昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
陕西农业科学
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
王芙蓉。吴薇
（北仑出入境检验栓疫局，浙江宁波３１５８００）
提要：昆虫抗性机制的研究对于抗性监潮、治理等具有重要意义．综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。关键词：杀虫剂；抗药性Ｉ苏云金杆菌ｌ阿维菌素
随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用，昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作，延缓了杀虫剂抗性的产生，但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。
１昆虫对化学农药的抗性机制
１．１表皮穿透性的降低
昆虫表皮对药剂穿透性降低，可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间，使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性，但作为其它抗性因子的修饰者则很重要，如与解毒作用相结合，就可大大影响死亡率而增加抗性。表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现［１］。不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别，但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素，杀虫剂穿透性的降低是受“Ｐｅｎ”基因所控制的［２１。
１．２解毒酶活力的增强
与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。这些解毒酶主要包括细胞色素Ｐ４５０介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）、水解酯酶等。
多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系，可使杀虫剂降低或失去杀虫活性，从而使昆虫产生抗药性。Ｐ４５０酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内Ｐ４５０过表达。与抗性相关的Ｐ４５０基因主要有６个：ＣＹＰ６Ａ１、ＣＹＰ６Ａ２、ＣＹＰ６Ａ８、ＣＹＰ６Ａ９、ＣＹＰ６８２和ＣＹＰ６Ｄ１［３］。多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡
?收稿日期：２００８—１１－０４
作者简介：王芙蓉，女．山东烟台人．研究方向：昆虫学．虫啉、有机磷、氮基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。杀虫剂中许多有机磷化合物是被虫体的ＧＳＴ所解毒。一些抗有机氯和有机磷的昆虫体内ＧＳＴ含量很高。ＧＳＴ解毒能力增强也是由于基因在体内的过表达。多种害虫对有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性也与酯酶和水解酯酶有关。酯酶和羧酸酯酶活力增加也能导致棉蚜对有机磷杀虫剂产生抗性。以酯酶为基础的昆虫抗药性机制在分子水平上是因为酯酶基因扩增的结果。另外在昆虫体内还存在ＤＤＴ一脱氯化氢酶，它能把ＤＤＴ分解为无毒的ＤＤＥ，从而使昆虫对ＤＤＴ产生抗性。
１．３神经系统敏感性的下降
靶标不敏感性是昆虫对杀虫剂产生抗药性的一个极为重要的生化机制，已在多种昆虫对多种杀虫剂的抗性中发现。涉及变构乙酰胆碱酯酶（ＡｃｈＥ）对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性、不敏感的钠通道对ＤＤＴ和拟除虫菊酯的击倒抗性和不敏感的ｙ一氨基丁酸（ＧＡＢＡ）受体对环戊二烯类杀虫剂的抗性。
乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。许多昆虫的乙酰胆碱酯酶基因发生突变与昆虫的抗药性有着密切的关系［３。。基因发生突变后，其编码的ＡｃｈＥ对杀虫剂敏感度降低，这是造成昆虫对杀虫剂产生抗性的一个重要原因。现已在很多昆虫中发现不敏感的ＡＣｈＥ，不敏感的ＡＣｈＥ既可能是抗性昆虫ＡＣｈＥ酶量过高所致，也可能是ＡＣｈＥ发生了性质改变。通常情况下抗性是由ＡＣｈＥ变构引起的，不同昆虫的ＡＣｈＥ变构的部位不同。至今在ＡＣｈＥ中已
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发现有四个位置可发生突变。另一方面，乙酰胆碱酯酶基因突变对ＡＣｈＥ结构与功能的影响。害虫可以通过其ＡＣｈＥ活性中心氨基酸序列的改变，影响杀虫剂与酶的结合过程，从而对杀虫剂产生不同程度的抗药性［‘］。
