黄芩苷对香烟烟雾提取物诱导的细胞损伤保护作用研究
黄芩苷对香烟烟雾提取物诱导的细胞损伤保护作用研究
刘福荣，李文芳*，石梦蝶，万丹(武汉科技大学预防医学系，武汉 430065)
摘要：目的研究黄芩苷对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)诱导的人肺泡上皮细胞损伤的影响，并初步探讨其机制。方法制备CSE，用不同浓度黄芩苷对人肺泡上皮细胞A549进行预处理，再用CSE 刺激细胞。用MTT法检测细胞存活率，流式细胞术测定细胞凋亡率，彗星实验观察DNA损伤情况，荧光法测定细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS) 含量。结果随着CSE浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率下降，各组之间有统计学差异(P<0.05)；黄芩苷能减少CSE诱导的细胞存活率下降，抑制CSE诱导的细胞内ROS的产生，并有剂量依赖关系(P<0.05或P<0.01)；黄芩苷+CSE 组细胞的彗星尾长、尾部DNA含量、尾距、Olive尾距均小于CSE组(P<0.05)，并且黄芩苷可以减少CSE导致的细胞凋亡。结论黄芩苷可以拮抗CSE对细胞的损伤，提高细胞的存活率，降低凋亡率，其原因可能与黄芩苷能降低细胞ROS含量，减少DNA损伤有关。
关键词: 黄芩苷；香烟烟雾提取物；细胞凋亡；活性氧；DNA损伤
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2011)05-0391-05
Effect of Baicalin on Cell Damage Induced by Cigarette Smoke Extract
LIU Furong, LI Wenfang*, SHI Mengdie, WAN Dan(Department of Preventive Medicine, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, China)
ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the effect of baicalin on A549 cells exposed to cigarette smoke extract (CSE). METHODS Cultured human lung adenocarcinoma A549 cells. Mainstream smoke was collected by using dimerhyl sulfoxide as absorbent. A549 cells were incubated with different concentrations of baicalin and CSE. Cell viability was evaluated by MTT assay. Cell apoptosis was detected by flow cytometry annexin V-FTTC/PI staining assay. Comet assay was used to detected DNA damage. The contents of reactive oxygen species (ROS) was examined by fluorescence method. RESULTS MTT assay results showed that CSE decrease the viability of A549 cells in time- and concentration-dependent manners(P<0.05). Baicalin inhibited the decrease of viability induced by CSE(P<0.05 or P<0.01), decreased the contents of ROS in A549 cells (P<0.01). The comet assay indicated that baicalin inhibited the DNA damage induced by CSE on A549 cells, tail length, tail DNA%, TM, OTM were lower than CSE group(P<0.05). And apoptosis rate of cells injured by CSE was decreased by baicalin. CONCLUSION Bacalin can inhibit the injury induced by CSE, increase viability, decrease apoptosis. The results may be related to the decrease of ROS and a lower DNA damage rate caused by baicalin.
