植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述
邵碧英
(福建出入境检验检疫局 福州 350001)
植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。
CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。
1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法
植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。
111 酶联免疫吸附反应(EL ISA)
EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。
后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。
EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。
112 斑点免疫吸附法
20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。
斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。
113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。
鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。
组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。
114 电印迹免疫分析(EBLA)
电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。
EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法
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不适于大量样品的检测。
115 伏安酶联免疫分析法
伏安酶联免疫分析是将酶催化、免疫技术和伏安法检测相结合的一种免疫分析方法。焦奎等[4]已研究10个伏安酶联免疫分析新体系,灵敏度均高于EL ISA 。伏安酶联免疫分析法具备了伏安法的高灵敏度和高准确性,又具备免疫反应的特异性,仪器设备简单,操作方便。但此方法不适宜于大量样品的分析。
116 胶体金免疫法
胶体金颗粒具有高电子密度和能结合生物大分子的特性,将其标记到抗体或SPA 上,再利用抗原抗体反应来检测抗原,增强了可见性,若在金颗粒周围再进行银染色又提高了检测灵敏度。在膜上进行免疫金、免疫金/银染色时分别称为斑点免疫金(Dot 2IGS )和斑点免疫金/银(Dot 2IGSS )染色。魏梅生[5]将Dot 2IGS 和Dot 2IGSS 应用于烟草环斑病毒(Tobaccoring 2spot virus )的检测,还将胶体金颗粒标记TRSV 的抗体,制成了免疫层析检测试条[6],试纸条检测操作简便,不需要任何仪器,10mim 之内即有结果,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。117 免疫PCR 新近发展起来的免疫PCR 是将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高录敏度有机结合的检测技术与酶标检测技术相比,免疫PCR 是用DNA 片段取代酶来标记抗体,然后用PCR 扩增DNA 片段从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。Sharman [7]建立一种复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提取汁液中的香蕉苞叶花叶病毒(Banana bract mosaic virus ,黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒(Banana bumchy top virus )。2 以病毒核酸为基础的检测方法
血清学方法检测植物病毒的优点是灵敏、使用方便,与生物学实验相比节省空间、时间,并且可重复性强,在病毒检测技术方面