神经系统敏感性降低常表现为击倒抗性。由于钠通道变得不敏感而对ＤＤＴ和拟除虫菊酯的快速击倒和致死作用产生击倒抗性，最早是在家蝇成虫中观察到的，此后发现德国蜚蠊、埃及伊蚊、致倦库蚊等昆虫也有击倒抗性。研究发现电压敏感性钠通道是ＤＤＴ和拟除虫菊酯类杀虫剂的主要靶标［５１。通过跳蚤对拟除虫菊酯类的击倒抗性的研究表明，昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性是由于拟除虫菊酯靶标位点（Ｐａｒａ）的点突变造成的［３］。对果蝇和家蝇的Ｐａｒａ基因相对应ＤＮＡ片段分析发现，击倒抗性与电压敏感钠通道基因片段变化有密切联系，钠通道基因的改变是抗性的基础。
ＧＡＢＡ是昆虫体内重要的抑制性神经传递物质，ＧＡＢＡ受体被阻断神经递质就无法正常传递，因此它也是杀虫剂重要靶标之一。果蝇对环戊二烯类的抗性是由位于第２染色体上的单个主要基因（Ｒｄｌ）控制的。Ｆｆｒｅｎｃｈ－－Ｃｏｎｓｔａｎｔ在抗狄氏剂的抗性果蝇体内克隆出ＧＡＢＡ受体基因Ｒｄｌ，深人研究表明，狄氏剂抗性是Ｒｄｌ基因发生突变，导致敏感性下降［６］。对按蚊狄氏剂抗性品系的研究也证实，抗性品系的Ｒｄｌ基因也存在突变。这一基因突变在蜚蠊、家蝇、赤拟谷盗、埃及伊蚊、咖啡果小蠹等昆虫对环戊二烯的抗性中具有保守性。
２昆虫对苏云金杆菌（Ｂ．ｔ）的抗性机制
苏云金杆菌能产生具有强烈杀虫作用的杀虫晶体蛋白（ＩＣＰ），主要用于鳞翅目、双翅目以及部分鞘翅目昆虫的生物防治。随着Ｂｔ杀虫剂的推广使用，尤其是二十世纪八十年代中期以来，已发现埃及伊蚊、烟芽夜蛾、五带淡色库蚁等多种昆虫对ＩＣＰ产生明显抗性［７］。昆虫的抗性机制比较复杂，根据ＩＣＰ毒素的作用机理，主要有两种。２．１ＢＴ毒素与中肠细胞膜上受体结合的变化昆虫抗性的产生和Ｂｔ毒素与中肠刷状缘细胞膜泡（ＢＢＭＶ）的结合有关。在ＢＢＭＶ中含有与毒素结合的特异受体，毒素与受体间的结合能力、特异结合位点的数目及改变都与抗性的产生有关嗍。在对Ｂｔ毒素产生抗性的印度谷螟和小菜蛾中，Ｂｔ毒素与中肠ＢＢＭＶ的结合力下降是产生抗性的主要机理。虽然抗性个体中毒素的结合位点数显著多于敏感个体，但ＣｒｙＩＡｂ毒素的结合位点却未发生变化。抗性的产生只与Ｃｒｙ－ＩＡｂ结合位点的改变有关，与数量无关。Ｍａｓｓｏｎ等发现在小菜蛾抗性系中，虽然抗性更多地与受体同ＣｒｙＩＡａ的结合力降低有关，但ＣｒｙｌＡｃ毒素可竞争性地与ＣｔｙＩＡａ毒素的结合位点结合而减少毒素在细胞膜上形成孔道的机会，从而导致抗性的降低［口］。
烟芽夜蛾抗性幼虫中，毒素与受体的亲和力较敏感个体稍增加，结合位点的浓度却降低，有可能导致抗性的产生。Ｌｅｅ等发现烟芽夜蛾的抗性和毒素与膜受体间的结合力降低有关，在细胞上有多个毒素的结合位点，推测ＣｒｙｌＡａ、ＣｒｙｌＡｂ、ＣｒｙｌＡｃ３种毒素在细胞膜上共享的结合受体的改变是产生抗性的主要原因［１引。Ｈｅｅｋｅｌ等研究发现，对Ｂｔ棉产生抗性的ＹＨＤ系烟芽夜蛾中，对ＣｒｙＩＡｃ的８０％抗性水平与中肠受体ＢｔＲ一４的位点有关［１１１。Ｇｉｌｌ等成功地构建了烟芽夜蛾的ｅＤＮＡ文库，并从ＹＨＤ烟芽夜蛾中克隆了含有ＡＰＮ与Ｂｔ毒索特异结合的ＢＴＢＰｌ蛋白。标记结合实验显示，细胞膜上的ＢＴＢＰｌ蛋白或Ｎ一氨肽酶活力的降低导致了对Ｂｔ毒素的抗性［１２１。２．２ＢＴ晶体毒素蛋白在中肠中的水解作用变化
Ｊｏｈｎｓｏｎ等早期的研究认为，昆虫中肠蛋白酶的活性下降是抗性产生的原因ｎ引。在一些对Ｂｔ产生抗性的印度谷螟品系中，中肠中毒素的水解及活化比敏感品系和其它的抗性品系低，这种差异主要是由于在这些抗性品系中缺少一种主要的肠道类胰蛋白酶，这种酶的缺少导致ＢＴ毒素在中肠中毒性的降低［８］。但在抗性印度谷螟中肠中也发现，类糜蛋白酶的酶活性比敏感品系约低３倍，而类糜蛋白酶的基因结构和表达在敏感和抗性品系间是相同的，中肠类糜蛋白酶可能与抗性的产生没有直接的关系［１４３。
毒素与特异性结合受体间的改变而产生抗性，是一种较为完善的机理。这其中包含了特异性结合受体ＡＰＮ活力的变化和酶上结合位点在位置、数目上的变化。毒蛋白晶体在中肠水解过程的改变与抗性产生的关系，还需要进一步证实。
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３昆虫对阿维菌素（Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）的抗性机制
阿维菌素是一类新型的高效广谱的抗生素类农药，在防治害虫的同时也使害虫产生了抗药性。近年来对阿维菌素抗性机理的研究主要集中在代谢抗性方面，对表皮穿透性降低和其它抗性机理也有一定研究，而对靶标抗性的研究较少。昆虫对阿维菌素抗药性主要与多功能氧化酶和非专一性酯酶活性增强有关。大量研究表面：多功能氧化酶、酯酶、细胞色素Ｐ４５０以及单加氧酶等都与昆虫代谢抗性的产生有关［１５１。而Ｓｃｏｔｔ等研究表明，多功能氧化酶、水解酯酶和谷胱甘肽转移酶均不能迅速降解阿维菌素，代谢抗性不是小菜蛾Ａ—ＶＥＲ品系的主导抗性机制［１６］。对于穿透作用降低的机理，药剂穿过表皮后在虫体内的吸收过程和重新分布之间的关系等许多问题有待进一步研究。而从阿维菌素选育的幼虫对其内寄生蜂具明显的保护作用，说明抗性机制可能与表皮穿透作用降低有相当关系。小菜蛾对阿维菌素的抗性可能涉及到多种代谢机制。