KEY WORDS: baicalin; cigarette smoke extract; apoptosis; reactive oxygen species; DNA damage
肺泡上皮细胞不仅作为肺的被动生理屏障起到防止外界有害物质侵入的作用，而且在先天性免疫反应中扮演重要的角色，在急性肺损伤的研究中，肺泡上皮细胞损伤程度可以作为疾病严重程度和判断预后的重要因素[1]。香烟烟雾中存在数千种有毒有害物质，对吸烟者多种肺部疾病的发生扮演着直接或间接的作用，黄芩苷是植物黄芩的有效成分之一，具有清热解毒、调节免疫、抗炎、抗氧化、抗变态反应等多方面的作用[2]，本研究用黄芩苷和香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)作用于肺泡上皮细胞，观察黄芩苷对CSE诱导的细胞损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
香烟由某卷烟厂提供(每支烟焦油含量10 mg，尼古丁含量1.0 mg，CO含量10 mg)；肺泡上皮细胞A549 购自武汉大学细胞典藏中心；大气采样器，DMEM细胞培养液购自Hyclone；胎牛血清购自杭州四季青生物试剂公司；活性氧检测试剂盒、噻唑兰、二甲亚砜(DMSO)、细胞凋亡检测试剂盒均购自美国Sigma公司。美国宝特Bio-Tek ELX 800全自动酶标仪，日本岛津荧光分光光度计，日本
基金项目：武汉科技大学校企联合研究基金
作者简介：刘福荣，女，硕士生 Tel: 158******** E-mail: liufurong7@https://www.wendangku.net/doc/3d87971.html, *通信作者：李文芳，女，硕士，副教授，硕导Tel: 138******** E-mail: li-wf@https://www.wendangku.net/doc/3d87971.html,
中国现代应用药学2011年5月第28卷第5期Chin JMAP, 2011 May, V ol.28 No.5 ·391·
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Chin JMAP, 2011 May, V ol.28 No.5 中国现代应用药学2011年5月第28卷第5期
OLYMPUS 公司CKX41-F32FL 荧光显微镜，日本岛津公司流式细胞仪。 1.2 CSE 的制备
用大气采样器作为采集器，DMSO 作为吸收液，3个分别含3 mL 吸收液的U 形吸收管串联，将香烟点燃，调节大气采样器的流量使香烟燃烧速度维持为1支·(5 min)?1，最后制得浓度为1支·mL ?1的CSE ，于?20 ℃保存备用。使用时用DMSO 按照10%、20%和50%稀释。 1.3 细胞培养与处理
将细胞A549培养于高糖DMEM 培养基中，培养基中含有10%的灭活胎牛血清和双抗(100 kU ·L ?1青霉素，100 kU ·L ?1链霉素)，放在37 ℃湿化的5% CO 2 培养箱中培养，取生长状态良好的细胞用于实验。 1.4 MTT 细胞活性测定
实验设空白对照组、溶剂对照组、CSE 、CSE+黄芩苷组，其中CSE 组分为4个浓度组(将“1.2”项下的CSE 按10%，20%，50%，100%配制，每孔加入含1%受试物的培养基200 μL)，分别培养12，24，36 h ；CSE+黄芩苷组是将黄芩苷配制为4个终浓度(5，10，20，40 mg ·L ?1)，培养12 h ，在细胞融合率为60%时，加入含不同终浓度的黄芩苷培养液作用12 h 后加入50%的CSE 作用4 h 。以上各组均按每个浓度设5个平行孔，分别培养12，24，36 h 。
按照常规MTT 实验操作。在酶标仪上测定490 nm 波长的吸光度A 值，以实验组占对照组的百分率表示细胞存活率。细胞存活率=实验组A 值/空白对照组A 值×100%。
1.5 细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的测定
采用活性氧检测试剂盒，按说明书操作。接种细胞浓度为1×106个·mL ?1，将细胞接种于6孔板中，每孔加入2 mL 培养基，当细胞融合率为70%时，每空加入不同浓度的黄芩苷200 μL ，作用12 h 后，加入50% CSE 20 μL ，同时设1% DMSO 溶剂对照，作用4 h ，收集细胞后用荧光分光光度计测定，激发波长488 nm ，发射波长525 nm ，整个过程严格避光。 1.6 Annexin V-FTTC/PI 分析
采用Annexin V-FTTC/PI 检测试剂盒，按照说明书操作。接种细胞密度为1×106个·mL ?1，接种于6孔板中，每孔加入2 mL 培养基，在细胞融合率达到70%时，加入不同浓度的黄芩苷200 μL ，同时设立1% DMSO 溶剂对照，作用12 h 后，加入50% CSE 20
μL ，作用16 h 后，按说明书操作，收集细胞后上流式细胞仪进行检测。 1.7 细胞DNA 损伤的测定