是一大进步。但在样品量极少或病毒在组织中含量很低、无蛋白外壳的类病毒的检测时,必须用核酸检测法。211 PCR
PCR 是一种DNA 体外扩增技术,大多
数植物病毒含的是RNA ,首先要将RNA 反转录成cDNA ,后进行PCR ,此方法称为R T 2PCR 。近年来,在R T 2RCR 基础上已经发展了多种方法用于植物病毒的检测。复合R T 2PCR 是在同一R T 2PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段。Nassuth 等[8]应用复合R T 2PCR 同时检测葡萄藤提取物中的4种病毒。Nie 等[9]也应用复合R T 2PCR 技术同时检测了马铃薯的5种病毒和1种类病毒。复合R T 2PCR 和用单一R T 2PCR 做相同数目的病毒检测相比,节约了时间和试剂。
PCR 2EL ISA 是用EL ISA 替代琼脂糖凝胶电泳来检测PCR 产物的方法,录敏度高。Olmos 等[10]用PCR 2EL ISA 方法检测PPV ,
灵敏度比免疫PCR 高100倍。
采用将PCR 和荧光测定相结合的实时荧光定量PCR 不仅可避免假阳性的出现,而且提高了检测灵敏度,还能进行定量检测。Roberts 等[11]用实荧光定量R T 2PCR 可检测少至500fg 的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus.)。Eun 等[12]采用复合荧光定量R T 2PCR 法可同时检测少至5fg 的CymMV 和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot to 2bamovirus )。
PCR 对病毒是的有利条件是它特别灵
敏,可检测最低病毒含量达到fg 水平,可直接对任何材料,包括坏死、鲜活、甚至很微量材料进行检测。但植物病毒多为RNA 病毒,RNA 很容易降解,撮相对困难,只有那些已知序列的病毒才能作PCR ,实验时需要昂贵的试剂和特殊的设备。
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核酸探针和固定在膜上的核酸进行杂交,使杂交体带上标记而被是出来。一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒。朱水芳等、李尉民等[13～14]分别应用核酸杂交成功检测了ToRSV、SBMV。核酸杂交还可和R T2PCR 结合使用。Bertolini等[15]采用复合R T2PCR 同时检测能侵染橄榄树的6种RNA病毒,后用这6种病毒的特异Dig标记的探针对PCR产物进行检测。核酸分子杂交法特异性强,灵敏度高,可检测到lpg的DNA,可检测大量样品。
213 其它核酸检测法
RNA病毒、类病毒在寄主体内存在的特异dsRNA有各自的迁移率、分子量、片段数,可用于植物病毒的鉴定,dsRNA分析技术[16]就是以此为检测依据的。
基因芯片是近10年发展起来的应用于分子生物学研究的一项新技术,在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表达情况的分析等诸多领域的研究中得到了广泛应用。国内外学者也正致力于植物病毒检测的基因芯片的研究和开发,相信不久的将来基因芯片会在快速、灵敏地检测大批量样品的植物病毒上发挥重要作用。
参考文献
1 陈京,宋淑敏,陈燕芳等.三种病毒A蛋白酶联诊断试剂盒的研制简报.植物检疫,1997,11(1):27
2 鞠振林,朱笑梅,薛爱红等.改进的直接组织斑免疫测定法在植物病毒及细菌检测中的应用.植物病理学报, 1993,23(4):367～371
3 徐明全,郑平,刘荣维等.植物病毒检测技术———组织印5 魏梅生.斑点免疫金和免疫金/银染色法检测烟草环斑病毒.植物检疫,2000,14(1):1～2
6 魏梅生,李桂芬,张周军等胶体金免疫层析法快速检测烟草环斑病毒.植物检疫,2002,16(2):81～83
7 Sharman M,Thomas J E,Dietzgen R G.Development of a multiplex immunocapture PCR with colourimetric detec2 tion for viruses of banana.J Virol Methods,2000,89(1-
2):75～88
8 Nassuth A,Pollari E,Helmeczy K,et al.Improved RNA extraction and one2tube RT2PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts.J Virol Methods,2000,90(1):37～49
9 Nie X,Singh R P.Detection of multiple potato viruses us2 ing an oligo(dT)as a comon cDNA primer in multiplex RT2PCR.J Virol Methods,2000,86(2):179～185
10 Olmos A,Cambra M,Dasi M A,et al.Simultaneous de2 tection and typing of plum pox potyvirus(PPV)isolates by heminested2PCR and PCR2EL ISA.J V M1997,68(2): 127～137
11 Roberts C A,Dietzgen R G,Heelan L A,etal.Real2time RT2PCR fluorescent detection of tomato spotted wilt virus.J Virol Methods,2000,88(1):1～8
12 Eun AJ,Seoh M,Wong S.Simultaneous quantitation of two orchid viruses by the TaqMan real2RT2PCR.J Virol Methods,2000,87(1-2):151～160
13 朱水芳,相宁,张成良等.PCR和Dig2cRNA探针检测番茄环斑病毒,中国进出境动植检,1995,(4):29～31 14 李尉民,Roger Hull,张成良等.南方菜豆花叶病毒(SB2 MV)两典型株系行异cDNAT和RNA探针的制务及应用.植物病理学报,1998,28(3):243～247
15 Bertolini E,Olmos A,Martinez M C,et al.Single2step multiplex RT2PCR for simultaneous and colourimetric de2 tection of six RNA viruses in olive trees.J Virol Meth2 ods,2001,96(1):33～41
16 田文会,王江柱.双链RNA分析技术在鉴定RNA病毒中的应用,河北农业大学学报,1995,18(4):112～117
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植物病毒病的有效防治方法
植物病毒病的有效防治方法 现在病毒病的危害有日益严重的趋势，发病病毒种类越来越多，常见到的有厥叶病毒，花叶病毒，条斑病毒，银叶病毒，黄化病毒，等几十种，而且混发的现象日趋严重。当前如何解决植物病毒病，是目前农业生产中非常紧迫的问题。植物病毒病的解决也是农民增产增收的保证。 一、病毒病的发病原因 （1）传染源 （2）传媒 （3）高温 （4）干旱 （5）光照过强 （6）品种本身的原因 二、预防措施 （1）切断传染源，措施：种子消毒，接种抗毒免疫剂。选择无毒种苗。利用茎尖脱毒克隆方法繁育种苗。 （2）消灭传媒，做好蚜虫，白粉虱等害虫的防治工作。 （3）尽量控制好温度，最高温度应控制在32度以下，如温度过高，就要采取措施，地面要经常浇小水，叶面多喷喷抗毒免疫剂或灌根。 （4）避免干旱，小水勤浇。要控制合适的湿度。 （5）夏天光照强时要进行适当遮光。 （6）增喷抗毒免疫剂，中药及生物的为最好。 （7）选育抗病毒品种 （8）改进栽培措施，选择先进的有机栽培模式。增强本身抗病毒能力。 三、治疗措施
（1）种子用脱毒剂进行处理，磷酸三钠10倍浸泡10分钟，或高猛酸钾100倍浸泡，或抗毒免疫剂100倍浸种10分钟，冲洗干净后播种或催芽。 （2）用无毒无菌无虫卵基质育苗。 (3)要尽量用有机栽培模式，利于根系发育，提高本身抗病毒能力 (4)出苗后接种抗病毒疫苗三次以上。 (5)移栽后定期喷洒抗病毒疫苗或制剂。 (6)冲施肥要以天然有机肥为主，用生物发酵好的肥料，厌氧菌或放线菌类有益防腐微生物为最好，养根壮根，提高产量的同时提高其抗病毒能力。 关于植物病毒病 植物病毒对寄主的危害，素有“植物癌症”之称，防治上十分困难。病毒在侵染寄主后，不仅与寄主争夺生长所必需的营养成分，而且破坏植物的养分输导，改变寄主植物的某些代谢平衡，使植物的光合作用受到抑制，致使植物生长困难，产生畸形、黄化等症状，严重的造成寄主植物死亡。为了有效地控制植物病毒病，人们采用了各种措施，包括轮作、种子脱毒、病毒间的弱毒株系交叉保护、抗病品种的选用、传毒介体的控制及化学农药的使用等，近年来转基因植物抗病研究也有了新的进展。但这些措施还不能有效克服病毒的危害，且化学农药的使用对环境造成了很大危害，在当前大力提倡绿色食品和环境保护的前提下，加强植物病害的综合防治和减少化学农药的使用已成为植保工作者工作的重点内容之一。为了能开发出有效控制病毒且不会造成环境污染的抗病毒药剂，研究人员不断寻找和筛选天然的生物源抗病毒物质。目前，国内外已报道的天然抗病毒活性物质种类很多，有的已形成产品，在农业生产中发挥着重要作用。 一、改变耕作制度，加强栽培管理，预防植物病毒病的发生和流行 1．轮作套种采用不同作物和品种的轮作和套种，可以减少病原积累，防止病害严重发生。 2．选择适宜播种期播种期的选择对病毒病的发生也有很大影响。 3．加强苗期管理苗床和苗期的管理对预防和控制病毒病的发生十分重要，因为苗床上的病株，可能成为大田发病的重要毒源。因此，要尽力保证幼苗不生病或少生病，加强田间栽培管理，提高植物抗病毒病的能力，铲除田间地头杂草，拔除病株以除掉毒源，及时治虫防病，也能减轻病害。 二、种植抗、耐病品种 采用抗病和耐病品种可以经济有效地防治和减轻病毒病的发生。多数抗病品种可以抵抗病毒复制和扩散，有些蔬菜可以抗传毒介体。
9.流感病毒的快速检测方法
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
植物病毒田间接种、传染方式教材
实验六植物病毒病及其传染方式 一、实验目的 认识植物病毒形态和病毒病主要症状类型，通过植物组织汁液的摩擦接种和蚜虫传播试验了解病毒病的主要传染方式。 二、讲解要点 1．病毒颗粒很小，必须用电子显微镜才能观察到。植物病毒颗粒可以分为圆球状（或等边多面体）、炮弹状、长杆状和线条状4种。这些在课堂和本次实验课上只能通过观看电镜照片或幻灯片来了解。 2．植物病毒病的主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑坏死、畸形。应该注意：一方面这些症状类型的分辨在病毒病鉴定上具有比起它病害更重要的意义，另一方面在实际观察中，也会发现同一种病毒病在发病过程中或在不同环境条件下会有不同的表现（不同病状甚至隐症）。 3．病毒病多为系统性侵染，没有病征，易与非侵染性病害相混淆，往往需要通过一定方式的传染试验证实其传染性。植物病毒病的传染方式有：机械（摩擦）接触传染、嫁接传染、介体（包括昆虫、线虫、真菌、螨类和菟丝子）传染、花粉及种子传染等。由于病毒是专性寄生物，它的侵染来源都与活体（活的动、植物体或介体）有关，传染要使病毒接触活体。例如汁液摩擦接种，要用新鲜的病毒汁液，摩擦的目的是造成寄主植物体表面的微伤，使病毒有可能进入活的细胞，过重的损伤造成组织坏死并不利于病毒的传染。蚜虫、飞虱等刺吸式口器昆虫取食植物汁液的方式更容易满足植物病毒传播的两方面要求。 4．大白菜病毒病的症状为幼苗受侵后首先心叶出现明脉即沿叶脉失绿，继呈花叶及皱缩。成株被害，出现不同程度的叶片皱缩、变硬而脆，后期出现褐色斑点或褐色坏死条纹；植株矮化。我国十字花科蔬菜病毒病主要由芜菁花叶病毒（简称TuMV）、黄瓜花叶病毒（简称CMV）和烟草花叶病毒（简称TMV）所致，前两种病毒能由蚜虫和汁液传染，第三种只能以汁液传染。 马铃薯病毒病主要是皱缩花叶病和卷叶病两种。前者的症状为叶片皱缩、变小；叶尖向下弯曲，全株矮化，叶片色泽深浅不均，以后出现黑褐色坏死斑，质地变脆，严重时全株发生坏死性叶斑，自下而上枯死。马铃薯皱缩花叶病是由马铃薯X病毒（简称PVX）和马铃薯Y 病毒（简称PVY）两种病毒复合侵染引起的。PVX只能由汁液传染，昆虫不传染。PVY的传染方式有汁液与蚜虫传染。马铃薯卷叶病的症状为叶缘向上卷曲，病重时呈圆筒状。叶片色泽较浅，有时叶背面呈红色或紫色。叶片变厚变脆，病叶不出现萎蔫下垂的现象，矮化亦
病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势 答案
病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势 人副流感病毒的病原学特征及流行病学规律 1、HPIV的治疗中（）只能在早期使用 B、利巴韦林、干扰素和蛋白酶抑制剂 2、下列有关于HPIV的说法中，错误的是（） E、HPIV已成为能够导致最沉重疾病负担及影响经济的病毒之一 3、HPIV的实验室检测手段有（） A、LLC-MK2（恒河猴肾细胞） 4、有关HPIV的病原学特征说法错误的的是（） B、病毒粒子呈多形性、无包膜，直径约125～250nm 5、下列关于几个亚型的HPIV的季节流行特征的说法中，错误的是（） C、HPIV2的几乎每年均可检出，发病高峰期为春夏季
人呼吸道合胞病毒的病原学特征及流行病学规律 1、下列选项中（）属于HRSV的实验室检测 B、Hep-2细胞单层 2、（）是目前临床上唯一用于治疗HRSV感染的药物 A、利巴韦林 3、下列关于HRSV的临床表现中错误的是（） B、大多数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎 4、HRSV的致病机包括（） E、以上都是 5、HRSV的病原学特征不包括（） B、HRSV病毒粒子呈球形和棒状两种形态，病毒颗粒约120~300 nm 人禽流感病毒及实验室检验技术
1、血凝（HA）试验原理是HA能与人或其它动物多种红细胞表面（）受体结合引起红细胞凝集 B、N－乙酰神经氨酸酶 2、中国流感/人禽流感监测信息系统至少有（）个国家级网络实验室 A、60 3、人禽流感病毒检测接种鸡胚，样本需要在温度33-35℃、湿度40-60%条件下孵育（） A、2-3天 4、以下哪项不属于人禽流感病毒核酸检测方法（） D、鸡胚接种 5、微量血抑（HI）试验应制备相应亚型的（）个血凝单位的抗原 B、8
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
实验 15 植物病毒病害抗性鉴定
实验15 植物病毒病害抗性鉴定 植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。 植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。 本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。 一、试材及用具 1．试材发病的植物组织及家兔等。 2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。 二、方法步骤 （一）病毒检测 可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、 图5－1 病毒抗原的分离与纯化
灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。 利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。 2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示： 图5－2 病毒抗血清的制备与保存 3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。 （二）病毒病抗性鉴定 病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是： 1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；
流感病毒的实验室检测方法及进展
·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据
植物病原病毒
植物病原病毒 一、概述 1. 病毒定义：病毒是一组（一种或一种以上）DNA或RNA核酸分子，包围在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞借助于寄主蛋白合成体系、物质和能量完成复制，伴随核酸突变发生变异的分子寄生物。简单讲，病毒是一类由核酸和蛋白质组成的非细胞状态的分子生物。 主要特征：①结构简单的（核酸+蛋白或脂蛋白衣壳）；②严格专性寄生的（依赖寄主的核酸和蛋白质合成系统）；③非细胞生物（分子寄生物）。 2. 类群：根据病毒的寄主类型，习惯上将病毒划归为下列几大类群 寄生植物的称为植物病毒 寄生动物的称为动物病毒 医学病毒（人类病毒） 真菌病毒 寄生细菌的称为噬菌体（细菌病毒） 二、病毒与人类的关系 有害方面：引起人类疾病（天花、爱滋病、非典型肺炎、肝炎、流感、小儿麻痺等）。 引起畜禽疾病（狂犬病、口蹄疫、猪瘟、牛瘟、鸡瘟、鸭瘟）。 引起植物病害。 有益方面：用作基因工程的载体或元件。 有害生物控制（害虫、真菌及杂草生防）。 环境保护（利用藻类病毒消除水面藻类污染）。 花卉增色（金心黄杨、金边瑞香、杂色郁金香）。目前已研究和命名的植物病毒达1000多种，其中许多为重要的农作物病原，其所造成的损失仅次于真菌病害。 