当前位置：文档库 › 杆状病毒

杆状病毒

然已发现用于害虫防治。DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。插入，因此就是表达大片段。该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证

病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒

就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该

病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。

AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期

基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复

制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。

1、杆状病毒基因组得结构与功能研究

以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。DNA 杆状病毒基因组为双链环状

在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜

(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白与髓核(COle)。其中衣壳蛋白就是杆状病毒粒子得主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子与与其密切相关得碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序得超螺旋结构。目前已知基因组全序列得杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。目前AcMNPV基因组得研究最为深入，它就是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。AcMNPV基因组得基因组织(gene organization)较为复杂，基因组得不同区域具有功能分化，基因得分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等得重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间得不完整回文序列及其两侧各约20bp得序列构成。同源区就是杆状病毒基因组普通存在得功能域结构，对于基因表达得调节具有增强作用，同时也就是 DNA复制得原点。

杆状病毒中现已鉴定得基因近70种，可分为结构蛋白基因与非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6、9、gp41、vp39等基因。非结构基因中，与DNA复制相关得重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用得基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。这些代表性基因与其功能得关系见表1。2．杆状病毒载体表达系统得特点

AcNPV病毒用作外源基因得表达载体，通常就是通过体内同源重组得方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录与翻译，一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒得感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒得功能。杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白得表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。相对其她表达系统它具有以下几个方面得特点：

①组蛋白具有完整得生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达得外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键得搭配及寡聚物得形成提供良好得环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

②②能进行翻译后得加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整得翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段得切割与分解等，修饰得位点与天然蛋白在细胞内得情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生得糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰得寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目得蛋白得活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面得理想模型。

③③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出得特点就就是能获得重组蛋白高水平得表达，最高可使目得蛋白得量达到细胞总蛋白得50％。

④能容纳大分子得插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大得基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳得外源基因长度得上

限。

⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时④表达多个基因得能力。既可采用不同得重组病毒同时感染细胞得形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性得异源二聚体或多聚

体。另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切得功能，能表；还有对重组蛋白进行定位得功能，如将核蛋白转送到细胞核DNA达基因组上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。最后，杆状病毒％动物细胞中没有对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N- 活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性得蛋白时可能优于其它系统。⑤

杆状病毒载体得重组与筛选．3外源基因得克隆不能通过酶切连接得

方式直接插杆状病毒由于基因组庞大，克隆)(如多角体基因及其边界区入，必须通过转移载体得介导．即将极晚期基因'端对高效表达入细菌得质粒中，消除其编码区与不合适得酶切位点，保留其5即得到转移必需得调控区，并在其下游引入合适得酶切位点供外源基因得插入，共转染AcNPV DNA载体。将要表达得外源基因插入其启动子下游，再与野生型使多角体蛋白基因被外源昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，由于多角体基因被破坏，基因取代。而将外源基因整合到病毒基因组得相应位置，可同野生型具有多角体得则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，但由于重组效率较，这就就是最初得筛选重组病毒得方式。病毒空斑区别开来

经过不断探索，为此，，)表型差别不显著，应用上有一定得困难。(0、1％-1％低在重组杆状病毒得筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。

半乳糖苷酶得蓝白筛选1

2 体外酶促定位重组

Bacmid 3

TK基因4

Neo5

基因

3.1．半乳糖苷酶得蓝白筛选

1990年，Vialard等在多角体基因得上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒得筛选。1990年，Kins提出了线形化技术，其原理就是线形化得杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内得同源序列进行同源重组得能力。如果同源序列位于线形化杆状病毒得两端，则基因组即可环化恢复完整得感染性，使阳性重组率大大提高。蓝白斑筛选

蓝白斑筛选就是一种基因工程常用得重组菌筛选方法。

野生型大肠杆菌产生得β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯

-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖与深蓝色得物质5-溴-4-靛蓝。有色物质

而颜色变化就是鉴定与筛选得最直观有效得可以使整个培养菌落产生颜色变化，方法。。这种宿半乳糖苷酶缺陷型菌株设计适用于蓝白斑筛选得基因工程菌为β-半乳糖-主菌得染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶得基因突变，造成其编码得β从而不具有生物活性，，段一个146个氨基酸得短肽（即α肽链）苷酶失去正常Nlacz'用于蓝白斑筛选得载体具有一段称为即无法作用于X-gal产生蓝色物质。半乳糖苷酶得启动子；编码α肽链得区段；一个-得基因，lacz'中包括：一段β得选择性插入DNA(MCS)。MCS位于编码α肽链得区段中，就是外源多克隆位点虽然上述缺陷株基因组无法但其本身不影响载体编码α肽链得功能活性。位点，得质粒后，质粒lacz'单独编码有活性得β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带半乳糖苷酶突变体-lacz'基因编码得α肽链与菌株基因组表达得Ｎ端缺陷得β生成蓝色物质得能力，这种X-gal互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同得作用互补。现象即α-半乳lacz'中得β--Ｄ-半乳糖苷)以激活操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β以上就是携在含有X-gal得固体平板培养基中菌落呈现蓝色。糖苷酶得启动子，得载体连接DNA（即目得片段）与含lacz'带空载体得菌株产生得表型。当外源，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它时，会插入进MCS半乳糖苷酶，即不可分解培导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β- 养基中得X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。得平板培养基含X-gal 实验中，通常蓝白筛选就是与抗性筛选一同使用得。

一次筛选可以判中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应得抗生素，这样，断出：未转化得菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒得菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒得菌，即目得重组菌，长成白色菌落．体外酶促定位重组 3、2个重组位点含有1SternbergCre-Loxp系统最早由等最早建立，噬菌体Pl