按照MTT 的实验结果，选择细胞存活率70%以上的CSE 浓度以及作用时间。细胞接种在6孔板中，融合率在70%时加入含不同终浓度的黄芩苷作用4 h 后加入50%的CSE 作用4 h ，以1%DMSO 为溶剂对照，按常规方法制片，裂解，解旋，电泳。电泳结束后用40 μL 的溴化乙锭染色(EB ，20 μg ·mL ?1)，荧光显微镜下观察结果并拍照。用CASP 图像分析软件测量每组中50个拖尾细胞的Olive 尾距和尾长，重复3次。 1.8 统计分析
所有实验结果最少重复3次，细胞活性检测值用s x ±表示，用SPSS 统计分析软件，采用One-Way ANOV A 进行检验，P <0.05为有统计学差异。 2 结果
2.1 MTT 细胞活性测定结果
随CSE 浓度和作用时间的增加，细胞活性逐渐降低。与DMSO 溶剂对照组比较，除10%CSE 作用组外，其他各组与对照组比较均有统计学差(P <0.05)；而随着CSE 浓度的增大和作用时间的延长，细胞存活率明显降低，从用20%CSE 作用12 h 组的97.31%±2.15%下降到用100%CSE 作用36 h 组的4.77%±0.65%，各浓度处理组和对照组间具有统计学差异(P <0.05)，结果见图1。单独作用下黄芩苷各浓度组对细胞存活率影响和对照组比较没有统计学差异(P >0.05)，A549细胞加入CSE 4 h 后，细胞的存活率为85.85%±2.03%，而10，20，40 mg ·L ?1黄芩苷+CSE 组细胞存活率分别为87.74%±1.62%，91.73%±2.01%，94.68%±1.54%，显著高于CSE 组(P <0.05或P <0.01)，结果见图2。
图1 经CSE 处理不同时间后A549细胞的存活率
Fig 1 Time- and concentration-dependent effect of CSE on the viability of A549 cells
图2黄芩苷对CSE作用下A549细胞存活率的影响
CSE作用浓度为 0.5支·mL?1，F=160.077，与没有用黄芩苷治疗的CSE 组比较，1)P<0.05, 2)P<0.01
Fig 2 The effect of baicalin on the viability of A549 cells exposed to CSE
Concentration of CSE: 0.5 cigarette·mL?1, F=160.077. Compared with control cells without treatment group, 1)P<0.05, 2)P<0.01
2.2 黄芩苷对CSE作用细胞内ROS水平的影响
在荧光分光光度计下，荧光强度反映了细胞内ROS的生成情况。黄芩苷对CSE作用细胞内ROS水平的影响实验结果见表1。空白对照组荧光强度明显低于其他组，有统计学差异(P<0.01)。CSE组荧光强度最高，经过黄芩苷处理后的CSE组，荧光强度降低，说明黄芩苷能降低CSE诱导的细胞内ROS 的生成，从而降低CSE对细胞造成的氧化损伤。
表1黄芩苷预处理对CSE作用下细胞内ROS含量的影响(s
x±)
Tab 1 Effect s of CSE and baicaline on the ROS of cells(s
x±)
组别荧光强度
空白对照组 0.424±0.007
CSE处理组 0.736±0.0111)2)
黄芩苷10 mg·L?1 + CSE组 0.685±0.0111)2)
黄芩苷20 mg·L?1 + CSE组 0.653±0.0061)2)
黄芩苷40 mg·L?1 + CSE组 0.633±0.0061)2)
注：与空白对照组比较，1)P<0.01；与CSE处理组比较，2)P<0.01 Note: Compared with blank control group，1)P<0.01；compared with CSE treatment group，2)P<0.01
2.3 Annexin V-FTTC/PI分析结果
A549细胞经不同浓度黄芩苷预处理12 h后，加入CSE作用16 h，在Annexin V-FTTC/PI散点图上可见随着黄芩苷浓度的增加，位于右上和右下象限的细胞量逐渐减少，由单纯的CSE作用组的38.12%降到黄芩苷40 mg·L?1预处理组的11.86%，并且位于左下象限的正常细胞的数量也有增加，由CSE组的60.80%增加到了黄芩苷40 mg·L?1预处理组的83.66%。黄芩苷20 mg·L?1和40 mg·L?1作用组细胞凋亡率降低，与CSE组比较有统计学差异(P<0.01)。结果见图3。
图3不同浓度黄芩苷与CSE作用A549细胞16 h后的凋亡结果(Annexin V-FTTC/PI法)
Fig 3Apoptosis of A549 cells 16 h after the treatment of CSE and baibalin analyzed by flow cytometry (Annexin V-FTTC/PI staining)
中国现代应用药学2011年5月第28卷第5期Chin JMAP, 2011 May, V ol.28 No.5 ·393·
2.4 黄芩苷对CSE诱导的细胞DNA损伤作用测定结果