随着分子生物学技术广泛应用于昆虫学研究，杀虫剂作用机理研究中靶标酶、解毒酶、受体、钠离子通道的结构与功能逐渐得以阐明。无论代谢抗性或靶标抗性都是解毒酶或靶标酶质或量的改变或敏感降低而形成，这些改变都与基因调控或突变有关。在代谢抗性中，酯酶主要与其结构基因的扩增有关，细胞色素Ｐ４５０单加氧酶主要与调节基因有关，ＧＳＴ主要是过量表达。靶标抗性中，无论是靶标酶ＡＣｈＥ还是钠离子通道和ＧＡＢＡ受体，一般都与结构基因的点突变有关。因此，从分子遗传方面研究抗性的本质，将对抗性治理提供重要依据。
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昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
作者：王芙蓉， 吴薇
作者单位：北仑出入境检验检疫局,浙江,宁波,315800
刊名：
陕西农业科学
英文刊名：SHAANXI JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
年，卷(期)：2009，55(2)
被引用次数：0次
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家蝇(Muscadomestic)是世界性分布的重要病媒昆虫害虫之一，自20世纪60年代以来对我国卫生事业产生了很大的影响。目前，化学防制是控制家蝇等病媒生物种群数量的重要手段，拟除虫菊酯类杀虫剂自20世纪80年代起被广泛的应用于各种病媒生物的防制中，而有机磷类杀虫剂自上个世纪六十年代就开始大量应用。随着化学药剂的不断研发和广泛应用，多种昆虫对杀虫剂产生了抗药性，昆虫抗药性已经给卫生防疫工作带来很大不便，成为众所关注的问题。家蝇一直是我国病媒生物控制的重点，及时、准确的确定昆虫抗药性的产生、发展和抗性水平对合理制定防治策略至关重要，对杀虫剂毒性机理的研究就是此项工作的基础。
本文以家蝇为实验动物，首先对家蝇的饲养方法和抗性培育方法进行了研究和试验，确定了使用药膜法作为抗性选育的方法，以点滴法作为抗性水平测定的方法。实验前首先对家蝇进行扩大培养，以山东疾病控制及预防中心病媒生物防治所饲养室饲养的家蝇敏感品系为母本，使家蝇分别在幼虫期和成虫期分别接触敌敌畏和高效氯氰菊酯，将家蝇分为四组，以两种方法进行抗药性的选育。实验观察记录了抗性家蝇形态的变化，统计了不同抗性水平家蝇生活史的变化，计算了不同世代家蝇的性比，测量了不同世代家蝇的体重、抗性水平的变化，测量了不同抗性水平家蝇体内AChE、CAT、活性的变化，测量了第14代家蝇不同抗性品系和敏感品系幼虫和成虫GSTs的活性。
实验结果显示，幼虫期接触杀虫剂的品系抗性水平升高较快。接触敌敌畏的品系家蝇AChE活性逐渐升高，接触高效氯氰菊酯的品系AChE活性先升高后下降；在使用敌敌畏和高效氯氰菊酯培育抗性的过程中，四个品系的家蝇CAT活性没有明显的持续升高；幼虫期接触杀虫剂的品系CAT活性变化较大
，接触敌敌畏的品系CAT活性变化较大。
在第14代的不同品系中，家蝇幼虫的GSTs活性高于成虫，幼虫期施加敌敌畏的品系GSTs活性升高最高。
实验结果表明，AChE是敌敌畏作用于家蝇的靶标；相对于高效氯氰菊酯，推测敌敌畏与CAT活性关系较大；幼虫期接触杀虫剂抗性增加较快，GSTs的活性与幼虫期施加杀虫剂抗性增加较快有关，与家蝇对敌敌畏的抗药性有一定关系。实验结果表明在幼虫期施加杀虫剂使家蝇抗性增加更快。在家蝇的防治工作中，首先应降低杀虫剂对其的选择压力，避免在幼虫期施用杀虫剂，更重要的是对其孳生地进行控制，做好卫生防疫的宣传工作，动员全民共同进行家蝇的防治工作。
本实验可以进一步完善敌敌畏和高效氯氰菊酯的作用机理和家蝇对其抗药性机理的研究，为家蝇的防治工作提供理论和方法的参考。目前绝大多数涉及家蝇抗药性的研究都是控制成虫，对幼虫期接触杀虫剂对抗性的影响及家蝇幼虫和抗药性的关系报道较少，研究强调家蝇成虫可能是由于认为抗性更多的表现在这个时期，认为成虫期是更好的控制家蝇的时期，但抗性发展的潜力在昆虫不同的时期是应该被估计和计算的，以对家蝇抗性控制工作进行更好的规划。
4.期刊论文王学军.霍新北.宫学诗.赖世宏家蝇对化学杀虫剂抗药性及抗性自然衰减趋势-中国公共卫生
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由于长期、广泛、大量地使用杀虫剂,导致蚊虫产生抗药性,给蚊媒控制造成了一定的难度.为了解淡色库蚊对常用杀虫剂抗药性,选择了连云港市城区和农村的淡色库蚊幼虫,对4种常用杀虫剂进行了抗药性监测,结果报告如下.