为重组所必需：酶)个Cre酶基因，其产物(CreLox(1ocus of(rossover)与1bp 个核苷酸组成，其两端为13 Lox序列已被测定由34Cre酶已被克隆纯化；基因组即得将此序列引入AcNPV8 bp得非回文序列。得反转重复序列。中间为。lox 后可获得ploxvAclox，转移载体引入酶存在条件下，两者即可发生体外定点重组，而将载体Cre plox在vAclox与将反应混合物转，个可逆酶促反应)(上得相应序列转到病毒得基因组中这就是1细胞中，即可得到高比例得重组子代frugiperda)sf草地夜蛾(spodoptera 染通过控制反应得条件可达到很高得重

组率。这个方法得特点就是体外重组，病毒。反应产物往往就是转移载体多次插入亲代病毒得但由于重组就是位点特异性得，结果，因而要进行多轮空斑实验纯化病毒。

3.3.Bacmid

后来Luckow等又发明了一种新得杆状病毒重组技术。她们根据 F因子载体原理，用类似于酵母体内重组得方法，构建了一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。Bacmid 含有F因子复制子(可在大肠杆菌中复制)、卡那霉素抗性基因及Tn7转座位点attTn7。转移载体中，外源基因置于杆状病毒启动子之下，两端分别为Tn7得左右端。以其转化含Bacmid得E coli菌株，由辅助质粒提供反式作用发生转座，而将外源基因转到 Bacmid得attTn7位置。这种重组了外源基因得 Bacmid转染得昆虫细胞，可得到 100％阳性重组病毒。这种方法都就是同样不需进行空斑纯化。，由于没有本底干扰非常简便，在大肠杆菌中进行得，

缺点就是 F因子提取不很方便，其稳定性也有待于观察。

英文全称 Baculovirus plasmid 中文解释杆状病毒质粒 [带有杆状病毒基因

组得质粒，可在细菌与昆虫细胞之间穿

] 梭

Baculovirus plasmid简易提取方法：

挑白斑摇菌8h左右（一般会过夜摇），取2ml菌液，12000rpm ，30s，弃上清即可

1．溶液I—溶菌液：（加 300ul 将离心完得菌液混匀）

溶菌酶：它就是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁得主要化学成分肽聚糖中得β

-1,4糖苷键，因而具有溶菌得作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液得粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA得降解作

用（DNase作用时需要一定得金属离子作辅基）;（2）EDTA得存在，有利于溶菌酶得作用，因为溶菌酶得反应要求有较低得离子强度得环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液(加300ul ，裂解5min，轻柔混匀，最好不要拿枪吹，上下颠倒混匀就行)：NaOH：核酸在pH大于5，小于9得溶液中，就是稳定得。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键得解离而变性。在溶液II中得NaOH浓度为0、2mo1/L，加抽提液时，该系统得pH就高达12、6，因而促使染

色体DNA与质粒DNA得变性。

SDS（2%）：SDS就是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上得脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中得核蛋白。（3）SDS 能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质得复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但就是SDS能抑制核糖核酸酶得作用，所以在以后得提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3、溶液III--3mol/L NaAc（pH

4、8）溶液（主要就是沉淀蛋白得，加后轻柔

混匀，冰上放置15min）： NaAc得水溶液呈碱性，为了调节pH至4、8，必须加入大量得冰醋酸。所以该溶液实际上就是NaAc-HAc得缓冲液。用pH4、8得NaAc 溶液就是为了把pH12、6得抽提液，调回pH至中性，使变性得质粒DNA能、DNA 有利于变性得大分子染色体NaAc3mol/L 而高盐得并能稳定存在。够复性，

减少前者就是因为中与核酸上得电荷，以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。RNA －蛋白复合物作用后，能形成较小SDS相斥力而互相聚合，后者就是因为钠盐与得钠盐形式复合物，使沉淀更完全。，：1）、将冰上放置得混合液12000rpm，10min 离心，取上清加异丙醇（1410min

左右，再12000rpm离心然后冰上放20min管底部1ml洗一下（加完后应该能瞧到在EP5、弃上清，加预冷得75%乙醇有一小块白色得沉淀），12000rpm离心）、然后弃乙醇，留下白色沉淀（如果沉淀飘起，可以再6 TE或双蒸水凉干，加50ul 左右）（一般情况下应该有80-100ng/ul溶解片刻即可。基因、4．TK3该核苷可将核苷类似物转变成得有毒得中间体而抑制病毒得复制。胸苷激酶得底物，能特异性地抑制单纯疱疹TK)(HSV—类似物作为疱疹病毒编码胸苷激酶病毒得

复制。由于这些类似物对病毒得胸苷激酶有高度病毒、巨细胞病毒与EB选择性地杀而细胞自身胸苷激酶对这些类似物得结合常数很低，故能得选择性，。死表达HSV-TK基因得细胞 Loss of the tk gene TK基因缺失

编码胸苷激酶tk），VZV－基因编码区大片段缺失 tk基因（包括HSV－tkTK还可以催化一些核苷类除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸普酸，，病毒得TK（TK）近年，许多学似物磷酸化，这些磷酸化后得核苷类似物对哺乳细胞有根强毒性。者用多种载体将病毒止基因转入肿瘤细胞，配合核苷类似物作为前药治疗肿瘤，动物实验效果肯定，现正进入临床研究。

