏。一旦发生过敏应即用肾上腺素、吸氧和静注类固醇。用此酶治疗期间有发生各种感染的危险性，特别是革兰阴性菌感染增多。

重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法

重组门冬酰胺酶Ⅱ的表达纯化与分析 【引言】 左旋门冬酰胺酶(Lasparaginase, L SP) 是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。然而,L SP 可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了L SP 的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用L SP,就成为一个急需解决的问题。 目前国内所有化学治疗中应用的EC II 主要是依赖进口, 完成表达EC II 的基因工程菌株构建, 并逐步进行EC II 的工业化生产, 对于国内ALL 的临床化疗有积极意义。为此, 我们克隆了EC II 的基因, 在大肠杆菌中获得了高效表达, 并探讨了其突变复性及后续纯化 的简便方法。国内亦开展了类似的工作。 【目的要求】 1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。 2．掌握以基因工程菌种pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。 【实验原理】 L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，3.5.1广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。 用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB 编码。只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。国内目前用药全靠进口。1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为，紫外最大吸收值在278nm处。 本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。 rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。取1 mol/L L-门冬酰胺，1 ml mol/L 硼酸-硼酸钠缓冲液，ml细胞悬液或酶液于37℃保温15 min，速加1 ml 50%三氯乙酸终止反应，4 000 r/min离心沉淀细胞。取上清液1 ml，加奈氏试剂2 ml和双蒸水7 ml，放置15 min 后，于500 nm波长比色。在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=时为1 U）。

门冬酰胺酶的制备与分析

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定 赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山 1 原理 本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。 目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。 本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。 2 实验材料 实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。 表1.1 实验仪器或装置 仪器名称型号生产厂家 超净工作台 PCR扩增仪

恒温培养箱 超低温冰箱 台式离心机 恒温摇床 涡轮振荡器 高压灭菌锅 蛋白电泳仪 核酸电泳仪 凝胶成像仪 紫外分光光度计 高效液相色谱仪 扫描型紫外分光光度 计 制冰机 超声清洗机 实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。 表1.2 试剂和材料 试剂或材料材质或规格来源 E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存 pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司 pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司 Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司 Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司 DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司