7.期刊论文李成玲.胡志刚.江毅民.伍浩荣.罗小蕾.严子锵.LI Cheng-ling.HU Zhi-gang.JIANG Yi-min.WU Hao-
rong.LUO Xiao-lei.YAN Zi-qiang广州地区白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性的初步研究-热带医学杂志2010,10(4) 目的 初步了解广州地区白纹伊蚊对常用杀虫剂的抗药性水平,为控制登革热媒介科学合理用药提供依据.方法 从广州地区三种环境类型(农村、郊区、城区)采集白纹伊蚊幼虫,实验室繁殖1～2代,采用WHO推荐的生物测试法进行测定.结果 广州农村地区白纹伊蚊对溴氰菊酯、高效氯氰菊酯的抗药性指数分别为4.95、2.41,已产生低抗性;城区、郊区白纹伊蚊对敌敌畏有低抗性,抗药性指数分别为2.16、3.45;三种环境类型白纹伊蚊均对倍硫磷、氯菊酯、残杀威敏感.结论 广州地区不同环境类型白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性有差异,应因地制宜,科学合理使用杀虫剂.
8.会议论文钱薇萍致倦库蚊对四类化学杀虫剂的抗药性衰退观察2001
通过对致倦库蚊幼虫F<,1～3>和F<,13～14>分别对4类化学杀虫剂(拟除虫菊酯类、有机磷类、有机氯类和氨基甲酸酯类)的抗药性测定结果
(LC<,50>值)进行比较,了解抗药性衰退情况,为害虫抗药性治理提供理论依据.方法:浸渍法.结果:致倦库蚊幼虫F<,13～14>对4类化学杀虫剂的抗药性与F<,1～3>的相比较,均出现明显的衰退.结论:降低杀虫剂使用的选择压力,有助于提高害虫对杀虫剂的敏感性.
9.期刊论文周萌雯.杨承亮.王开林.范贵新.王琪.徐芹.华勇旅客列车德国小蠊对三种杀虫剂的抗药性研究-现代
预防医学2002,29(2)
目的:旅客列车德国小蠊对三种杀虫剂的抗药性研究.方法:采用WHO推荐的测定杀虫剂敏感性的标准方法与现场杀虫效果研究.结果:德国小蠊对拜虫杀、拜力坦、凯素灵的现场杀来效果较好.杀虫剂的KT50值范围为15＇54"～35＇45",R/S值范围为1.04～2.3.结论:旅客列车德国小蠊对常用3种杀虫剂都已程度不同地产生了抗药性.杀虫剂经复配和加增效剂后,可提高杀虫效果.
10.期刊论文庄向荣.费兆全.王安庆.ZHUANG Xiang-rong.FEI Zhao-quan.WANG An-qing日照市区家蝇对化学杀虫
剂的抗药性分析-中国媒介生物学及控制杂志2005,16(5)
目的探讨日照市区家蝇对化学杀虫剂的抗药性现状.方法在市区选择4个点采集家蝇成虫,并将室内饲养一代后的雌性家蝇作为试虫,测试其对残杀威、DDVP、二氯苯醚菊酯、氯氰菊酯的抗药性,计算相对抗药性并进行比较.结果碧波大酒店家蝇对残杀威、DDVP、二氯苯醚菊酯的抗药性均为最高,LD50分别为0.970 0、0.560 1和0.251 0μg/♀;市中医医院家蝇对氯氰菊酯的抗性最高,LD50为0.255 3μg/♀.相对抗性值以DDVP最高(30.41),氯氰菊酯最低(27.31).结论家蝇抗药性水平的高低,与化学杀虫剂用量大小和使用频率高低密切相关.
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昆虫生长调节剂的种类和作用机理
昆虫生长调节剂的种类和作用机理 摘要：昆虫生长调节剂是通过干扰昆虫正常生长发育，致使昆虫个体活动能力下降或死亡，从而导致种群灭绝的一类特异性杀虫剂。本文综合介绍昆虫生长调节剂的发展概况，详述保幼激素类似物、蜕皮激素类似物、几丁质合成抑制种类及其开发应用研究情况，并对其毒理作用机制进行了论述，目前研究表明该类药剂对害虫具高效，对环境污染小，保护害虫天敌，具有明显的选择活性。昆虫生长调节剂虽然发展缓慢，但是应用前景广阔。 关键词：昆虫生长调节剂；毒理机制；研究应用 1. 昆虫生长调节剂的发展概况 昆虫生长调节剂(Insect Growth Regulators)是通过抑制昆虫生理发育，如抑制蜕皮、抑制新表皮形成、抑制取食等导致害虫死亡的一类药剂。1967年威廉姆斯提出以保幼激素(JH)及蜕皮激素(MH)为主的昆虫生长调节剂作为第三代杀虫剂。1985年赵善欢认为昆虫生长调节剂应包括保幼激素(JH)、蜕皮激素(MH)及其类似物、抗保幼激素(JH)、几丁质合成抑制剂、植物源次生物的拒食剂、昆虫源信息素、引诱剂等干扰害虫行为及抑制生长发育特异性作用的缓效型“软农药”，从而拓宽了昆虫生长调节剂的范畴。由于应用此类药剂有利于无公害绿色食品生产，符合人们保护生态要求，曾一度广泛受到人们的关注，并进行开发研究。后因第二代有机合成杀虫剂(有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂)能高效、经济地防治害虫，致使昆虫生长调节剂步入低谷。但随着“农药万能论”思潮的蔓延，“3R”不断加剧，人们对农药的概念又从“杀生物剂”转向寻找“生物合理农药”或“环保和谐农药”的新型杀虫剂，昆虫生长调节剂重新得到重视。