3.5．Neo基因

Neo抗新霉素得抗药基因,一般用来作为基因表达载体得筛选、表达目得基因得载体同时带有该基因、这样在培养液加入新霉素、没有被转染得细胞没有抗药性,就不能存活、

Neo就是经典得显性选择标记，这就是一种细菌编码得磷酸转移酶基因，可使氨基糖苷类抗生素 G418失活。后者又就是一种蛋白质合成抑制剂，可干扰真核细胞80S功能。Neo曾被引入几种脊椎动物病毒(如痘苗病毒与EB病毒)得基因组中，作为选择标记。1989年，Jarls将Neo引入sf细胞染色体中而得到 G418抗性得细胞系，说明Neo可作为选择标记用于重组病毒得筛选。本方法与TK基因相

比较略显繁琐，需经连续传代，但其不用改造辅助病毒，只需在转移载体中引入Neo基因即可。其它如 PCR、DNA斑点杂交及有限稀释法等，也可用于筛选重组病毒。

以上方法各具特点。虽然有些新方法需一定得条件，但一旦建立起来后就可方便、迅速地得到重组病毒，为杆状病毒表达系统得普及应用创造了良好得条件

4 ．影响外源蛋白表达得因素

利用杆状病毒昆虫表达系统表达外源基因得理论基础，就就是杆状病毒得基因表达与调控，但有关病毒晚期基因高表达与其调控机制目前还不十分清楚。利用多角体基因得启动子表达外源基因，影响表达水平得因素除与病毒本身得因素有关外，还与受感染细胞得种类与生理状况乃至培养基得质量有关。

4、1．病毒得稳定性杆状病毒在细胞中多次传代后，可能引起基因组得变化。最明显得变化就就是形成ov得能力降低。由于细胞间不需要ov形成感染，只需通过BV病毒感染即可。多次传代得病毒也可能出现少多角体(few polyhedfin，FP)表型得变化，一般每个感染细胞只含有10个多角体病毒。其中突变病毒多角体得表达水平也有所降低，应用这种突变病毒会对外源基因得表达带来不利。若重组前病毒就是变异FP，通过肉眼分辨重组与非重组病毒时，有可能发生假象。另外，长期多次传代得病毒也往往引起表达水平得降低，为避免上述情况得发生，要限制病毒得传代次数，一般控制在2-3代以内。

4、2．在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达虽然目前大部分工作就是在细胞培养条件下进行得，当需要大量制备某类表达产物时，最好采用昆虫蛹。因为培养昆虫幼虫远比培养细胞简单、便宜，而且在昆虫体内培养可以提高表达量。一般在幼虫体内得淋巴液中，蛋白含量较在细胞培养基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3得表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高500倍，可能就是细胞培养基中含有得蛋白酶使之降解所致。

4、3．启动子类型在构建转移载体时，使用不同得启动子就需构建相应得同源序列。目前最常用得启动子有晚期Polh(polyhedrin)启动子与P10启动子，还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一目得基因在不同启动子控制下，表达水平会有很大差异。研究发现，分泌类蛋白使用PIO启动子或碱性启动子得效果更好。

4、4．外源基因序列得本身因素能在重组杆状病毒有效表达得外源基因5'端及3'端非编码区越短越好，一般长度在3～400个核苷酸以内。

影响表达得其她因素包括：密码子得使用情况(就是否为昆虫细胞所常用)、mRNA 得稳定性及蛋白质得稳定性等。外源基因附近得序列很重要。Kozak分析了数百个真核序列，得出两点结论：首先，启动子下游第1个ATG常作为起始密码子；其次就是在 ATG附近得序列并不就是随机得。有95％表达得真核基因在ATG前-3位就是嘌呤(而且常就是A)，+4位就是G。如果-3得A或+4得G有1个被嘧啶替代，翻译水平就下降5~l0倍。如果-3位与+4位均被嘧啶所替代，翻译水平就下降20倍。因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G就是高等真核基因起始密码附近得保守序列，其中-3处A最为保守。

4、5．重组病毒基因得表达与调控

多角体启动子控制得外源基因得表达，紧靠上游得序列对基因得转录调节就是最重要得。许多研究表明，当外源基因5 端加有1～58个多角体蛋白得氨基酸序列以融合蛋白形式表达时，效果最好。用高、中与低3种表达得外源基因进行实'端序列与外源基因以相同得框架相融合，5验得结果表明，保留一部分多角体．表达水平最高；如果框架不同，那么从距启动子最近得起始码开始翻译，表达产物水平相对偏低。

5 ．昆虫杆状病毒系统表达外源基因得新进展

1 杆状病毒载体及其表达系统进展

昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时，存在得一个问题就是筛选带有外源基因得重组病毒得效率较低(最初仅0、1％～1％)，而且产物较难纯化。为此，

人们设计了各种方法来改进病毒载体，如 NPV DNA线性化，体外定点酶促重组，以及酵母-昆虫细胞与大肠杆菌-昆虫细胞得穿梭载体得开发等。其中Posse等设计得重组-救活可线性AcNPV病毒载体BacPAK6得重组效率较高，高达80％以上，具有重要得应用价值。

该重组技术得基本原理为：先找一个在 AcMNPV基因组中不存在得 Bsu36 I酶切位点，采用体外突变，在多角体基因两侧得非必需基因ORF603基因与必需基因ORF1629基因中各引入一个Bsu36 I位点，然后通过重组将突变了得由ORF603基因、多角体基因启动子控制得半乳糖苷酶基因、ORF1629基因引入AcNPV基因组，获得重组病毒载体BacPAK6。(BacPAK6)DNA经Bsu36 I酶切而破坏了必需基因OBF1629，因而靠自身环化不能成活，必须与携带多角体蛋白基因启动子控制得外源基因与OBF1629基因得转移载体发生重组，病毒才能复制而救活，因此，该法得重组率很高。这一系统现已扩展到了BmNPV表达系统。

易咏竹等副通过克隆得家蚕核多角体病毒解螺旋基因DNA，与重组救活可线性化得苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒(BacPAK6)DNA在昆虫细胞中

发生重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf-21得宿主域扩大得昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因得转移载体

Pvl1393phy在家蚕细胞中得重组率达90％以上。

此外，Bac—to．Bac表达系统就是效率很高得表达系统，它利用穿梭质粒bacmid 在大肠杆菌中高效复制后，再提纯用于转染昆虫细胞，大大缩短了时间。王汉中等根据BactoBac表达系统得基本原理，也构建了一种新颖得棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统(HaBac—to—Bac)。该系统中供体质粒pFastPhP10中插入了带有多角体启动子序列得完整得多角体蛋白基因，因而多角体蛋白基因得表达与包涵体得形成也可作为转染成功得重要识别标记等，这就是商品化得 AcBac —to．Bac系统所不具备得。

目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统得细胞系较多，但应用较多得细胞系就是秋粘虫s、frugiperda卵巢组织得细胞系sf-9，以及家蚕细胞系。洪华珠等建立了一株高水平表达重组蛋白得昆虫细胞系HNU—Tn、FB1。它就是粉纹夜蛾Trichoplusia ni脂肪体得传代细胞系。在辅以 5％胎牛血清得商品无血清培养基 Excell400中，该细胞群体得倍增时间为22、9h，最高密度可达2、2×106／ml，表达由AcMNPV构建得重组p、半乳糖苷酶得水平达(225、5±13、4)IU/ml。该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好得“高五”细胞(BTI．Tn．5B1-4)相当，就是一株很有价值得细胞系，具有广阔得应用前景。

另外，一些影响杆状病毒系统表达外源基因产物得因素在近两年得到了研究。杆状病毒吸附宿主细胞得动力学参数就是影响细胞感染效果与表达物产量得因素之一。

Petricevich等以表达轮状病毒得重组蛋白VP4为例，对病毒吸附动力学得参数进行了研究，发现影响细胞感染效果得主要参数就是胎牛血清浓度。不用胎牛血清或经高温处理后再使用，反而可以获得更高浓度得表达产物。．

重组病毒感染 sf-9得效果与细胞周期有关，Saito等对GFPuv基因在杆状病毒系统中表达得研究表明，当在宿主细胞得G、期感染时，细胞内得荧光强度就是在G2／M期感染得 1、3倍，同时在宿主细胞得G。/S期感染时，感染量就是在G：/M期感染得1．5-1．8倍。该研究结果对于选择病毒感染宿主细胞得时期有一定得借鉴意义。

01ejnik等讨论了高渗透压对昆虫细胞表达重组蛋白产量得影响。采用补料分批

培养发现，Trichoplusia ni BTI、TN、5B1-4(Tn-5)细胞具有很强得耐高渗透压能力，表达得重组核蛋白产量比等渗环境下得高出72％。该结果对于提高重组蛋白得产量具有重要意义，可能得原因就是高渗透压下，葡萄糖得比耗率增加，细胞内重组蛋白得合成代谢更加旺盛。

另外，杆状病毒易被紫外线钝化，Dustin等将海藻病毒得嘧啶特殊二聚物糖基化酶(CV．PDG)用杆状病毒(AcMNPV)表达后，发现重组 AcMNPV受紫外线钝化得影响比野生型降低了3倍。该研究为提高杆状病毒抗紫外线能力提供了一个可行得办法。

昆虫杆状病毒系统得应用展望

1 对外源基因克隆容量大

2 重组病毒易于筛选

具有完备得翻译后加工修饰系统3

高效表达外源基因得能力4

杆状病毒表达系统由于对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有完备得翻译后加工修饰系统与高效表达外源基因得能力等特点，现已广泛用于一些在其它表达系统表达有困难得高价值蛋白质得表达。新近报道得如人骨骼肌基因突变而产生得a-辅肌动蛋白，一直未找到较好得系统来表达它。Akkari等首次采用杆状病毒系统实现了它得高效表达与纯化。钙运转调节肽(caltfin)在动物授精过程中可以抑制钙流人精子，避免过早地产生顶体反应而导致授精失败。目前获取它得唯一方法就是从动物体内提取，但如能通过生物技术手段大量生产，无疑具有广阔得应用前景。Phan等首次用昆虫杆状病毒系统高效表达了cahrin，并筛选出了有效得纯化方案。新近用杆状病毒表达系统表达成功得其它一些高价值蛋白

由于昆虫杆状病毒表达系统独特得性质，现已被广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域中。近几年得研究发现，AcNPV病毒也可以将外源基因导入哺乳动物得细胞，如人得肝细胞。这意味着AcNPV病毒可能成为哺乳动物基因治疗得媒介载体，因此杆状病毒有望在未来人类得基因治疗中得到应用。另一方面，利用昆虫杆状病毒系统进行重组杆状病毒杀虫剂得研究也仍然具有十分重要得意义。由于昆虫杆状病毒对人、畜安全，不易引起广泛规模得生态平衡得破坏等特点，昆虫病毒杀虫剂已成为当今生物农药研究与开发得热点。但野生型杆状病毒有必要进行重组改造，因其杀虫速度较慢。