植物病毒也有利用的价值，如 TMV导致分子生物学的产生； 病毒在开发基因工程的载体、转 基因植物研究等方面，也发挥了 很大作用。 三、病毒在生物中的地位 生物：细胞生物、分子生物 细胞生物：原核生物（原核生物 界）、真核生物（动物界、植物 界、菌物界、原生生物界） 分子生物：病毒界？：真病毒、 亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病 毒） 四、植物病毒的一般性状 （一）、植物病毒的形态 病毒粒体：病毒的基本存在形 式（形态）。 病毒粒体的形态微小，只有在放 大数万倍的电镜下才能观察到， 其度量单位通常采用纳米（nm， 1nm=10-9m）。 植物病毒粒体形态主要有：球 状、线状、杆状、弹状、双联体 状、丝线状、柔软不定形等。形 态多样性。 ◆许多植物病毒由不只一种粒 体构成。 一些球状病毒也有多种粒体组 分，但这些粒体形态相同，只是 其中所包含的核酸含量不同而 重量存在差异。 这些病毒被称为多分体病毒，必 需有多种病毒粒体组分同时侵 染寄主细胞，才能增殖并完成其 生物学功能。 （二）植物病毒的结构 植物病毒粒体主要含有核酸和 蛋白两大部分。中间为核酸芯 （RNA或DNA），外部有外壳蛋 白（CP）包被形成衣壳，少数病 毒在蛋白衣壳外面还包被一层 那囊膜，称为包膜病毒,如植物弹 状病毒。 1. 杆状或线状病毒：蛋白质亚基 螺旋状排列，中间是一个由核酸 构成的空心管子，核酸也呈螺旋 状排列，嵌入到螺旋状排列的蛋 白质亚基内端。如，TMV杆状 粒体。 TMV：2130个蛋白质亚基；130 圈；16 1/3亚基/圈，3 圈一个周期，49个亚基 /3圈；2.3nm亚基间隔/ 圈。 2. 球状病毒：蛋白质亚基镶嵌在 粒体表面，构成多面体形，内心 是病毒的核酸；球状病毒并非光 滑的球体，而是多面体（多为二 十面体），多个正三角形组合而 成。 （三）植物病毒组分及其生物学 功能 植物病毒的主要成份是核酸和 蛋白质，有些还含有少量的金属 离子、多胺和水等。 1. 核酸 核酸是病毒遗传信息的载体，植 物病毒粒体中的核酸主要是其 基因组，有些含mRNA。一套基 因组含有病毒侵染、复制、运转、 传播等生命活动所需的全部基 因，决定病毒的增殖、生物学特 性及致病性等。 植物病毒基因组所包含的基因 数目从一个（卫星病毒）至十二 个（植物呼肠孤病毒），一般为 4~7个基因，分子量从0.4×106d 到15.5×106d，通常具有外壳蛋 白基因、复制酶基因及运动蛋白 基因等。大部分植物病毒基因组 能编码4~7种蛋白质。 （1）植物病毒的核酸类型 植物病毒的基因组多数为核糖 核酸（RNA），少数为脱氧核糖 核酸（DNA）。 根据核酸性质及功能，可将植物 病毒基因组分为下列5种类型：
9.流感病毒的快速检测方法
一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。 （二）病毒核酸提取 1.实验材料及仪器
作物病毒病
作物病毒病 定义：由植物病毒寄生引起的病害。植物病毒必须在寄主细胞内营寄生生活，专一性强，某一种病毒只能侵染某一种或某些植物。但也有少数为害广泛；如烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。一般植物病毒只有在寄主活体内才具有活性；仅少数植物病毒可在病株残体中保持活性几天、几个月、甚至几年，也有少数植物病毒可在昆虫活体内存活或增殖。植物病毒在寄主细胞中进行核酸（RNA或DNA）和蛋白质外壳的复制，组成新的病毒粒体。植物病毒粒体或病毒核酸在植物细胞间转移速度很慢，而在维管束中则可随植物的营养流动方向而迅速转移症状识别。 田间常因多种病毒复合侵染而使症状表现复杂。可分为以下4种类型： 1、花叶型：典型症状是病叶、病果出现不规则退绿、浓绿与淡绿相间的斑驳，植株生长无明显异常，但严重时病部除斑驳外，病叶和病果畸形皱缩，叶明脉，植株生长缓慢或矮化，结小果，果难以转红或只局部转红，僵化。 2、黄化型：病叶变黄，严重时植株上部叶片全变黄色，形成上黄下绿，植株矮化并伴有明显的落叶。
