生物技术综合大实验讲义

生物技术综合大实验

2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化

1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地

亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。

细胞生物学实验讲义

细胞内DNA和RNA的显示 一、目的要求 1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。 2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。 二、实验原理 核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。 三、器材与试剂 1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。 2、材料：鸡血。 3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。 4、试剂的配制 （1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。 （2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。

甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。 （3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。 （4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。该液应现配现用，不宜久置。 四、内容与方法 1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。 2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。 3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。 4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。 5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。 6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。 五、作业与思考 1、简述DNA和RNA的染色原理。 2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？

实验生物学讲义

实验四多重序列比对及系统发生树的构建 【实验目的】 1、掌握使用Clustalx进行序列多重比对的操作方法； 2、熟悉构建分子系统发生树的基本过程，掌握使用MEGA软件构建系统发生树的操作方法。 3、进一步熟练BLAST的使用 【实验原理】 在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。 对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤： ⑴要对所分析的多条目标序列进行比对； ⑵要构建一个进化树（phyligenetic tree）。 构建进化树的算法主要分为两类：基于距离的方法和基于形状的方法。基于距离的方法是指计算序列之间的两两距离，构成距离矩阵，然后采用聚类算法推断进化树。最常见的基于距离的方法是UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean，不加权算数平均对群法）与Neighbor-joining（邻接法），前者不如后者准确。基于性状的方法是指把序列中每个位点的状态视为性状，建立进化树模型来描述序列之间的性状差异。最常见的基于性状的方法包括最大简约法，最大似然法以及贝页斯方法。基于距离的方法相对于基于性状的方法，在计算速度上快很多，而且适用于各种类型的数据（如SNP数据，基因表达数据等）；基于性状的方法计算速度较慢，搜索空间更大，得到的结果也往往更加准确。在研究中一般都会尝试不同的方法来建立进化树，综合多种方法得到的结果更加可靠。 ⑶对进化树进行评估。进化树的构建是一个统计学问题，我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟，需要进行统计学检验和评估。现在主要采用的方法是bootstraping，该方法的原理是每次以位点为单位对用于建树的多序列比对进行重新采样，看得到的进化树跟使用原有多序列比对得到的进化树的相似性。简单的说，就是看如果只用多序列比对的部分信息（2/3左右）构建进化树，得到的序列间的关系是否比较稳定。 在实际应用中，多序列比对常用的软件包括ClustalW/X, MUSCLE, MAFFT 等，三者的准确性相当，但计算时间依次减少；进化树构建常用的软件包括PHYLIP(软件包，包括多种建树方法），MEGA，MrBayes，Phyml等等。从用

1生物学实验常用技术

生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)

(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只

细胞生物学实验指导(精)

细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜

头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。

生物技术大实验考试复习题

生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

生物技术专业介绍

生物技术专业介绍 生物技术专业是于2000年设立并正式开始招生，经过多年的建设，现已成为学校的优势专业，是山东省特色专业，又是山东省应用型特色名校工程重点建设专业。 一、人才培养目标 培养德、智、体、美全面发展，系统掌握农业生物技术的基本理论、基本知识、基本技能，具有较强的自主学习能力、实践能力、创新能力，能够支撑现代农业生物技术产业体系，服务于山东区域经济社会发展的高素质应用型人才。 二、特色和优势 1. 构建了一支高学历、教学经验丰富、科研能力强的一支师资队伍。本专业现有专职教师70人，其中正高职称22人、副高职称28人，讲师20人，高级职称教师占71.4%；具有博士学位的教师57人，占专职教师的81.4%；具有国外学习和研修经历的19人；泰山学者海外特聘专家3人、山东省教学名师2人、国务院特殊津贴获得者1人、“留学回国人员成就奖” 获得者1人、博士生导师4人。 2. 具有生物学科特色。本专业具有植物学、动物学、微生物学、生理学、遗传学等多学科支撑，以及生物化学与分子生物学省级重点学科支撑，生物学科特色鲜明。我们在生物技术专业的建设中，以厚基础，宽口径为前提，在课程体系与教学内容上力求突出自身的学科优势，形成专业特色，培养高素质应用型生物技术专业人才。 3. 以科研促教学，提高人才培养质量。（1）通过科研，提高教师自身素质，为提高教学质量提供了重要保证；（2）科研促进了教学条件的建设。在投资1000多万购置实验仪器的基础上，目前又新组建了科研用组培室与炼苗室各1间及教学用组培室与炼苗室各1间，极大充实了教学条件；（3）科研充实了教学内容。通过科研，提高教师学术水平，把新知识、新观点及时充实到教学中，激发学生对学科的兴趣，切实提高教学质量；（4）科研培养学生动手能力、创新思维。本专业于2003年率先在全校实施了“本科生导师制”制度，使学生从大二开始进入实验室，参与教师的科研活动，独立设计试验并完成科研任务，切实提高学生独立操作能力及创新能力。 三、学科建设 本专业为山东省特色专业，先后获得生物化学与分子生物学、遗传学、植物