由于其作用机理不同于以往作用于神经系统的传统杀虫剂，毒性低、污染少、对天敌和有益生物影响小，有助于可持续农业的发展，有利于无公害绿色食品生产，有益于人类健康，因此被誉为“第三代农药”、“二十一世纪的农药”、“非杀生性杀虫剂”、“生物调节剂” ,“特异性昆虫控制剂”，由于它们符合人类保护生态环境的总目标，迎合各国政府和各阶层人民所关注的农药污染的解决途径这一热点，成为全球农药研究与开发的一个重点领域。 2. 昆虫生长调节剂的种类及开发应用 根据其作用方式以及化学结构主要分为保幼激素类似物、几丁质合成抑制剂和蜕皮激素类似物等(白小军等，2006)。 2.1 保幼激素类似物 保幼激素类似物是指以昆虫体内保幼激素为先导化合物开发的具有保幼激素活性的化合物。这类化合物与几丁质合成抑制剂及蜕皮类活性物质相比较，对昆虫显示药剂活性的生理期更短。因此，要获得最佳杀虫效果必须选择最佳施药时期。因而在昆虫生长调节剂中，该类化合物的商品化品种较少。目前能够广泛应用于农业和卫生害虫防治的主要产品有： (1)吡丙醚(pyriproxyfen)，属苯醚类化合物，能抑制幼虫的发育，在我国登记的有日本住友公司生产的灭幼宝(Sumilarv)0.5%颗粒剂，用于防治蚊、蝇、蜚蠊等卫生害虫，对蜚蠊有特效。据报道吡丙醚对同翅目、缨翅目、双翅目、鳞翅目害虫均有高效，用量少，持效期长，对作物环境安全。
昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制
Science of Sericulture 蚕业科学 收稿日期：2013－06－14接受日期：2013－06－30资助项目：国家自然科学基金项目（No．31272506）。第一作者信息：王国宝（1987－），男，博士研究生。 E-mail ：gbwang0216@163．com 通信作者信息：吴小锋，教授，博士生导师。 E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn * Corresponding author．E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn 2013，39（5）：1005－1010 ISSN 0257－4799；CN 32－1115/S E-mail ：CYKE@chinajournal．net．cn 昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制 王国宝吴小锋 （浙江大学动物科学学院，杭州310058） 摘要最近的研究发现杆状病毒感染能够诱导宿主昆虫产生行为变化，典型的表现为寄主运动能力的增强。从生物学的 角度分析，这是杆状病毒有利于自身传播的操控策略。本文综述了3种典型杆状病毒诱导宿主昆虫行为发生变化的现象以及其可能的分子机制。其中，舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV ）的egt 基因能够引起吉普赛舞毒蛾（Lymantria dispar ）出现异常活跃的攀爬行为；而家蚕（Bombyx mori ）与甜菜夜蛾（Spodoptera exigua ）幼虫分别被家蚕核型多角体病毒（BmNPV ）和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV ）感染后，出现爬行异常活跃的行为则是由于病毒中ptp 基因的存在。不同种类的杆状病毒对宿主昆虫行为的操控策略不同，对杆状病毒操控宿主行为的分子机制的探索是一个新的研究领域，其研究成果不仅有助于揭示杆状病毒与寄主的互作关系，而且将为农林病虫害的生物防治提供新的参考策略。关键词 杆状病毒；egt 基因；ptp 基因；昆虫宿主；行为 中图分类号 S884．5+1 文献标识码 A 文章编号0257－4799（2013）05－1005－06 Host Behavior Alteration and Its Underlying Molecular Mechanism upon Infection of Insect Baculovirus WANG Guo-Bao WU Xiao-Feng * （College of Animal Sciences ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，China ）Abstract Recent studies discovered that baculovirus infection could induce behavior alteration on their host insects．A typ- ical consequence of it is the enhanced locomotor activity．In view of biology ，it is a manipulatory strategy of baculovirus that favors its own transmission．This paper describes behavior alterations in host insect caused by three types of baculov-irus and possible molecular mechanisms underlying the alterations．Among them ，the egt gene of LdMNPV is essential for the hyperactive climbing behavior of Lymantria dispar ，while the ptp gene of BmNPV and AcMNPV is the cause of abnor-mal wandering behavior of Bombyx mori and Spodoptera exigua lavrae．Different types of baculovirus have various mecha-nisms in manipulating host insect behavior．Studies on the underlying molecular mechanisms of such behavior manipula-tions constitute a new and fascinating research field．It will not only uncover the interactive relationship between baculovirus and their host insects but also provide new strategy for biological control of agricultural and forestry pests /diseases．Key words Baculovirus ；egt gene ；ptp gene ；Insect host ；Behavior 杆状病毒是一个庞大的病毒家族，其基因组大 小在80 180kb 之间，为共价闭合环状双链DNA ，包含100多个基因。有趣的是，其中超过10%的基因是从原始宿主中通过水平转移获得的，这些基因 被利用后更加有利于病毒的复制和传播［1］ 。已发现的几百种昆虫杆状病毒分为杆状病毒属（NPV ）和颗粒体病毒属（GV ）2个属。杆状病毒在感染循环过程中会产生遗传物质完全一致但表型具有差
杆状病毒对昆虫有什么危害
杆状病毒对昆虫有什么危害 杆状病毒感染会让昆虫患病，目前发现的有： 1.颗粒病体 根据39蜂疗网调查目前仅见于鳞翅目昆虫。其自然侵染过程与细胞病变均类似于核型多角体病，但病虫症状与核型多角体病不同，病虫皮色变灰或乳黄，虫尸以腹部前端1～2对腹足握持植物枝条，虫尸以“∧”型倒挂。幼虫被感染后至少至4日龄才发病，死于化蛹前，病虫生存期常大于21天。 2.核型多角体病 现已发现280余种核型多角体病，约占昆虫病毒病总数的40％，大多侵染鳞翅目昆虫。 核型多角体病的自然感染过程为：昆虫吞食了被病毒污染的食物，病毒即进入中肠，在昆虫中肠碱性消化液的作用下，多角体被溶解，释放出病毒粒子，游离病毒粒子的囊膜与中肠上皮细胞绒毛的膜融合，核衣壳侵入细胞中，脱壳后，病毒的DNA经细胞核膜的核孔侵入细胞核内，开始其增殖过程。 随病毒的增殖，细胞表现的病理变化为：细胞核内染色质凝集成块，核仁增大，数目增多，RNA合成旺盛，合成出的RNA不断转移到细胞质中；凝集的染色质块集中于细胞核中部形成网状结构的病毒发生基质，在病毒发生基质中病毒的DNA大量合成。随后，在病毒发生基质表面核衣壳开始装配，并不断移到细胞核周围，大部分包入新形成的囊膜内，成为成熟的病毒粒子。最后在病毒发生基质周围形成一个环状带，在带上开始多角体的结晶，病毒粒子随机地包入多角体中，多角体约到一定大小后停止生长，在其表面形成了一层难溶的多角体膜。从多角体开始形成时起，病毒发生基质开始缩小，待多角体充满细胞核后，病毒发生基质消失，核膨大，破裂，细胞随之崩解。 小部分未被包入多角体的病毒粒子，可随细胞崩解进入昆虫血体腔。血体胶中病毒粒子的靶细胞为：气管皮膜细胞，脂肪细胞，肌肉细胞，真皮细胞，血细胞及神经、生殖腺、丝腺等几乎所有组织的细胞。 最后新形成的大量多用体充满了昆虫整个血体腔。 蛀虫幼虫被感染后，4～5天体液是乳白色，厌食，不喜运动，多数移到植物枝条顶部后死亡，虫体软化，脚失去握持力，仅以1～2对臀足附着在植物枝条上，最后松弛倒挂死之。体内组织完全溶解，变成黑褐色，表皮完整但脆弱易破裂。从感染到处亡约1～2周。
双酰肼类昆虫生长调节剂的研究进展
双酰肼类昆虫生长调节剂的研究进展 摘要：昆虫生长调节剂以其高选择性、低毒、不易产生抗性、生态安全而被认为是一类理想的农药，一直受到关注。本文综述了双酰肼类昆虫生长调节剂的作用机理和高活性化合物合成的最新研究成果，旨在为双酰肼类新型昆虫生长调节化合物的设计和合成提供参考。 关键词：昆虫生长调节剂；双酰肼类；作用机理；合成；修饰 中图分类号：S482.3+8 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）03-0005-05 昆虫生长调节剂包括蜕皮激素、保幼激素、几丁质合成抑制剂等。双酰肼类作为十分重要的商品化昆虫生长调节剂品种，以其高选择性、微毒甚至无毒、不易产生抗药性、环境友好成为第三代农药，被普遍认为是一类理想的杀虫剂。本文综述了双酰肼类昆虫生长调节剂的作用机理、化学物合成的研究进展，旨在为双酰肼类新型昆虫生长调节化合物的设计和合成提供参考。 1 双酰肼类昆虫生长调节剂作用机理的研究进展 蜕皮激素是昆虫前胸腺分泌的一种内激素，主要为类固醇类物质，如20-羟基蜕皮酮（20E）。天然蜕皮激素结构复
杂，分离困难，很难大规模应用。抑食肼以及美国罗姆-哈斯公司随后开发的虫酰肼、甲氧虫酰肼等几种双酰肼类杀虫剂在结构上完全不同于天然蜕皮激素，却能模拟20E与蜕皮激素受体复合物相互作用，实现蜕皮激素的功能。药剂与受体复合物结合后，与蜕皮激素作用类似，激活基因表达，启动蜕皮行为。然而，昆虫完成正常蜕皮是由蜕皮激素、保幼激素、羽化激素等激素协调作用的结果[1]，由于双酰肼类化合物只是模拟蜕皮激素作用，使“早熟的”昆虫蜕皮开始后却不能完成，而导致昆虫死亡。这种蜕皮中止可能是由于血淋巴和表皮中的双酰肼类化合物抑制了羽化激素释放所致[2]，也可能是由于大量保幼激素的存在造成的，因为只有在保幼激素浓度降低、蜕皮激素大量存在情况下才能完成变态蜕皮[3]。Wing 等发现抑食肼（RH-5849）能在烟草天蛾幼虫的任何阶段使蜕皮提前启动，这种提前启动蜕皮的现象不需内源20E的存在[4]。 昆虫取食中毒剂量的双酰肼化合物RH-5849或虫酰肼（RH-5992）后，4～6 h内停止进食，并开始蜕皮；1 d后中毒昆虫的头壳早熟开裂，准备蜕皮而又不能继续[5-6]，造成中毒昆虫头壳下形成的新表皮骨化、鞣化不完全，中毒昆虫排出后肠，血淋巴和蜕皮液流失，导致脱水，最终死亡。RH-5849能抑制鞘翅目、鳞翅目、双翅目的雌性昆虫卵巢管的发育，对雌性成虫有化学不育活性；RH-5849可导致美洲
昆虫学蔬菜害虫部分
第三节蔬菜蚜虫类 一、种类和危害 1.、十字花科蔬菜蚜虫（菜蚜）： 桃蚜Myzus persicae (Sulzer) 萝卜蚜Lipaphis erysimi (Kaltenbach) 甘蓝蚜 2.、葫芦科（瓜类）蔬菜蚜虫： 瓜蚜（棉蚜） 3.、茄科蔬菜蚜虫： 桃蚜、茄无网长管蚜 4.、豆科蔬菜害虫： 菜豆蚜（花生蚜、苜蓿蚜、豆蚜） 菜豆根蚜 5.、伞形花科蔬菜蚜虫： 胡萝卜微管蚜：芹菜、芫荽、胡萝卜 6、百合科蔬菜蚜虫： 韭蚜（葱蚜）：葱、蒜、韭菜。 7、菊科蔬菜蚜虫：莴苣指管蚜 8、藜科蔬菜蚜虫：桃蚜 蔬菜蚜虫种类发生类型作物 桃蚜春秋发生型十字花科蔬菜春秋发生型菠菜 夏秋茄子、马铃薯 萝卜蚜春秋发生型甘蓝、萝卜 瓜蚜春夏秋发生型瓜类 茄无网长管蚜夏秋茄子 菜豆蚜秋季豆类 胡萝卜微管蚜春夏秋芹菜、芫荽、胡萝卜 韭蚜春（或保护地）葱、蒜、韭菜 莴苣指管蚜春秋发生型莴苣 二、防治方法 原则：（1）防治蚜虫与控制病毒病同等看待。特别是保护地环境。如桃蚜、瓜蚜。 （2）蚜虫是许多天敌的寄主或猎物，对其防治要谨慎。即要注意保护天敌，提倡使用生理选择性杀虫剂、生物杀虫剂。 （3）少用拟除虫菊酯类杀虫剂，注意轮换用药以防止抗性产生。 （一）农业防治
1.清洁田园结合农事操作，消灭叶、枝梢、果上的蚜虫。 2.栖境管理实行与葱蒜类蔬菜间套作。十字花科蔬菜间种三叶草。 （二）物理机械防治 1、黄板诱蚜：有翅成蚜对柠檬黄色、橙黄色有较强的趋性，可在黄板上涂抹10号机油、凡士林等诱杀。黄板的大小一般为20cm见方，插或挂于田间，黄板诱满蚜虫后要及时更换。 2、银白色避蚜：银灰色对蚜虫有较强的驱避性，可在田间挂银灰塑料条或用银灰地膜覆盖农作物，对由蚜虫迁飞传播病毒有积极的防治作用。 3、使用防虫网：25 或40 目防虫网阻隔。 （三）生物防治 1、使用杀蚜霉素。 2、释放天敌，如蚜茧蜂、草蛉、瓢虫、食蚜瘿蚊等。 3、在菜地周围、垄上种植蜜源植物，吸引蚜虫天敌。 4、使用植物杀虫剂，如苦参碱、茴蒿素水剂。 （四）化学防治 1、按防治指标用药。 2、使用选择性杀虫剂或低毒化学杀虫剂。 3、吡虫啉、啶虫脒、阿克泰、抗蚜威、烯啶虫胺、噻虫啉等新烟碱类杀虫剂。 4、注意喷药质量。 第四节蔬菜潜叶蝇 一、概述 1、种类 菠菜潜叶蝇（花蝇科） 大豆潜叶蝇（潜蝇科） 豌豆彩潜蝇 大葱斑潜蝇 番茄斑潜蝇 南美斑潜蝇（拉美斑潜蝇） 美洲斑潜蝇 三叶斑潜蝇 2、发生危害特点 （1）体小，生活周期短，寄主范围广，繁殖力强，飞翔能力强，传播能力强，随蔬菜（或花卉）的调运、进出口传播。 （2）抗高温，抗药性强。 （3）保护地栽培，为其安全越冬和虫源积累创造了良好的环境。 （4）除直接危害（形成弯曲虫道和虫斑）外，成虫取食或产卵造成一定危害（取食痕和产卵痕）。 二、美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard （一）分布和危害 1、分布：南北美州（巴西、美国、加拿大、墨西哥等）、亚洲、欧洲。我国于1993年在海南发现。目前20多个省普遍发生。 2、寄主：22科、110多种植物，主要有蔬菜、花卉、棉花和许多杂草。在蔬菜中，主
昆虫病原微生物研究进展