3、坏死型：包括顶枯、斑驳环死和条纹状坏死。顶枯指植株枝杈顶端幼嫩部分变褐坏死，而其余部分症状不明显；斑驳坏死可在叶片和果实上发生，病斑红褐色或深褐色，不规则型，有时穿孔或发展成黄褐色大斑，病斑周围有一深绿色的环，叶片迅速黄化脱落；条纹状坏死主要表现在枝条上，病斑红褐色，沿枝条上下扩展，得病部分落叶、落花、落果，严重时整株枯干。 4、畸形型：表现为病叶增厚、变小或呈蕨叶状，叶面皱缩.植株节间缩短，矮化，枝叶丝生呈丛簇状。病果呈现深绿与浅绿相间的花斑，或黄绿相间的花斑，病果畸形，果面凸凹不平。病果易脱落。。 发病特点 蚜虫是植物病毒的主要传播者。有的种类只传播一种病毒，也有的可传播多种病毒；还有某一种病毒由多种蚜虫传播的。高温、干旱、蚜虫为害重，植株长势弱，重茬等，易引起该病的发生，可通过摩擦、打杈、邦架等作业时接蛹传播，也可通过蚜虫，机械传播。 防治方法 1 农业防治：①选用抗病品种。②加强栽培管理，合理轮作，收获后清除病残株，注意田间操作中手和工具的消毒。③种子消毒，用清水浸种4小时后捞出放入10%的磷酸三钠液中浸20分钟后洗净催芽播种。 2 也可用新型的病毒病诱抗剂葡聚烯糖或氨基寡糖素来防治。 病毒病应以防为主，综合防治。市场上防治病毒病的药剂有植病灵、32%核苷·溴·吗啉胍(全新配方)、抗病威（病毒K）、病毒立克、病
甲型流感病毒抗原检测试剂使用说明(胶体金)-alerebinaxnow
甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用说明书 【产品名称】 通用名称：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Alere BinaxNOW? Influenza A＆B Card 【包装规格】 22人份/盒。 【预期用途】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）是一种体外免疫层析试验，用于定性检测鼻咽拭子样本中的甲、乙型流感病毒核蛋白抗原，可快速地对甲、乙型流感病毒感染做出辅助鉴别诊断。 试验简介 流感是发生在呼吸道的具有高度传染性的急性病毒感染，它属于传染病范畴，可通过咳嗽或打喷嚏时排出的带有活病毒的气溶胶而在人与人之间传播。每年的秋季和冬季都可爆发流感1.甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒流行性要强，造成的病情也更严重，并且大多数严重的流感也都是由它引起的，而乙型流感则相对比较缓和。 针对甲、乙型流感的快速诊断试验对获取有效的抗病毒治疗是很有意义的。对流感做出快速诊断不但可减少病人住院的天数，减少抗菌素的使用，而且可减少病人的住院费用1。 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）提供了一种用鼻咽拭子标本对甲型和乙型流感进行简便快速诊断的方法，使用方便，结果快速，在急诊检验中提供的信息可帮助医生选择治疗方案并做出是否需要收住院的决定。 甲型流感病毒有许多亚型，有些亚型可在鸟类中发现3。1997年首次报道人类甲型禽流感（H5N1，主要发生于鸟类的一种流感病毒亚型），此后，在人群中出现了H5N1病例，使人们对H5N1关注起来，H5N1的变异使得它更易在人群间传播4，由于备案的禽流感感染病人比
例很低，快速试验在该类病人治疗中利用度尚不得知。 【检验原理】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原这些单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个称作检测卡的书型铰链状的纸板中。 拭子标本需要进行预处理：用洗脱液、盐水或转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，将标本加到检测条顶端，闭合检测卡，15分钟时根据是否出现紫红色样品线来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。 【主要组成成分】 提供的材料 1.检测卡：22人份。包含对甲型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、结合 有胶体金颗粒的对甲型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、对乙型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、结合有胶体金颗粒的对乙型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、兔抗羊IgG、结合有胶体金颗粒的羊IgG。2.吸管：22份，吸管的体积是固定的（100ul），用于向检测卡中加标本用。只能使用随试 剂盒提供的吸管或经过校准能转移100ul标本体积的吸管。 3.阳性对照拭子：1份，将灭活的甲型流感病毒和灭活的乙型流感/哈尔滨（即乙型流感病 毒）干燥结合到拭子上。 4.阴性对照拭子：1份，灭活的A群链球菌干燥结合到拭子上 5.对照拭子用洗脱液小瓶:2瓶，小瓶中含约洗脱液，用于处理测试的对照拭子。 不包含但试验必需的组分（可单独购买） 鼻咽拭子附件包： 鼻咽拭子：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是无菌拭子，可用其他
植物病毒能否感染人类
植物病毒能否感染人类？ 随着现代文明生物科技与医学的发展，人类对病害的防治与抵抗力逐渐加强。然而，面对细菌、病毒也随之进化的现状，生物科研人员也开始着力研究探索。由于细菌与病毒具有突变率高的特性，研发出某种药物或是疫苗常常不及微生物的变异，因此，着手微生物的突变方向以及可能危害人类的方式成为了某一种研究方向。 在最近的一篇New Scientist里出现的文章中有个话题：Could a plant virus have found a way to infect humans?在该文中，Raoult提出一个观点：The virus does not infect human cells directly. Instead, the naked viral RNA may alter the function of the cells through a mechanism similar to RNA interference, in which the presence of certain RNA sequences can turn genes on and off.在其中，Raoult并没用详细指明植物病毒的RNA是通过何种机制使人体的基因发生打开或是关闭。究其植物病毒的运行机制，我这里简要介绍一下植物病毒。 植物病毒（viruses of plants）是指感染高等植物、藻类等真核生物的病毒。早在1576年就有关于植物病毒病的记载，举世闻名的、美丽的荷兰杂色郁金香，实际上就是现在所谓郁金香碎色花病毒造成的。 1892年Д．И．伊万诺夫斯基与1898年M．W．拜耶林克证明，烟草花叶病为比细菌还小的病原体所引起，可通过病叶汁液传染。20世纪初，已经知道昆虫能传播植物病毒病，如叶蝉传播水稻矮缩病。1930年，Н.Н.麦金尼和汤清香发现病毒可以变异，产生致病力强弱不等的毒株,而且不同毒株之间有干扰作用。1935年,美国W.M.斯坦利第一次把烟草花叶病毒(TMV)提纯结晶,F.C.鲍登和N.W.皮里进一步证实结晶物为核酸与蛋白质所构成的核蛋白，从而揭露了病毒的本质。1939年首次在电子显微镜下看到 TMV烟草花叶病毒是杆状颗粒。1956年证明TMV的核糖核酸(RNA)能独立侵染烟草,第一次证明RNA也是遗传信息的载体。60年代将TMV外壳蛋白和 TMV的RNA在试管内重组成完整的、有侵染性的TMV颗粒。TMV的外壳蛋白的一级结构是第一个被完全测定的病毒蛋白。利用 TMV第一次证实病毒核酸的突变反映在外壳蛋白的氨基酸序列上。 植物病毒具有以下特点：植物细胞最外层有以纤维素为材料构成的细胞壁，足以抵抗病毒的侵入，因而植物病毒的特点之一是必须通过寄主的伤口方能侵入。实验室内常用摩擦叶面造成轻微伤口来接种某些植物病毒。农田操作、人口移植、摘心、整枝、打杈时手沾染含病毒的汁液，均可造成病毒传染。病毒也可通过嫁接或植物根在土壤砂砾中伸长时所造成的伤口而传染。但在自然界中，植物病毒最重要的传播媒介是节肢动物门中的昆虫(见昆虫纲)和螨类（见蜱螨亚纲）。已知大约有 400种昆虫可传播200种以上的病毒,其中以叶蝉和蚜虫最为主要，仅桃蚜就能传播约70种病毒。某些昆虫传播植物病毒的一个重要特点是：病毒既能在植物体内、也能在昆虫体内繁殖。传播介体除昆虫外，还有真菌、线虫、兔丝子等。植物病毒的另一特点是植物体内没有象高等动物那样的体液免疫和细胞免疫，感染后病毒能在植物体内无限期地存活，直到寄主死亡，或通过营养繁殖体和块茎、块根、蔓藤、枝条等继续传播。除个别的可通过花粉传染（如大麦条纹花叶病毒）外，一般植物病毒很难进入植物茎尖的分生组织，也不能通过种子传播。绝大多数植物病毒是由核酸构成的核心与蛋白质构成的外壳组成的，极少数还含有脂肪和非核酸的碳水化合物。植物病毒核酸类型有 ssRNA （单链RNA）、dsRNA（双链RNA）、ssDNA（单链DNA）和dsDNA（双链DNA）。但绝大多数含ssRNA，无包膜,其外壳蛋白亚基或呈二十面体对称，或呈螺旋式对称排列，形成球状或棒状颗粒（图1）。大多数植物病毒是由单一种外壳蛋白组成形态大小相同的亚基，多个亚基组成外壳。外壳内含有携带其全部基因的病毒核酸。有的植物病毒的核酸分成1～4段，分别