细胞生物学实验讲义

《细胞生物学》 实验指导 目录 实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2 实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2 实验三细胞内糖类的显示（验证性）2 实验四细胞Feulgen反应（验证性）2 实验五动物细胞培养（综合性）4 实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4

实验一细胞大小测定和生物绘图法 一、实验目的 1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。 2. 掌握生物绘图的基本方法。 二、实验原理 （一）测微尺的原理 测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。 将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度： 物测微尺格数 目微尺每格所代表的实际长度= ×10um 目测微尺格数 例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。 测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。（二）生物绘图的基本要求 1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。 2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。 3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。 4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。 5. 绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 6. 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。 三、实验材料和实验用品 1. 实验材料：口腔黏膜上皮细胞，洋葱内表皮，西红柿，芹菜，韭菜，红辣椒 2. 实验用品：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签、烧杯、吸管、0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、蒸馏水、吸水纸，HB及2H或3H绘图铅笔、橡皮、直尺、绘图

《生物技术基础实验-Ⅰ》教学大纲.doc

《生物技术基础实验-1》教学大纲 课程编号：0231209 课程名称：生物技术基础实验-1 实验学时：80 %1.实验课的性质、任务与目的 地位： 生物技术基础实验- I所依托的理论课主要有普通生物学、生物化学和微生物三门课程。因此，生物技术基础实验-1起着承上启下的作用，它是学生在完成化学基础实验后向生物学专业实验过渡的桥梁，是培养“生物”意识的起始，对后续专业理论课和实验课的学习具有重要的影响。 作用： 普通生物学是高等院校理工类生物技术专业的一门实践性很强的基础课程。实验环节的教学对于学生加深理解并掌握基木概念、原理、理论和研究方法，培养其实验技能、形象思维和创新能力有着重要的作用。 微生物学一门以实验科学为基础的学科，生命学科很多理论上的突破都是基于微生物学实验而取得的。对生物技术专业来说，微生物学实验课程的设置，不仅是必需，而旦是需要加强的。微生物实验课程是进行本专业其它学科的学习所必需具备的主要基础知识之一。任务：生物化学实验的任务是教授生物化学实验技术的基础理论及应用，并通过具体的实验教学使学生掌握常用的生物化学实验技术理论和方法，并能进行独立的实验操作，促进学生创新意识的形成和综含素质的提高。 通过微生物学实验课程的学习，要求学生能牢固树立无菌概念，熟练掌握一整套的无菌操作技术，学会常规仪器、设备的正确使用，了解在生物学科研工作中常用的材料、方法和手段，尽量多提供动手机会，使学生具备训练有素的操作能力，并且能够运用理论知识来分析解释实验过程中的现象和结果，作出正确的推理和判断,使理论与实验课的学习相辅相成, 培养学生实事求是的科学态度和良好的工作作风，为学习后续课程打下基础。 目的： 1 .使学生了解“生物大分了的分离和纯化方法，糖、蛋白质及主要次生代谢产物的定性、定量和有关生物化学性质的分析技术。 2.使学生掌握酶活性测定、动力学分析等基本知识、方法和基木技能技巧。

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

生物技术应用中心实验室建设方案

生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激

励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。

本科生六个基本生物学实验

实验一：感受态细胞的制备 1.原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2.实验材料 2.1LB液体培养基 2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中， 定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。 2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱 3.操作方法 3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。 3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。 3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。 3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。 3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。 3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。 3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。 3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。

细胞生物学实验讲义 2018

细胞生物学实验讲义 实验一不同细胞形态观察、大小测量，结构比较 一、实验目的 利用光学显微系统对生命的基本组成单位——细胞进行观察，了解不同细胞的形态、结构和大小区别。 二、实验原理 细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构入手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。 三、实验内容和步骤 A、血涂片的制作 1．取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的载玻片作为推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载玻片保持30～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。 2．操作 ①将干燥血片用甲醇固定3-5分钟。 ②将固定的血片置于被pH6.4 -6.8磷酸盐缓冲液稀释10-20倍的Giemsa染液中，浸染10-30分钟（标本较少可用滴染法）。 ③取出用水冲洗，待干后镜检。 注意： ①取血滴不宜过多，以免涂片过厚，影响观察。 ②要使涂片厚薄均匀、拿片角度和速度都要适中，用力要均匀。涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。 ③涂片一般在后半部为好，白细胞在边缘和尾端较多。 B、洋葱表皮临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水 2)用刀片在洋葱鳞片叶内侧表皮上，划出2-5平方毫米的小方格，然后用镊