1例培门冬酶致严重过敏反应的抢救和护理

1例培门冬酶致严重过敏反应的抢救和护理 发表时间：2017-01-22T10:29:27.963Z 来源：《心理医生》2016年33期作者：张静李文君王楠张瑶 [导读] PEG-asp与L-Asp相比较，过敏反应轻、不需要皮试、给药间隔时间长，可减少患者的注射次数及痛苦，临床上广泛应用。（济南军区总医院血液病科山东济南 250031） 【中图分类号】R47 【文献标识码】B 【文章编号】1007-8231（2016）33-0225-01 培门冬酶（PEG-Asp）注射液是一种聚乙二醇化学偶联修饰后新的门冬酰胺酶蛋白制剂，2009年SFDA批准培门冬酶（恒瑞医药）为治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）一线药物[1]。与左旋门冬酰胺酶相比，其既保留了门冬酰胺酶的活性，又降低了其免疫原性，从而降低了毒副作用，药物半衰期也延长5.5d。在治疗ALL期间，PEG-Asp相对安全又可以被较好的耐受，但发生过敏反应仍是不可避免的。李颖等[2]报道，多次使用同一制剂，过敏反应的发生率可高达25%～30%。 我科自2016年到目前应用PEG-Asp治疗ALL 18例，均获得较满意的疗效。其中1例患者在第二次用药过程中出现了严重的过敏反应，经积极抢救和精心护理，患者转危为安，现报道如下。 1.病例介绍 患者男，15岁，体重89Kg，确诊为“急性淋巴细胞白血病”4月，于2016年7月21日收入济南军区总医院血液病科四区进行治疗，化疗方案为VDLP，即0.9%氯化钠注射液125ml+长春瑞滨注射液40mg静脉滴注d1，0.9%氯化钠注射液100ml+注射用柔红霉素60mg静脉滴注d1-3，培门冬酶注射液5625IU肌肉注射d1，16d，0.9%氯化钠注射液100ml+地塞米松磷酸钠注射液10mgd1-14逐渐减量。用药前查体：神志清，精神饮食好，生命体征平稳，全身皮肤无出血点，既往无药物和食物过敏史。遵医嘱于2016年7月30日第一次应用培门冬酶注射液（恒瑞医药）5625IU分三个部位肌肉注射，观察患者无任何不适，于8月16日11:30遵医嘱给予VDLP方案（同第一次），第二次应用培门冬酶注射液（恒瑞医药）3750IU分三个部位肌肉注射，每个部位小于2ml，30min后患者突然出现胸闷憋气、眼睑水肿，继而呼吸困难加重，口唇紫绀，面部及全身出现大片皮疹，和腹痛腹泻等现象，考虑培门冬酶过敏并出现严重的喉头水肿，并立即通知医生，遵医嘱应用心电监测和药物抗过敏，测HR96次/分，R46次/分，BP105/62mmHg，SPO2 80%，立即给予吸氧用药及气管切开器械的准备，经积极抢救z症状逐渐好转，48小时后症状完全缓解，生命体征平稳，停吸氧、停输液及心电监测，后未再应用培门冬酶注射液，其余化疗药物继续使用，未再发生过敏现象。 2.抢救及护理 2.1 保持呼吸道通畅 患者用药30min后突然出现胸闷、憋气等呼吸困难症状、眼睑水肿，继而呼吸困难加重，口唇紫绀，面部及全身出现大片皮疹，和腹痛腹泻现象，立即给予面罩吸氧10L/min，协助患者取去枕平卧位，解开衣领及腰带。考虑出现喉头水肿，生理盐水2ml+地塞米松磷酸钠注射液5mg雾化吸入解痉平喘，并随时准备气管切开。安慰患者和家属保持稳定情绪。 2.2 积极用药抗过敏治疗 严格遵医嘱执行用药原则，立即给予生理盐水10ml+进口注射用甲泼尼龙琥珀酸钠40mgIV，盐酸异丙嗪注射液25mgIM抗过敏等药物，20min后呼吸困难稍微缓解，1h后遵医嘱重复给药一次并给予5%葡萄糖注射液100ml+葡萄糖酸钙注射液20mlVD，症状逐渐缓解。次日重复给药一次，48h后症状完全缓解。 2.3 密切监测生命体征 严密观察患者神志的变化，每15min测量一次呼吸、心率、血压及血氧饱和度，根据血氧饱和度的变化调整氧流量直至症状完全缓解。 2.4 腹痛腹泻的护理 立即给予热水袋腹部保暖，遵医嘱给予山莨菪碱注射液10mgIM解痉止痛，0.9%氯化钠注射液100ml+注射液奥美拉唑钠40mgVD等保护胃黏膜药物等治疗，期间嘱患者禁食，症状完全缓解后进食低脂低蛋白清淡易消化的流食或半流食并少量多餐，忌暴饮暴食。从用药前3d开始直至停药半个月，然后逐渐少量增加蛋白质饮食[3]。 2.5 急查血象 此药易导致肝功、凝血及血糖异常及时抽血化验，密切监测患者是否出现皮下出血或血栓等异常症状，结果血尿淀粉酶正常排除了急性胰腺炎；纤维蛋白原1.385g/L低于正常，D-二聚体测定1.81mg/L高于正常，其余均正常，报告医生未做特殊处理。 2.6 心理护理 此时应关心患者及家属，及时疏导患者及家属的焦虑恐惧心理，做好解释工作，取得配合。 3.小结 PEG-asp与L-Asp相比较，过敏反应轻、不需要皮试、给药间隔时间长，可减少患者的注射次数及痛苦，临床上广泛应用。通过此例患者的严重过敏反应总结今后护理工作中应特别注意和加强的事项。 首先用药前应详细询问患者是否有过敏史，尤其对此药过敏者要重点观察。备好抢救器材及药物。发生过敏反应的时间一般最迟为注射后3h[4]。用药护士及责任护士均要了解培门冬酶过敏反应的临床表现，以免耽误抢救最佳时机。其次是密切观察用药后的病情变化如呼吸困难、恶心呕吐、腹痛腹泻及神志等变化，发现异常及时报告并积极处理。要严格遵守用药原则，每个部位不能超过2ml，可分次多个部位注射。最后是出现过敏反应时，当班护士应镇定冷静处理，动作敏捷熟练有条不紊的进行积极有效的处理。积极疏导患者及家属的恐惧心理并得到积极配合。 【参考文献】 [1]赵秀峰，姜秀丽，孙爱莲.培门冬酶等化疗药物治疗儿童ALL不良反应的预防和护理[J].齐鲁护理杂志，2013，28(4):371. [2]林全德，左文丽，杜建伟，等.培门冬酶治疗儿童急性淋巴细胞白血病临床观察[J].中国实用医药，2012，7(31):278. [3]刘桂梅，王梦川.急性淋巴细胞白血病患儿应用培门冬酶后发生过敏反应的抢救和护理[J].护理实践与研究，2011，8(19):41-42. [4] SAHU S,SAIKA S,PAI S K, et al.L-asparaginase(leunase) induced pancreatitis in childhood acute lymphoblastic leukemia [J].Pediatr Hematol Oncol,1998,15(6):553-558.