彗星实验结果显示黄芩苷+CSE作用组，在尾部DNA百分含量、尾长、尾距、Olive尾距4个参数与CSE作用组相比均有统计学差异(P<0.05)，结果见表2。
表2 CSE和黄芩苷作用对A549细胞DNA损伤结果
Tab 2Effects of CSE and baicalin on the DNA damage of A549 cells
DNA损伤指标
组别尾部DNA
含量/%
尾长尾距 Olive尾距
空白对照组 8.49±5.62 6.00±3.26 0.66±0.76 0.94±0.67
黄芩苷10 mg·L?1组44.83±8.831) 23.48±4.891)2) 11.27±5.591)2)7.50±1.621)2)黄芩苷20 mg·L?1组34.47±7.241)2) 20.62±3.521)2) 7.21±2.331)2) 5.65±1.291)2)黄芩苷40 mg·L?1组23.44±7.111)2) 16.32±3.151)2) 4.00±1.841)2) 3.51±1.151)2) CSE处理组 50.11±9.071) 25.48±4.451) 13.06±3.541) 9.04±2.101)注：与空白对照组比较，1)P<0.05；与CSE处理组比较，1)P<0.05 Note: Compared with blank control group, 1)P<0.05; compared with CSE treatment group, 1)P<0.05
3 讨论
黄芩苷是唇形科植物黄芩的有效成分之一，目前报道的药理作用包括清热解毒、抑菌抗炎、螯合金属离子、降压、抗变态反应和清除超氧阴离子等，临床用于肝炎、高血压、感染等疾病[3]。本研究主要就其对CSE引起的细胞损伤保护作用进行相关的研究，并对其可能的机制进行了初步探讨。
本研究以A549细胞作为研究对象，探讨黄芩苷对CSE诱导的人肺泡上皮细胞损伤的保护作用。研究结果显示CSE能降低A549细胞的存活率，并且有浓度和时间依赖关系。黄芩苷能明显抑制CSE导致的A549的细胞存活率下降，降低CSE引起的细胞凋亡率增加。
ROS的检测结果表明黄芩苷能降低CSE诱导的细胞内ROS的生成。ROS是真核细胞在有氧呼吸过程中，一小部分氧不能被完全还原而形成的，具有较强氧化作用，包括超氧阴离子(O2?)、羟自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)等。在人体内可引起脂类的过氧化、蛋白质的变性以及DNA的断裂等，参与一系列炎症和变性疾病的形成，并且有研究表明活性氧自由基可以通过损伤DNA、影响信号传导以及参与记忆表达调控等途径来介导细胞凋亡[4-5]。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，是生物有机体在进化过程中形成的一种主动性细胞死亡方式，该过程受到细胞外微环境和细胞内遗传物质的调控。用Annexin V-FTTC/PI双染可用于检测活细胞、凋亡细胞及坏死细胞。由于正常细胞不被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin V，坏死细胞和凋亡晚期细胞可被PI染色，因此利用流式细胞仪技术可以将各个细胞群明显的区分开来。试验结果也看出黄芩苷作用后能够明显降低早期和晚期凋亡细胞量，增加正常细胞量。这一趋势与黄芩苷对细胞内ROS含量的影响趋势一致，提示黄芩苷对CSE引起的细胞损伤保护作用的机制可能是降低其ROS的作用所致。也有报道黄芩茎叶总黄酮能够减轻H2O2对心肌细胞的损伤作用，降低H2O2导致的培养心肌细胞凋亡率。并且黄酮类有明显的自由基清除活性，10 nmol·L?1黄芩苷在培养人体神经细胞瘤SH-SY5Y细胞株中可对抗H2O2引起的损伤[6-8]。彗星实验结果也显示黄芩苷干预组的DNA损伤指标与CSE组有明显的减轻。
目前普遍认为，烟气的危害主要与细胞的氧化损伤有关，香烟烟雾能够对多种细胞产生氧化应激损伤，抑制细胞的生长和增殖，促进细胞凋亡，使细胞内ROS含量上升，对细胞的DNA造成损伤。同样，抗氧化剂能减少烟雾细胞毒性。有研究表明维生素E、维生素C、乙酰半胱氨酸、阿魏酸等抗氧化剂均有保护细胞，拮抗烟气细胞毒性的作用，有抗氧化功能的植物化学提取物同样能拮抗烟气的细胞毒性作用[7-10]。本研究结果显示有抗氧化作用的黄芩苷同样能够拮抗烟气的细胞毒性作用，为利用黄芩苷作为开发减毒香烟的资源提供了一定的实验依据。
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收稿日期：2010-07-29
超声法与闪式提取法提取龙胆中龙胆苦苷的工艺对比研究
朱鹤云，张丽，冯波*(吉林医药学院药学院，吉林吉林 132013)
摘要：目的对比研究超声法与闪式提取法提取龙胆中龙胆苦苷的工艺。方法采用高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量，超声法以乙醇浓度、提取时间、超声功率、料液比为考察因素，闪式提取法以乙醇浓度、料液比、提取时间为考察因素，以龙胆苦苷提取率为考察指标，采用L9(34)正交试验优选最佳提取工艺条件。结果与超声法相比，闪式提取法效率更高，其最佳提取工艺为提取溶剂50%乙醇，料液比1∶60，提取时间3 min。结论本法工艺简单、经济、提取率高，可为中药龙胆的开发利用提供参考。
关键词：超声法；闪式提取法；龙胆；龙胆苦苷；高效液相色谱法
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2011)05-0395-04
Comparison of Ultrasonic Method and Smashing Tissue Extraction Process of Gentiopicroside from Gentianae Radix et Rhizoma
ZHU Heyun, ZHANG Li, FENG Bo*(School of Pharmacy, Jilin Medical College, Jilin 132013, China)
ABSTRACT: OBJECTIVE To compare the ultrasonic extraction and smashing tissue extraction process of gentiopicroside from Gentianae Radix et Rhizoma. METHODS An HPLC method was applied to determine the content of gentiopicroside from Gentianae Radix et Rhizoma. The best extraction technology was optimized by L9(34) orthogonal test with the concentration of ethanol, extraction time, ultrasonic power, material-liquid ratio as factors for ultrasonic extraction and with the concentration of ethanol, material-liquid ratio, extraction time as factors for smashing tissue extraction process, the extraction rate of gentiopicroside was chosen as index. RESULTS Smashing tissue extraction process was superior to ultrasonic extraction, optimal extraction technology were as follows: extraction solvent of 50% ethanol, the material-liquid ratio of 1∶60, extracting time of 3 min. CONCLUSION The smashing tissue extraction process is simple and economical with high extraction rate and can provide parameters for exploitation and utilization of Gentianae Radix et Rhizoma.
KEY WORDS: ultrasonic method; smashing tissue extraction process; Gentianae Radix et Rhizoma; gentiopicroside; HPLC
龙胆(Gentianae Radix et Rhizoma)为龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)、龙胆(G. scabra Bge.)、三花龙胆(G. triflora Pall.)、坚龙胆(G. rigescens Franch.)的干燥根和根茎。龙胆苦、寒，归肝、胆经，具有清热燥湿、泻肝胆火的功效[1]。主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、浙江、湖南、江西、福建、江苏、广东、新疆等省。龙胆苦苷(gentiopicroside，GTP)是龙胆的主要有效成分，具有强烈苦味活性，是龙胆药苦寒的物质基础[2]。现代药理研究证明，龙胆苦苷具有显著的肝脏保护、抗炎、抗病原微生物、中枢兴奋及健胃利胆等作用[3-4]。
基金项目：吉林省科技厅科研课题(200905113)
作者简介：朱鹤云，男，硕士，助教 Tel: 135******** E-mail: zhy19820903@https://www.wendangku.net/doc/3d87971.html, *通信作者：冯波，男，博士，教授Tel: (0432)64560529 E-mail: fengbo2@https://www.wendangku.net/doc/3d87971.html,
中国现代应用药学2011年5月第28卷第5期Chin JMAP, 2011 May, V ol.28 No.5 ·395·