子撕下方格内的表皮放在载玻片的水滴中。 3)用镊子将表皮展平。 4)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的水滴，慢慢放平。3.染色 1)用滴管在盖玻片的一侧滴适量稀释的碘酒。 2)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸染液。 4.观察 C、人的口腔上皮细胞临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水。 2)用凉开水漱口，取消毒牙签在口腔侧壁上轻刮几下，将刮下的碎屑在载 玻片的液滴中涂抹均匀。 3)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，慢慢放平。 3.染色 a)用滴管在盖玻片的一侧滴适量碘液。 b)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸碘液。 4.观察 四、实验准备 1.器材：普通光学显微镜，牙签、酒精棉球、载玻片。 2.材料：洋葱表皮，口腔上皮，血涂片，永久制片。 3.试剂：碘液，Giemsa染液，生理盐水，甲醇，香柏油。 五、作业 描绘你所观察到的各种细胞的结构及大小（以比例尺表示）。 1、血液涂片（必做）。 2、永久制片，洋葱表皮，人口腔上皮选做其一。 实验二植物细胞微丝束的观察 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝R250染植物细胞内微丝束的方法。了解在微丝束细胞内的分布特点。 二、实验原理

生物学基础实验技能讲义

生物学基础实验技能 实验讲义 王玉倩冯晓英郭娟张潮汤晓辛唐婧编 贵州师范大学生命科学学院 2012年6月

目录 一、显微操作 (2) 实验一显微镜的使用方法与绘图 (2) 实验二简单临时装片的制作与观察，油镜的使用 (6) 实验三压片的制作，涂片的制作 (8) 实验四生物材料的解剖结构观察 (10) 二、溶液配制 (11) 实验五玻璃器皿的洗涤 (11) 实验六、溶液的配制Ⅰ (13) 实验七、溶液的配制Ⅱ (15) 实验八溶液pH值的调节 (18) 三、分光光度计的使用 (20) 实验九分光光度法的介绍及分光光度计的使用方法 (20) 实验十混合物中CuSO4的测定 (24) 实验十一分光光度法测定叶绿素的含量 (26) 四、无菌操作 (28) 实验十二无菌操作技术 (28)

一、显微操作 实验一显微镜的使用方法与绘图 一、实验目的 1、掌握显微镜的构造及原理，熟练使用光学显微镜。 2、了解显微镜使用的基本要求、注意事项及一般维护方法。 3、学习生物绘图的基本要求及方法。 二、实验原理 显微镜的原理是经过两次成像，成为倒立的虚像。第一次先经过物镜成像，在物镜的一倍焦距和两倍焦距之间成放大的倒立的实像。第一次成的物像，经过目镜的第二次成像，是一个虚像。倒置的像常常使初学者使用发生困难。 1、显微镜的构造 机械部分 (1) 镜座 显微镜最下面呈马蹄形或园形的部分，起稳定和支持镜身作用。 (2) 镜柱 从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。 (3) 镜臂 弯曲成马蹄形的部分，便于手持，下端与镜柱相连接的地方有一个倾斜关节，可使镜臂倾斜，便于观察。 (4) 载物台 自镜臂下端向前伸出，放置标本用的平台，其中央有一个园孔，叫通光孔。台上有一移动器（老式的左右各有一个压片夹），用以固定和移动标本。 (5) 镜筒 和镜臂上方连接的园筒部分。有的显微镜镜筒内有一抽管，可适当抽长，一般长度是160－170毫米。镜筒上端装有目镜，下端有一个可转动的园盘，叫物镜转换器（或叫物镜旋转盘，固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜）。作用是保护成像的光路与亮度。 (6) 调节器（也叫调节螺旋） 为镜壁上两种可转动的螺旋，一大一小，能使镜筒上下移动，调节焦距。大的叫粗准焦螺旋，位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距，升降镜筒较快，用于低倍镜对焦；小的叫细准焦螺旋，位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，升降镜筒较慢，可以细调焦距。 (7) 倾斜关节 镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°）便于观察。但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体。 (8) 载物台 从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片。较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移

生物技术实验解析

实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。

细胞生物学实验指导书09年

实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察

（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤

《生物化学》实验讲义

实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在 碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。

3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL ，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g 茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH 溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH 溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。 (2) 另取1支试管，加入1mL 蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH 溶液摇匀，然后再加入 2滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL ，再加 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH

西北农林科技大学-生物技术综合大实验

生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <