肝癌小鼠造模实验方法

肝癌小鼠造模实验方法

(1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是

取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c （昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。)

(2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用

枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。

(3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*107mL ，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝

皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL ／只(含2*106个瘤细胞)（5*106）？。全程严格无菌操作，

40min 内完成。

(4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随

机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg ／kg 、300mg ／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组

(1000mg ／kg 、4000mg ／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO 只小鼠。造模24h 后，阳性对照组(CTX)20mg ／kg 和青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)，腹腔注射0．2mL ／只，每天1次，连续lOd ：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL ／只，每天1次，连续lOd 。模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd 。平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。记录各小鼠死亡的时间。

其他问题：

检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？

1、 造模后第二天给药

2、 肿瘤长出一定体积后在给药

原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型

World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/163702892.html,/journal/wjcr https://www.wendangku.net/doc/163702892.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.wendangku.net/doc/163702892.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/163702892.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。

肝癌小鼠造模实验方法

肝癌小鼠造模实验方法 (1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是 取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c （昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。) (2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用 枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。 (3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*107mL ，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝 皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL ／只(含2*106个瘤细胞)（5*106）？。全程严格无菌操作， 40min 内完成。 (4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随 机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg ／kg 、300mg ／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组 (1000mg ／kg 、4000mg ／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO 只小鼠。造模24h 后，阳性对照组(CTX)20mg ／kg 和青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)，腹腔注射0．2mL ／只，每天1次，连续lOd ：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL ／只，每天1次，连续lOd 。模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd 。平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。记录各小鼠死亡的时间。 其他问题： 检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？ 1、 造模后第二天给药 2、 肿瘤长出一定体积后在给药

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 [摘要] 目的:1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。 方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa - F)经 615 小鼠右腋中线皮下接种，定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹

股沟淋巴结肿大情况，并于接种后 21 天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器做切片处理以作染色和镜下观察。 结果:21 天观察，实验使用 10 只小鼠，最终存活 8只，其中形成肿块 7 只（3只形成的肿块较大），成瘤率 70%，淋巴结转移率 70%。肉眼观察，较大肿瘤 2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移，且具有高转移力。 [关键词]HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞); 615小鼠; 高淋巴道转移 [前言]研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm一下的小肝癌已被发现并及时治疗取得满意的疗效[1]。随着临床治疗经验的积累，逐渐

辨证论治联合手术及化疗对H22肝癌小鼠疗效的观察

上海中医药大学学报第26卷第4期2012年7月 辨证论治联合手术及化疗对H22肝癌小鼠疗效的观察 王艳明 1，2 方肇勤 1 张园园 1 潘志强 1 卢文丽 1 1．上海中医药大学基础医学院（上海201203） 2．河北省廊坊市妇幼保健中心（河北廊坊065000） 【摘要】目的：探索建立同病异证H22肝癌小鼠中药个体化辨证论治联合手术及化疗的综合治疗方案及初步评价其疗效。方法：采用H22肝癌细胞腋下实体瘤小鼠及小鼠标准化、计量化辨证方法，观察中药个体化辨证论治联合手术及化疗的综合治疗方案对小鼠带瘤生存时间、抑瘤率和证候等的综合疗效。结果：建立了中药个体化辨证论治联合手术及化疗方法，该方法在抑瘤率、术后早期生存率，以及改善小鼠免疫紊乱与衰退方面显示出一定的优势。结论：在实验室可以模拟临床，建立起肿瘤小鼠个体化辨证论治 联合手术及化疗方法， 为综合治疗方案的探索、优化和提高提供了方法学。【关键词】肝癌；小鼠；辨证论治；中西医结合；方法学【中图分类号】R285．5【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X （2012）04-0087-05 ［基金项目］国家科技重大专项课题（2009ZX09502-018）［作者简介］王艳明，女，在读硕士生，主治医师，主要从事 中医学证和辨证论治的研究。［通讯作者］方肇勤，教授，博士生导师。E-mail ：zqfang@sh163．net 原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其 恶性程度高，发展迅速，病死率高，严重危害着患者的生命健康。当前，原发性肝癌治疗的首选是手术，当不具备手术指征时，常采用肝癌局部介入化疗和物理疗法，放疗也有采用。在我国，大多肝癌患者会 主动寻求中医药治疗， 因此，中西医结合治疗成为肝癌治疗的主要模式。中医药防治肝癌主要采取辨证论治的方法，针对肝癌邪毒、痰瘀、脾虚等主要病机，以及不同患者的特殊证候，予以清热解毒、行气活血、化痰软坚、健脾益气等综合治疗及个体化的辨证 论治 ［1-3］ 。项目组在前期的研究中发现肝癌小鼠与人类近似， 存在着证候的自然发生、兼夹和演变，是肝癌辨证论治研究的理想模式生物［4］ ，并逐步建立 起大鼠和小鼠标准化诊法和辨证方法［5-9］，尝试开 展了以中药复方为主的辨证论治［10-11］ ，取得了积极 的进展。并在以往的试验中利用基因芯片的检测发现同病异证的肝癌小鼠在神经-内分泌系统存在一 些重要激素的表达特征，具有各自的物质基础［12］ 。为了模拟临床实际，建立肝癌小鼠中西医结合治疗方法，并以此为基础，不断探索和优化中西医结合肝 癌防治方法、 揭示中西医结合防治肝癌的作用机制，我们在以往工作的基础上，进一步探索中药辨证论治联合手术及介入化疗对H22肝癌小鼠的治疗及 疗效评价， 报道如下。1材料与方法 1．1实验动物健康雄性昆明小鼠140只，体质量（25?1）g ，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动 物生产许可证号为SCXK （沪）2008-0003，动物使用 许可证号为SYXK （沪）2009-0069。1．2药物 1．2．1中药方剂（1）基本方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡 索10g ， 当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g 。 （2）气虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川 芎10g ， 桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，阿胶10g 。 （3）阳气虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，阿胶10g ，淫羊藿10g ，山茱萸10g ，杜仲10g 。 （4）气阴阳虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神 曲10g ， 生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，淫羊藿10g ，山茱萸10g ，杜仲10g ，阿胶10g ，熟地黄20g ，炙鳖甲10g ，炙龟甲10g 。 中药制备：以上4方均按标准的中药水煎醇沉方法，浸膏分别浓缩至1g /ml 。 1．2．2局部介入用化疗液每0．2ml 含5-Fu · 78·

人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用

人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用 王全凯1，杨全会2，郭静2，谢广云1，崔涛1，许荣焜2，许建宁1* 1. 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050 2. 中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005 摘要：目的建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物制剂疗效的观察。方法将人原发肝癌手术新鲜组织移植于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌组织裸鼠移植瘤动物模型；于同体移植后第15 天连续ig给予长科制剂（CKBM），通过观察动物日常状况、接种部位出现肿块时间，测定瘤体体积和质量、抑瘤率以及进行组织病理学观察，初步评价CKBM的抗肿瘤疗效。结果人肝癌组织裸鼠移植瘤保持了人肝癌组织特性，并能通过同体移植传代；观察发现CKBM对人肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤率达45.71%，对癌细胞生长有一定的抑制作用。结论在成功建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型基础上，观察发现CKBM具有一定的抗肿瘤疗效。 关键词：肝癌；裸鼠；移植瘤；动物模型；抑瘤率 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0398 - 05 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.018 Establishment and application of implantation model of human hepatocellular carcinoma in nude mice WANG Quan-kai1, YANG Quan-hui2, GUO Jing2, XIE Guang-yun1, CUI Tao1, XU Rong-kun2, XU Jian-ning1 1. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 2. Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China Abstract:Objective The human hepatocellular carcinoma model was established by implantation in BALB/c nude mice. Its characteristics were certified in the model which was used for the observation of antitumor efficacy. Methods Human hepatocellular carcinoma were sc implanted to BALB/c nude mice for the establishment of the implantation model of the human hepatocellular carcinoma in BALB/c nude mice. The nude mice were exposed to the pharmaceuticals from CK Life Sciences Limited by ig on day 15 after the implantation to find out its healing efficacy through the animal reflecting, the occurring time, volume, weight of tumors, the rate of tumor inhibited, and pathological histology. Results The characteristics of human hepatocellular carcinoma could be kept with passaging by autograft. The tumor inhibiting rate of the pharmaceuticals was 45.71%, showing the certain inhibitory effect on growth of tumor cells. Conclusion A certain antitumor efficacy of the pharmaceuticals made by CK Life Sciences Limited is found out on the basis on the human hepatocellular carcinoma model in nude mice established successfully. Key words: hepatocellular carcinoma; nude mice; implanted tumor; animal model; tumor inhibitory rate 人类肝癌的基础和临床实验研究多数都借助于实验动物模型。目前，以人肝癌组织移植裸鼠建立的动物移植瘤模型是最接近人类肝癌的整体实验模型，是肝癌基础和临床实验研究理想的动物模型。人肝癌组织裸鼠移植瘤模型是指把人肝癌组织块接种于裸鼠皮下建立的实验动物模型，常用于筛选抗肿瘤药物和制剂、实验性治疗和抗肿瘤机制研究[1]。基于为肝癌实验和临床研究以及药物筛选提供体内实验系统的目的，本研究建立了人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物长科制剂（CKBM）疗效的观察。 1材料与方法 1.1实验动物 BALB/c（nu/nu）裸小鼠（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。饲养于中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学部 收稿日期：2013-06-03 作者简介：王全凯（1977—），男，北京人，主管技师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132199 E-mail: kylewang@https://www.wendangku.net/doc/163702892.html, *通信作者许建宁，硕士生导师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132592 E-mail: jnx999@https://www.wendangku.net/doc/163702892.html,

建立小鼠肿瘤模型的研究进展

建立小鼠肿瘤模型的研究进展 摘要：建立一种理想的肿瘤动物模型对研究肿瘤的发病、治疗和预防有重大的意义。其中小鼠肿瘤模型具有生长周期快、易获得、易操作等优点被基础实验研究所广泛采用，如何选择和建立一个合适的小鼠肿瘤模型对肿瘤的整个研究有着举足轻重的作用。 关键字：肿瘤，动物模型，小鼠 肿瘤，是一种严重威胁人类健康的多发病和常见病。对肿瘤的研究一般都是在人类疾病动物模型的基础上展开的。建立一个完全反映人类疾病的动物模型比较困难，但可依据不同的实验目的选择相应的动物实验模型。 1.实验动物的选择 可用作肿瘤模型的动物有很多，小鼠肿瘤模型作为其中一种常用模型主要因为有以下几个优点。（1）易获得，常用的肿瘤模型小鼠通常采用SPF级小鼠，SPF级小鼠一般医学院校及研究所都能买到。（2）生长周期短，一般小鼠肿瘤模型两周左右就能长大，能大大缩短实验周期。（3）易操作，小鼠的动物实验操作一般简便，因此可适当增加组内样本数量，使实验数据更具说服力。 2.理想的建立肿瘤模型应具备的条件 （1）肿瘤生长的过程应与人类肿瘤生长过程相似，做到尽可能复制出与人类肿瘤相同的模型。 （2）制作模型的方法简单易行。 （3）动物模型的重复性要好，要能满足实验的多次重复试验结果稳定性好。 （4）采用的建模方法对实验人员和环境无危害或危害较小。 3.肿瘤来源的选择 现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，P1534淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，白血病P388，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，Ｗagner癌肉瘤，白血病L5170Y，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，Gardner 淋巴肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

大连医科大学 博士学位论文 shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为 的景程 姓名：李荣宽 申请学位级别：博士 专业：病理与病理生理学 指导教师：唐建武 201006

shRNA抑制CLIC 1基因表达对小鼠肝癌 细胞株Hca．F生物学行为的影响 博士研究生：李荣宽指导教师： 唐建武教授专业 名称：病理学与病理生理学 摘要 背景：转移潜能是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是肿瘤患者死亡率高、预后差的主要原因。对于上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转 移是其早期转移的主要方式，但确切机制目前仍不清楚。原发性肝癌 (primary carcinoma of the liver)是最常见恶性肿瘤之一，包括肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管上皮癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC)、肝细胞及胆管上皮细胞混合癌三种细胞类 型，其中90％以上为肝细胞癌。全世界每年新发约62．6万例HCC患者， 其中的半数以上病例发生在我国。同时，它也是恶性程度最高、致死率 最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第 二位。即便是经过根治性切除手术治疗，5年的复发转移率仍高达60％， 因此，揭示肝癌转移的分子机制及其关键调控环节，进而采取相应的干 预措施，将有助于减少、甚至避免病人术后发生复发转移，从而达到降 低死亡率的目的。 Hca．F和Hca．P是将小鼠肝癌细胞株H22在61 5小鼠体内反复接种和筛选后得到的一对来源于同一亲本细胞、但是淋巴道转移潜能显著 不同的小鼠肝癌腹水型细胞株。其中Hca．F具有高淋巴道转移潜能，接 种到6l 5小鼠体内后其淋巴结转移率超过70％，Hca．P是低转移潜能 的细胞株，其淋巴结转移率低于30％。通过对比研究二者的差异，可以 为我们揭示小鼠肝癌的淋巴道转移机制提供有益的参考。本课题组在前 期工作中已经应用不同的方法，对Hca．F和Hca．P这一对具有高低不通 淋巴道转移潜能的细胞株进行了一系列系统的研究。首先，利用抑制性 消减杂交技术(suppression substractive hybridization，SSH)及基因 芯片 (Genechip)高通量筛选(high throughput screen，HTS)技术得出了Hca．F 细胞和Hca．P细胞之间一系列差异表达基因，继而采用定量蛋白质组学技术建立了高低淋巴道 转移潜能小鼠肝癌细胞的荧光差异蛋白表达图

肝癌动物模型的建立_徐静

共识.中华肝脏病杂志,2004,12∶425～428 11　Perrillo RP ,Lai CL ,Liaw YF ,et al .Predictors of HBeAg loss after lamivudine treatment for chronic hepatitis B .Hepatotogy ,2002,36∶186～194 12　Rizzetto M ,Tassopoulos NC ,Goldin RD ,et al .Extended lamivu -dine treatment in patients with HBeAg -negative chronic hepatitis B .J Hepatol ,2004,41∶1070～1076 13　Ryu SH ,Chung YH ,Choi MH ,et al .Long -term additional lamivu -dine therapy enhances durability of lamivudine -induced HBeAg loss :a prospective study .J Hepatol ,2003,39∶641～619 14　Chien RN ,Yeh CT ,Tsai SL ,et al .Determinants for sustained HBeAg response to lamivudine therapy .Hepatology ,2003,38∶1267～1273 15　党红星,何瑞,马跃东.拉米夫定致小儿锥体外系反应二 例.中华儿科杂志,2004,42∶436 16　Lok ASF ,Zoulim F ,Locarnini S ,et al .Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus (HB V )-infected patients durin g lamivud ine therapy :evaluation of performance of INNO -LiPA HBV DR assay .J Clin Microbio ,2002,40∶3729～3734 17　Suzuki F ,Suzuki Y ,Tsubota A ,et al .Mutations of polymerase , precore and core promoter gene in hepatitis B virus during 5-year lamivudine therapy .J Hepatol ,2002,37∶824～830 18　Qaq ish RB ,Pharm D ,Mattes KA ,et al .Ad fovir dipivoxil :A new antiviral agent for the treatment of hepatitis B virus infection .Clin Therapeut ,2003,25∶3084～3099 19　Bozdayi AM ,E yigun CP ,Turkyilmaz AR ,et al .A novel pattern (sW195a )in surface gene of HBV DNA due to YSDD (L180M plus M204S )mutation selected during lamivudine therapy and success -ful treatment with adefovir dipivoxil .J Clin Virol ,2004,31∶76～77 20　Qarugan RB ,Gomez LC ,Serrano PL .Use of adefovir in the treat -ment of the chronic hepatitis B virus infection with res istance to lamivudine .Transplant Proc ,2003,35∶1841～1843 21　Villeneuve JP ,Durantel D ,Durantel S ,et al .Selection of a hepati -tis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation pa -tient .J Hepatol ,2003,39∶1085～1089 22　梁扩寰,主编.肝脏病学.第1版,北京:人民卫生出版社, 1995.520 23　张瑞琪,缪晓辉,倪武.膦甲酸钠治疗慢性乙型肝炎47例. 中华传染病杂志,2002,20∶180～181 (收稿:2004-12-10) (校对:郭顺明) 肝癌动物模型的建立 徐　静　综述　李　旭　审校 作者单位:230022　合肥市　安徽医科大学附属医院感染科 自20世纪初获得小鼠自发性肝癌动物模型以来,人们对肝癌动物模型的研究不断深入,逐渐建立了诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型及转基因动物肝癌模型。下面就各类肝癌动物模型的建立方法和特点作一简述。 一、自发性肝癌动物模型　是指实验动物未经任何有意识的人工处置,在自然情况下所发生的肿瘤。实验动物多选用近交系小鼠,由于实验动物种属、品系的不同,肿瘤发生类型和发病率有很大差异。14月龄以上的C3Hf 系雄鼠、C3H 系雄鼠和C3He 雄鼠的发生率分别为72%、85%和80%[1]。 自发性肝癌动物模型最大的优点是,系完全在自然条件下发生的疾病,排除了人为因素,肝癌的发生、发展与人类肝癌相似,反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度,但其发生率低且不稳定,发生时间较长、难预测且参差不齐,荷瘤动物个体在动物(性别、体重、肿瘤发生时间等)和肿瘤(大小、数目、部位等)两方面差异较大,造模有一定的困难。该模型主要用于病理学研究和作为移植性肿瘤的瘤源。 二、诱发性肝癌动物模型　诱发性肝癌模型是指用化学、物理、生物的致癌因素在实验条件下诱发动物发生肝癌,它是 进行实验肿瘤学研究的常用方法。其中化学性致癌物最常见,如亚硝胺类(DEN )、黄曲霉素类(AFB1)、氨基偶氨燃料类(3′-Me -DAB )、芳香胺类化合物(2-AAF )等。最常用的实验动物为大鼠,多选用敏感性高的纯系大鼠。目前常用的品系有:Wistar 、Spraque -Dawley 和Fischer344,前两者在国内应用更为广泛。大鼠的年龄和性别均对致癌性有影响。一般认为幼年雄性大鼠对致癌的敏感性较高,但有时也可出现幼年雌性大鼠诱癌成功。鼠龄以3个月以内、体重120克以下的大鼠诱癌启动率高于月龄大的大鼠,而体重200克以上或1岁以上的大鼠的肝癌启动率低,很难诱发肝癌。这与其组织中的肝细胞或幼稚细胞的状态以及细胞的增殖水平有关。 诱发性大鼠肝癌的给药途径主要有经口给药法和注射给药法。经口给药法又分为自动口服给药和强制灌胃两种,前者是将水溶性致癌物溶于水中或将非水溶性致癌物混于饲料中让大鼠自动摄取,此法简单方便,但由于动物饮水和饲料的摄取量不同,不能保证给准确药量;后者是将溶于水或悬浮于载体的诱癌剂通过特制的灌胃针头给大鼠灌胃,此法能准确掌握给药量,但强制性操作和定时给药会对动物造成一定程度的机械性损伤和心理上的影响。注射法也是一种常用的方法,可将 诱癌剂溶于可溶性液体中或悬浮于载体中,通过各种部位注射

【CN110004109A】一种肝癌类器官模型的体外构建方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910255261.0 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 南通大学附属医院 地址 226001 江苏省南通市西寺路20号 (72)发明人 郑文杰　姚登福　张捷　金云峰　 倪温恺　徐育青　 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普 通合伙) 32100 代理人 葛雷 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/09(2010.01) (54)发明名称 一种肝癌类器官模型的体外构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种肝癌类器官模型的体外 构建方法，将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮 细胞，按特定比例混悬于培养基A；培养至第4天， 半量换液维持培养；第7天开始，换为培养基B，连 续培养7天；第14天传代扩增培养。本发明基于肿 瘤微环境中复杂的细胞构成，快速构建大小均 一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增 培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明构建的肝 癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强， 适用于研究肝癌发生发展机制、以及肝癌药物高 通量筛选等， 具有产业化意义。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 110004109 A 2019.07.12 C N 110004109 A

1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤： （1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基； 所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。 2.根据权利要求1所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。 3.根据权利要求书2所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混匀于培养基A后，计数并按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液体积为100μL。 4.根据权利要求书3的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按比例混悬于培养基A，接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。 5.根据权利要求书4所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50μL培养基，并加入等量培养基A。 6.根据权利要求书5所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100μL培养基B，隔日吸弃50μL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。 7. 根据权利要求书6所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第14天，使用1000μL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500μL Accutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min，离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释，按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养。8. 根据权利要求书1、2、3或4所述的一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养基A包括：100U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素、2~10μg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol/mL谷氨酰胺、4~8%胎牛血清、10~50ng/mL表皮生长因子、10~50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；培养基B包括：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2~10μg/mL转铁蛋白、1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol /mL谷氨酰胺、8-12% 胎牛血清、2~50ng/mL Wnt3a、10~50 ng/mL表皮生长因子、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10~100 ng/mL肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。 权　利　要　求　书1/1页2CN 110004109 A

落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响分析

落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响分析 发表时间：2019-12-12T12:48:00.970Z 来源：《医药前沿》2019年32期作者：杨志杰樊星花梁宇红[导读] 目的：探讨落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响。 （广西医科大学第四附属医院暨柳州市工人医院药学部广西柳州 545005）【摘要】目的：探讨落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响。方法：建立H22荷瘤小鼠模型，随机分为空白组、阳性组（5-FU）、模型组、水提物低剂量组（4g/kg生药量）、中剂量组（8g/kg生药量）及高剂量组（16g/kg生药量）共6组，每组10只。阳性组按20mg?kg-1腹腔注射5-FU，模型组、空白组灌服等体积生理盐水，连续给药15天。进行碳廓清试验，计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数和肝脏指数。结果：落地生根水提物中、高剂量组可明显抑制H22实体瘤生长（P＜0.05），抑瘤率分别为65.68%和74.56%。中、高剂量组可显著增高碳廓清指数（P＜0.05）与脾脏指数（P＜0.05），仅中剂量组对胸腺指数有显著增高作用（P＜0.05），落地生根水提物对肝 脏指数无影响。结论：落地生根水提物对H22荷瘤小鼠的免疫系统有一定的保护作用，能调节巨噬细胞吞噬功能的作用，增强机体的免疫功能，提高抗肿瘤能力。 【关键词】落地生根水提物；H22；免疫功能；小鼠【中图分类号】R964 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2019）32-0206-03 落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken为景天科(Crassulaceae)落地生根属(BryophllurnSalisb)植物，在广西、广东、云南、福建和台湾等地区广泛分布，别名为花蝴蝶、倒吊莲、土三七、叶生根、番鬼牡丹、叶爆芽、天灯笼、枪刀草、厚面皮、著生药等，全草入药，性酸、寒[1]。除具有观赏价值外，还具有药用价值，可治创伤出血、疔疮、乳腺炎、跌打损伤吐血、热性胃痛、关节肿痛、急性中耳炎、皮肤溃疡等[2]。在国外，落地生根广泛分布于非洲、美洲热带以及印度和澳大利亚，作为传统药物用于腹泻、呕吐、镇痛、抗炎、抗病原微生物、利什曼病及抗变态反应等[3]。本实验就落地生根对H22肝癌小鼠免疫功能影响做研究，尝试对落地生根水提物抗肿瘤的作用进行初步探讨。 1.资料与方法 1.1 一般资料 1.1.1细胞株及动物小鼠H22肝癌细胞由广西医科大学药理学教研室提供，经本实验室传代保存。昆明种小鼠60只，体质量18～22g，雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供。试验动物使用许可证 SCXK2009-0002。 1.1.2药品与试剂落地生根采取于广西来宾市忻城县，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为鉴定景天科(Crassulaceae)落地生根属(BryophllurnSalisb)植物落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken。氟尿嘧啶注射液（5-FU），天津金耀药业有限公司，批号1504261。一得阁墨汁购于一得阁墨业有限责任公司。 1.2 仪器 多功能提取浓缩机组(上海顺仪实验设备有限公司)；分析天平(日本岛津公司)；DRAGON LAB移液器(20～200μL)( 大龙兴创实验仪器（北京）有限公司)；酶标仪（美国伯乐BIO-RAD公司）。 1.3 药材提取 取6100g落地生根干药材，加10倍量蒸馏水，回流提取3次，每次1小时，过滤，合并3次滤液，浓缩成浸膏，浸膏量为1246.8g，置于4℃冰箱，待用。 1.4 造模、分组及给药 取冻存的H22肝癌细胞，复苏为0.9%氯NaCL溶液混悬，小鼠腹腔注射，连续传两代。无菌条件下取H22肝癌小鼠腹水，稀释成含量为1×107?mL-1的细胞悬液后于小鼠右侧腋窝皮下接种，小鼠接种肿瘤细胞悬液后称体重，随机分为空白组、阳性组（5-FU）、模型组、水提物低剂量组（4g?kg-1生药量）、中剂量组（8g?kg-1生药量）及高剂量组（16g?kg-1生药量）共6组，每组10只。空白组为正常小组，阳性组按20mg?kg-1给予5-FU腹腔注射，模型组、空白组灌服等体积生理盐水。各组均于接种后24小时开始给药，每天1次，连续15天。 1.5 小鼠碳廓清实验 末次给药24小时后,尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁,每10g体质量注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2（t1）、10min（t2），分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2mL 0.1% Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1% Na2CO3溶液作空白对照，用酶标仪在600nm波长处比色测定光密度值（OD）。将小鼠处死，取肝、脾，称质量，计算吞噬指数（a)。吞噬指数计算方法：K=（lgOD1-lgOD2)/(t2-t1).吞噬指数（a)=体质量×K1/3（肝质量+脾质量）。 1.6 瘤重、胸腺指数、脾脏指数、肝脏指数的测定 分别称取小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤组织，取小鼠脾脏、胸腺和肝脏，精密称定，计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数和肝脏指数：肿瘤抑制率（%）={1-（平均实验组瘤重/平均对照组瘤重）}×100%；胸腺指数=胸腺质量/体重；脾脏指数=脾脏质量/体重；肝脏指数=肝脏质量/体重。 1.7 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，所有数据均以-x±s表示，两组间差异比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。 2.结果 2.1 抑瘤作用 研究结果显示，与模型组比较，落地生根水提物中、高剂量组可明显抑制小鼠H22实体瘤生长（P＜0.05)，抑瘤率分别为65.68%和74.56%，与5－氟尿嘧啶作用相当，见表1。 表1 落地生根水提物对小鼠瘤重及免疫脏器指数的影响