如该系统无法进行连续性表达；糖基化方式与哺乳动物细胞存在一定差异，在杆状病毒系统得基础研究与应用而复合寡糖缺乏。糖侧链甘露糖得成分较高，

技术方面，目前杆状病毒得基因组学，特别就是功能基因组学得研究相对薄弱，有关病毒晚期基因得高表达与调控机制等仍不明了。另外杆状病毒可能得其它宿主还不十分清楚，表达产物得纯化与多元表达等方面得技术还不够理想等，都需要今后进一步研究。当前应重点加强杆状病毒得基因组学，特别就是功能基因组学得深入研究，一就是有助于杆状病毒载体得进一步改良，二就是随着一些调节外源蛋白表达得基因结构与功能得深入了解，有利于外源基因得高效表达与调控。昆虫杆状病毒表达系统安全性好，表达水平高，可进行翻译后加工及表达产物得异源性小，就是一种非常理想得真核表达系统。目前研究及应用最多得杆状病毒为AcNPV，尽管它可感染30多种细胞，但主要在sf细胞中繁殖，因此，对于其它细胞就是否易感，以及外源蛋白得表达水平、转录后加工等问题还需深入研究。如果在重组产物纯化过程中混有昆虫细胞得蛋白，则可能在应用时引起过敏反应。所以，如何进一步纯化表达产物，将其致敏原性降到最低限度就是值得重视与探讨得问题。

由于该系统独特得性质，使其被广泛地应用于基因工程、药物开发、疫苗生产、表达免疫活性分子与某些致瘤病毒蛋白以及基因表达调控研究等多个领域中。迄今为止，已有数百个基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达，为获得大量得类原型蛋白及其功能研究提供了可能。．

杆状病毒表达蛋白

杆状病毒表达蛋白 1 donor vector的构建 1.1 外源基因的连接 1.2 转化 1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。 1.2.2 冰浴30min。 1.2.3 42℃，90s。 1.2.4 马上放入冰浴中，2min。 1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。（LB 37℃预热） 1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。 1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。 1.3 鉴定 1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。 1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。 1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。 1.3.4 取1ml菌液测序。 1.4 菌种的保存 1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。 1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。 1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。 1.4.4 -80℃保存。 2 转座 2.1 转座反应 2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。 2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。 2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。 pFastBac TM construct 1ng(5μL) pFastBac TM control 1ng PUC19 control 50pg 2.1.4于冰中放置30min。 2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。 2.1.6 马上放入冰浴中，2min。 2.1.7 加入900μL室温LB培养基。 2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。 2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。 2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。

杆状病毒表达系统简介

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。杆状病毒基因组的结构和功能研究杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角

杆状病毒介绍

杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。

杆状病毒表达系统及其应用进展

综述与专论生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第10期杆状病毒表达系统及其应用进展韦永龙李轶女张志芳沈桂芳 (中国农业科学院生物技术研究所,北京100081) 摘要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。关键词: 杆状病毒 BEVS 表达 Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng (B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081) Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e . K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on 收稿日期:2010 04 26 基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863?计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n 杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约 80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1] 。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V ) 和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2] 。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。 1 重组杆状病毒的构建和纯化最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的

杆状病毒

杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现用于害虫防治。DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。插入，因此就是表达大片段。该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。 AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。 1、杆状病毒基因组得结构与功能研究以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。DNA 杆状病毒基因组为双链环状在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜

杆状病毒——昆虫细胞表达系统

实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。实验步骤：一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细

杆状病毒表达系统00000001

昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 ●杆状病毒表达系统介绍 ●杆状病毒蛋白表达系统的优势 ●杆状病毒表达载体系统（BEVS） ●杆状病毒表达宿主细胞 ●表达优化条件 ●翻译后修饰对蛋白表达的影响 ●高通量表达 ●总结

杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期 ●早期（0‐6h PI） ?核衣壳迁移到细胞核 ?病毒DNA释放 ?开始早期基因表达 ●晚期（6‐24h PI） ?更多DNA复制 ?新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 ?的过程中得到囊膜蛋白 ?产生新的出芽病毒 ●极晚期 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia ?出芽病毒减少 ?核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs ?MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。

肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒研究进展

肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒研究进展第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心白雪帆王平忠王伟李彧第八届国际肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒（HFRS、HPS and Hanta- viruses）学术会议于2010年月5月20日～22日在希腊雅典举行。与会专家学者就HFRS/HPS 的流行病学、诊断、发病机制和免疫应答、治疗以及汉坦病毒的生态学、病毒与宿主的相互作用、病毒的种系发生、复制和形态发生、疫苗研制等方面进行了学术交流。下面分别予以简介。一、流行病学 HFRS虽然主要流行于亚欧大陆，但是在非洲和美洲的部分国家也时有报告。我国自2005年以来，报告病例数逐年减少，近年年发病数已降至1万左右。韩国自2001年至2010年5月累计报告4861例HFRS，每年报告HFRS 300例～500例。而日本自1984年后再未发现人间病例。俄罗斯1978年～1995年间平均年发病3145例，但是自2000年～2009年10年间发病数明显增长，仅俄罗斯的83个行政区中的58个即累计报告HFRS病例74890例，平均年发病率达到5.2/10万人口。不同国家的主要流行病毒型别/毒株也有所不同，我国仍以汉滩型（Hantaan virus）和汉城型（Seoul virus）为主，近年还报告了沟型病毒和大别山型病毒；韩国除了上述两型病毒外，近年新发现了Muju virus和Soochong virus；而俄罗斯的远东地区则以卡巴罗夫斯克（Khabarovsk virus）、阿慕尔（Amur virus）、符拉迪沃斯托克（Vladivostok virus）病毒为主要流行株；印尼和新加坡的主要流行病毒则为2009年新发现的Serang virus（最早分离于印尼的Serang地区），泰国、柬埔寨和印度仍以泰国病毒（Thailand virus）为主。上述型别的病毒中，汉滩、阿慕尔和Soochong病毒为姬鼠型病毒，汉城病毒、泰国病毒、沟病毒和Serang病毒为家鼠型病毒，特别是Serang病毒与泰国病毒的结构上非常接近，而卡巴罗夫斯克、符拉迪沃斯托克、Muju以及流行于日本的各型病毒（如Hokkaido）均为平鼠型病毒。美国夏威夷大学的Y anagihara R等通过长期的汉坦病毒动物宿主的调查和观测，发现多种鼩鼱科（Soricidae）动物如鼩鼱（shrew）和鼹科（Talpidae）动物鼹鼠（mole）可以携带汉坦病毒，包括携带索托帕拉亚病毒（Thottapalayam virus, TPMV）的臭鼩（Suncus）、携带Imjin和Jeju病毒的麝鼩（Crocidura）、携带千岛湖病毒的鼩鼱（Sorex）以及携带各型汉坦病毒的中国四川短尾鼩（Anourosorex squamipes）和北方短尾鼩（Blarina brevicauda）、欧亚普通鼩鼱（Sorex araneus）、中鼩鼱（Sorex caecutiens）、假面鼩鼱（Sorex cinereus）、暗黑鼩鼱（Sorex monticolus）、西伯利亚鼩鼱（Sorex roboratus）、亚洲白足鼩鼱（Crocidura shantungensis）、日本鼩鼹（Urotrichus talpoides）、美洲鼩鼹（Neurotrichus gibbsii）、欧洲普通鼹（Talpa europaea）、东方鼹（Scalopus aquaticus）、大麝鼩（Crocidura lasiura）等。不同型别病毒与上述动物宿主的关系有所不同，有些如Seewis病毒和Jemez Spring病毒有着较为广泛的动物宿主类型，前者同时被分布于不同国度和地区的暗黑鼩鼱、沼泽鼩鼱、特氏鼩鼱、漂泊鼩鼱等携带，后者同时被暗黑鼩鼱、特氏鼩鼱、漂泊鼩鼱等携带。源于上述宿主动物的汉坦病毒从结构上也可分为3类，一类与源于啮齿类动物的汉坦病毒同源性较强，另两类有较大差别。系统共进化分析表明，上述非啮齿类动物携带的汉坦病毒大多与其相应的宿主动物长期“和谐共处”，共同进化，仅在偶然的情况下发生宿主动物类型的转换。上述新的动物宿主的发现，不仅扩大了汉坦病毒属病毒的宿主范围，而且为这类新型宿主相关病毒的生物学特性及防控的研究提出了挑战。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。 *一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。

指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒 3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。 Bac-to-Bac表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA *系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac TM菌株。基于pFastBac TM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7 *第二个主要结构是Ecoli的DH10Bac TM品系，用来作为pFastBac TM菌株的宿主。DH10Bac TM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBac TM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBac TM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括： *一个低拷贝的微型F复制子 *卡那霉素的抗性标记 *一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG 存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达

病毒选择题

(C)1、关于乙型肝炎病毒的表面抗原，哪一项是错误的？A 三种颗粒均含有HBsAg B HBsAg有亚型 C HBsAg(＋)表示患病D 抗-HBs表示有免疫力 E HBsAg滴度愈高HBeAg检出率亦愈高(C)3、不符合血清 HBsAg(+)、HBeAg(+)和抗HBc(+) 的解释是：A．急性乙型肝炎 B．慢性乙型肝炎C乙型肝炎恢复期 D无症状抗原携带者E血清有强传染性 (D)4、细胞病变效应不包括：A．细胞圆缩、脱落 B．细胞融合 C．形成包涵体 D．干扰现象E．细胞裂解 ?(A)5、判断流感病毒接种鸡胚尿囊腔是否生长，应选择：A红细胞吸附试验B．血凝试验C．血凝抑制试验D．间接血凝试验E．补体结合试验(D)6、甲型流感病毒分亚型的依据是：A．核蛋白B．血凝素 C．M 蛋白D．血凝素和神经氨酸酶E．多聚 RNA 酶 (D)7、对甲型肝炎的错误叙述是：A．病原体是单股正链 RNA 病毒B．病毒能在组织培养中增殖并传代C．在潜伏期末和急性期初，患者粪便及血液均有传染性 D．早期诊断可测定特异性IgG E．一般不转为慢性 (B)8、对乙型肝炎病毒 e 抗原的错误叙述是：A．血清阳性是传染性高的指标B．其相应抗体有一定保护作用C．血清持续阳性是疾病慢性化的指标D．化学成分为可溶性蛋白E．存在于 Dane 颗粒的最外层 ?(B)9、对乙型肝炎病毒核心抗原的错误叙述是：A．存在于 Dane 颗粒的内衣壳B．可表达在受感染的肝细胞表面C．不易在血循环中检出D．其相应抗体具有保护作用E．是导致受感染肝细胞受损伤的因素之一 (C)10、目前控制 HCV 传播的主要措施是：A．接种疫苗B．注射高效价免疫血清C．对献血者进行抗-HCV 筛查D．注射丙种球蛋白E．注射干扰素 (D)11、HCV 与 HBV 的不同点是：A．主要经血液传播B．可转为慢性化、肝硬化和肝癌C．不能细胞培养D．表面蛋白抗原易变异其抗体不可抵抗再感染E．抗原携带者为重要传染源 (A)13、艾滋病病人淋巴细胞不可能出现：A．CD4+T 细胞增加B．CD4+T细胞减少C．CD8+T细胞增加D．CD4+T细胞相对减少，CD8+T细胞相对增加E．CD4T/CD8比例倒置 (B)14、对流行性乙型脑炎病毒的错误叙述是：A．幼猪是主要传染源和中间宿主B．主要传播媒介是蜱 C．测定体内特异性 IgM 可以作出早期诊断D．病后免疫力持久E．是自然疫源性疾病 (A)15、下列哪个不是HIV的传播方式A 呼吸道 B 输血 C 性接触 D 器官移植 E母婴垂直传播(E)18、HEV与HAV的不同点是：A．粪 -口途径传播 B．隐性感染多 C．一般不转为慢性D．潜伏期末至急性期初，粪便排毒最多E．患者多为成人，病死率高 (E)19、不符合脊髓灰质炎口服减毒活疫苗注意事项的是：A．注意疫苗是否失效 B．勿用热开水送服 C．疫苗在运输途中要注意冷藏 D．为避免其它肠道病毒干扰，宜安排在冬季服用 E．可用母乳送服 (E)20、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗优点不包括：A．疫苗病毒随粪便排出，扩大了免疫范围 B．可刺激机体产生血清中和抗体IgG C．口服方便，儿童易于接受 D．疫苗病毒在肠道增殖，产生局部SIgA 可以阻断野毒株的感染 E．易保存不需冷藏(B)21、灭活是指在理化因素作用下使病毒失去 B. 感染性 (A)22、不符合体内抗-HCV抗体阳性的解释是：A．感染了 HCV，已恢复 B．血中含 HCV RNA，有传染性 C．急性丙型肝炎 D．慢性丙型肝炎E．HCV 携带者 (A)23、关于病毒的潜伏感染错误的论述是A 始终有病毒检出 B必有原发感染 C 可长期潜伏与机体出于相对平衡状态 D 使免疫力下降的因素可激活潜伏的病毒 E 病愈后，病毒回到潜伏部位 (E)24、病毒感染宿主细胞后可出现 A.细胞溶解死亡; B.细胞融合; C.细胞转化; D. 包涵体形成; E.以上均对; (C)25、不能诱导细胞产生干扰素的诱生剂是 A. 病毒; B.人工合成双股RNA; C.衣原体; D.细菌脂多糖; E.头孢菌素; (D)26、不能作为病毒在细胞内生长繁殖指标的一项是 A.致细胞病变作用 B.红细胞凝集 C. 干扰现象 D.细胞培养液变混浊 E.细胞培养液 PH改变 ( E)27、病毒的中和试验是病毒血清学特异试验, 以下描述中不正确的是 A.中和试验是指中和抗体与病毒结合,使病毒失去感染性的一种试验 B. 中和试验需用活细胞或鸡胚或动物来判断结果 C.中和试验是一种特异性较高的试验 D.中和抗体在体内维持时间较短 E.中和试验是用已知病毒抗原检测中和抗体 (A)28、有关包涵体的描述错误的是A.包涵体的形成一定是特异的；B. 包涵体的形成对病毒感染的诊断有一定意义； C.包涵体的形成不一定是特异的；D.有些细菌感染也可引起细胞浆出现包涵体； E.许多理化因素也可引起细胞浆出现包涵体 (B)1、干扰素抗病毒的作用机制是：A．诱发细胞产生抗病毒蛋白 B．直接抑制病毒的生物合成 C．直接杀灭病毒D．阻碍病毒吸附于敏感细胞E．与病毒结合，阻止其脱壳 ? ? (A)8、被狂犬咬伤的病人采取下列哪项措施是错误的：A．立即送医院手术清创 B．立即用20% 肥皂水或0．1％新洁尔灭反复冲洗伤口 C．用高效抗狂犬病病毒血清作局部浸润性注射 D．注射狂犬病疫苗 E．冲洗后的伤口用酒精及碘酒涂擦、消毒 ? ( )9、Kaposi肉瘤的主要病原体是：A．HHV-1 B．HHV-3 C．HHV-6D．HHV-7 E．HHV-8 (D)10、EBV的感染可能是：A．增殖性感染 B．潜伏感染C．恶性转化 D．以上三者都可能E．以上三者都不可能 (D )13、下列方法中，不能灭活HBV的是：A．煮沸 100 ℃，30min B．高压蒸汽 121 ℃， 20min C．0．5% 过氧乙酸浸泡，30~60min D． 70% 乙醇浸泡，30~60min E．5% 次氯酸钠， 60~120min (C)14、不符合血清 HBsAg(+)、HBeAg(+)和抗 HBc(+) 的解释是：A．急性乙型肝炎 B．慢性乙型肝炎C．乙型肝炎恢复期 D．无症状抗原携带者 E．血清有强传染性 (C)17、流感病毒分型的根据是：A．所致疾病的临床特征 B．流行病学特征 C．核蛋白和基质蛋白的抗原性 D．血凝素 E．神经氨酸酶 (D)21、肠道病毒属共同特性中的错误一项是： A．20 面体立体对称的无包膜小 RNA 病毒 B．耐酸、耐乙醚 C．细胞浆内增殖 D．寄生于肠道，只引起人类消化道传染病 E．病后免疫力牢固 (C) 23、脊髓灰质炎患者的传染性排泄物主要是： A．鼻咽分泌物B．眼分泌物C．粪D．尿 E．血 (C)27、急性出血性结膜炎的病毒是：C．肠道病毒 70 (A)32、不符合体内抗-HCV抗体阳性的解释是： A．感染了 HCV，已恢复 B．血中含 HCV RNA，有传染性 C．急性丙型肝炎 D．慢性丙型肝炎 E．HCV 携带者 (B)34、人类嗜T淋巴细胞病毒所致的疾病是：A．人类免疫缺陷综合征B．成人T淋巴细胞和人毛细胞白血病C．自身免疫性疾病D．血友病E．淋巴瘤 (D)35、HEV的传播和流行主要是通过：A. 血液和血制品 B. 性接触 C. 日常生活接触 D. 水源或食物被粪便污染 E. 垂直传播 (D)36、不能经垂直感染的病毒是（D）A巨细胞病毒 B．风疹病毒 C．乙型肝炎病毒 D．脊髓灰质炎病毒 E．单纯疱疹病毒（D）38、关于肝炎病毒的传播途径，错误的是A甲型肝炎病毒—消化道传播 B．乙型肝炎病毒—输血和注射 C.丙型肝炎病毒—输血和注射 D.丁型肝炎病毒—消化道传播 E．戊型肝炎病毒—消化道传播（D）35、可致潜伏感染的病毒是 A..乙型肝炎病毒 B.麻疹病毒 C.汉坦病毒 D. 单纯疱疹病毒 (B)35目前认为与鼻咽癌病因有关的病毒是 B.EB病毒 (C)35、潜伏感染的特征之一是：A.病毒不断从宿主排出 B. 血液中持续存在病毒抗原 C.仅在发作期才能检出病毒 D.病毒引起慢性进行性损伤 (A)35、下列病毒感染人体不引起病毒血症的是：A.流感病毒 B.腮腺炎病毒 C. 麻疹病毒 D. 风疹病毒 (A)35、下列哪个不是HIV的传播方式 A 呼吸道 B 输血 C 性接触 D 器官移植 E 母婴垂直传播 (B)35引起胃肠炎的病毒主要是 B.轮状病毒 (E)35、引起严重急性呼吸综合征（SARS）病原体是 E SARS-Co V (C)35、属于逆转录病毒的是Ａ.流感病毒 B. 甲肝病毒 C.人类免疫缺陷病毒 D.麻疹病毒 (B)35、属于疱疹病毒的是，A、汉坦病毒 B.E B病毒 C.麻疹病毒 D.人类免疫缺陷病毒 (D)35、属于缺陷病毒的是（D）A 甲肝病毒 B 乙肝病毒C 丙肝病毒D 丁肝病毒 E 戊肝病毒 (B)35、病毒由局部向远离侵入门户的其他部位传播主要是通过淋巴血液系统及 A. 向组织间隙扩散; B.沿神经扩散; C.水平传播; D.细胞与细胞融合; E.垂直传播; (D)35、脊髓灰质炎病毒的传播途径是 D. 粪口传播; (C)35、抗体对病毒的中和作用主要是 : A. 抑制病毒生物合成; B.诱导干扰素产生; C.阻止病毒与靶细胞相互作用; D.中和病毒毒素; E.杀伤细胞内的病毒; (A)35、感染病毒的细胞在胞核或胞浆内存在可着色的斑块状结构称 A.包涵体; B. 蚀斑; C.空斑; D.极体; E.异染颗粒; (D)13.下列病毒病哪种易发生潜伏感染: D.水痘 (A)15.哪种病毒感染机体不易形成病毒血症 A.轮状病毒; B.麻疹病毒; C.风疹病毒; D.腮腺炎病毒; E.脊髓灰质炎病毒; ()16.受病毒感染的细胞被杀伤的机制哪项是错误的 A.中和抗体直接溶解靶细胞; B.Tc细胞直接杀伤靶细胞; C.在补体参与下溶解靶细胞; D.经T细胞释放T NF 杀伤靶细胞 (C)23.用直接电镜法可做出早期快速诊断的病毒是 C.流感病毒 (B)26.有关病毒标本的采集和运送,不正确的方法是 A.发病早期或急性期采集标本 B.发病晚期采集标本 C.标本运送应放在带有冰块的保温箱中 D.标本采集后应立即送实验室检查 E.运输培养基中应含有抗生素单选题 1、关于乙型肝炎病毒的表面抗原，哪一项是错误的？c.HBsAg(+)表示患病 2、不符合血清 HBsAg(+)、HBeAg(+)和抗HBc(+) 的解释是：C．乙型肝炎恢复期 3、细胞病变效应不包括：D。干扰现象 ?4、判断流感病毒接种鸡胚尿囊腔是否生长，应选择：C血凝抑制试验 5、甲型流感病毒分亚型的依据是：D．血凝素和神经氨酸酶 6、对甲型肝炎的错误叙述是：D．早期诊断可测定特异性 IgG 7、对乙型肝炎病毒 e 抗原的错误叙述是：E。存在颗粒最表面 ?8、对乙型肝炎病毒核心抗原的错误叙述是： D．其相应抗体具有保护作用 9、目前控制 HCV 传播的主要措施是：C。进行抗-HCV筛查 10、HCV 与 HBV 的不同点是：D。表面蛋白抗原易变异 11、艾滋病病人淋巴细胞不可能出现：A．CD4+T 细胞增加 12、对流行性乙型脑炎病毒的错误叙述是：B．主要传播媒介是蜱 13、下列哪个不是HIV的传播方式A 呼吸道 14、HEV与HAV的不同点是：E．患者多为成人，病死率高 15、不符合脊髓灰质炎口服减毒活疫苗注意事项的是：E．可用母乳送服 ? ?16、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗的优点不包括：A．疫苗病毒随粪便排出，扩大了免疫范围 17、灭活是指在理化因素作用下使病毒失去 B. 感染性 18、不符合体内抗-HCV抗体阳性的解释是：A．感染了 HCV，已恢复

杆状病毒

杆状病毒表达蛋白

杆状病毒表达系统简介

杆状病毒介绍

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

杆状病毒表达系统及其应用进展

最新口腔执业医师(含助理)精品资料 虫媒病毒(黄病毒属)、出血热病毒——汉坦病毒

杆状病毒

杆状病毒——昆虫细胞表达系统

杆状病毒表达系统00000001

肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征和汉坦病毒研究进展

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

病毒选择题

最新口腔执业医师(含助理)精品资料虫媒病毒(黄病毒属)、出血热病毒——汉坦病毒