重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建

实验 重组门冬酰胺酶II的制备 与分析 组员：1144301 吴雅云1144302 王世静 1144303 奚建涛1144304 逄淑云

实验目的 1. 了解构建重组质粒的原理。 2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法。 3. 了解原核细胞表达重组蛋白载体的原理。 4. 掌握重组质粒的初步鉴定方法。 5. 了解重组工程菌发酵培养、诱导表达重组门冬酰胺酶II的原理。 6. 了解重组门冬酰胺酶II通过透析法脱盐的原理。 7. 掌握透析法的基本操作。 8. 了解离子柱交换吸附技术的原理。 9. 掌握离子柱交换吸附技术分离、纯化重组门冬酰胺酶II的方法。 实验原理 门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。目前临床上使用的L-ASP泛指来源于大肠杆菌的E.coil L-ASP II。从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coil天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pka/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. Coil L-ASP开辟了新的道路。 第一链cDNA合成用一个经修饰的olig（dT）引物CDSⅢ primer，SMARTⅢ寡核苷酸作为mRNA5＇端延伸出去的模板，当逆转录达mRNA5＇端时，逆转录具有模板不依赖性的在第一链cDNA3＇端加上几个C，与SMARTⅢ寡核苷酸3＇端的几个G配对，从而使寡核苷酸连接到mRNA5＇端。逆转录酶跳移并以SMARTⅢ寡核苷酸为模板，反转录至SMARTⅢ寡核苷酸的末端，而这种跳移常常发生在真核生物的mRNA帽子结构-m7GpppX，这样反转录出的cDNA包含mRNA完整的5＇及SMARTⅢ寡核苷酸的互补序列，再用PCR合成cDNA第二链，PCR的引物是CDSⅢ primer及SMARTⅢ寡核苷酸上的一段-5＇PCR Primer。那些过早终止逆转录的非全长cDNA因不具有SMARTⅢ寡核苷酸而不能作为模板被扩增，只有含全长mRNA和SMART Ⅲ寡核苷酸的cDNA才能在扩增反应中作为模板被扩增合成第二链cDNA〔3〕。然后经酶切与载体连接，从而构成了全长的cDNA文库。此文库所分离的cDNA克隆包含了相应mRNA分子完整的5＇非编码区序列，为研究目的基因在翻译水平上调控机理奠定了重要基础。 聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 制备感受态细胞原理：CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。 化合物诱导转化法原理：外源 DNA 与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