2 国内外研究进展 2.1 主要研究应用类群 昆虫病原真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群, 共有 100 多个属 700 余种, 分属于真菌的半知菌亚门、接合菌亚门、鞭毛菌亚门、子囊菌亚门及担子菌亚门中, 大部分是兼性或专性病原体。在含有昆虫病原真菌的 100 多个真菌属中, 约 50 多个属于半知菌亚门。目前已在生产上得到应用的主要有白僵菌、绿僵菌、拟青霉、莱氏野村菌、汤普森被毛孢、蜡蚧轮枝菌等。 3. 1 昆虫病原真菌的入侵机理 根据报道 ,白僵菌、绿僵菌、汤普生多毛孢、莱氏野村菌与根虫瘟霉在入侵寄主昆虫体内直至使昆虫死亡的过程中均大致有下面 4 个阶段。 3. 1. 1 分生孢子附着于寄主体表 ,产生或不产生附着孢。 3. 1. 2 附着的分生孢子产生胞外酶 ,主要是几丁质酶和各种不同的蛋白酶类 ,可分解寄主昆虫的体壁。 3. 1. 3 萌发的孢子侵入寄主昆虫体内。 3. 1. 4 菌丝体在虫体内生长 ,消耗虫体内营养并分泌毒素杀死寄主昆虫。 许多资料报道认为:病原真菌分泌的毒素是昆虫死亡的主要原因。较新近的对金龟子绿僵菌侵机理更为细致的研究认为:几丁质酶和蛋白酶类以及真菌毒素的产生与昆虫病原真菌的致病力有关。国外专家经系统地研究绿僵菌的酶系 ,认为弹性凝乳蛋白酶的活性决定绿僵菌的侵染力 ,并且对编码弹性凝乳蛋白酶的基因进行了克隆 ,准备在植物中选用这种基因[ 23 ],这为用分子生物学技术改良菌株或育种创造了条件。 昆虫病原真菌代谢产物及其作用 昆虫病原真菌的代谢产物从作用上可分为 3 类。除了可杀死昆虫的毒素外 ,还有对植物生长有调节作用的激素类物质以及对人体有保健作用的营养物质 ,有些真菌的分泌物还可抑制植物病害的发生。 4. 1 产生杀虫毒素的昆虫病原真菌的主要类别 目前已报道的可以产生毒素的昆虫病原真菌主要包括球孢白僵菌和卵孢白僵菌 ,它们在孢子萌发 及菌丝生长中均能分泌毒素。绿僵菌的培养滤液和菌丝体中均能提取出毒素物质。虫霉菌也能产生毒 素 ,主要发现在冠耳霉( Conidiobol us coronata)的培养液中,尖突耳霉( C. apiculata) 也产生毒素。拟 青霉属的种类、镰刀菌的许多种类、莱氏野村菌及蜡蚧轮枝孢菌均产毒素。虫草属( Cordycepin)的种类 在培养物中可提取出毒素。有报道认为交链孢属的链格孢菌也有毒素产生 2 国内、外已报道的真菌杀虫剂种类 从20 世纪 60 年代以来,欧美国家及日本在昆虫病原真菌的应用上取得了一些突破。20 世纪 90 年代报道的真菌杀虫剂有 7 种类 24 个商品,分属 8 个国家(名录略写) ,以后报道增至 8 种类 26 种商 品[2 ] 。2000 年还报道了美国密西西比地区防治白蚁 Ret icul i termes f lavi pes 使用的由金龟子绿僵菌制 成的商品“Bioblat”。中国目前能工厂化生产的种类有白僵菌、绿僵菌 ,拟青霉中有 2 种已得到应用[ 2 ]
有害生物防制员初级试卷
有害生物防制员初级试卷 注 意 事 项 1、请按要求在试卷的标封处填写您的姓名、准考证号、身份证号和所在地区。 考试时间：120分钟。 2、请仔细阅读各种题目的回答要求，并在规定的位置填写您的答案。 3、请保持卷面整洁，不要在试卷上作任何与答题无关的标记，也不得在标封区填写无关的内容。 一、单项选择题(第1题～第10题。选择一个正确的答案，将相应的字母填入题内的括号中。每题1分，满分20分。) 1.雌雄成虫均吸血，并能传播疾病的媒介害虫是 （ ） （A ）蚊虫 （B ）跳蚤 （C ）白蛉 （D ）虻蠓 2. .蟑螂最喜爱的食物是 （ ） （A ）香甜油性食品 （B ）腐烂的食品 （C ）酸甜辣的食品（D ）剩余饭菜（E ）同类的尸体 3. 鼠迹包括以下内容 （ ） （A ）鼠洞与咬痕 ﹙B ﹚鼠粪 ﹙C ﹚ 足印和尾痕 ﹙D ﹚以上都是 4. 德国小蠊可钻过 （ ）的缝隙 （A ）1.6mm （B ）1.7mm （C ）1.8mm （D ）1.9mm 5、老鼠通常怀孕期为 （ ） （A ）3周 （B ）3.5周 （C ）4周 （D ）4.5周 6抗凝血灭鼠剂 （ ） （A ）毒性作用缓慢，一般三天后才引起鼠类中毒 （B ）第一代产品毒力比第二代产品的毒力强 （C ）对非标靶动物有严重的危害 （D ）没有对应的解毒剂 7．蝇类主要传播的疾病 （ ） （A ）呼吸道的传染病 （B ）消化疾病的传染病 （C ）眼的传染病 （D ）皮肤传染病 8．蜱螨最主要的特征是 （ ） （A ）有几丁质外骨骼（B ）头胸腹愈合成躯体（C ）无翅无触角 9．蝇类化蛹的场所一般为 （ ） （A ） 潮湿环境（B ）干燥低温环境（C ）低温环境 （D ）高温环境 10、触杀和滞留喷洒能杀灭蟑螂的卵鞘吗 （ ） （A ）能杀灭大和小蠊的卵鞘 （B ）能杀灭小蠊的卵鞘，不能杀灭大蠊的卵鞘 （C ）能杀灭大蠊的卵鞘，不能杀灭小蠊的卵鞘 （D ）因蟑螂的卵鞘坚硬，杀虫剂无法渗入，一般不能杀灭 题。将结果写在横线上。每题1分，满分20分。) 11. 请列举我区常见的四个主要鼠种：褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠。 12. 要在白天活动的蚊种为白纹伊蚊，傍晚和夜间活动的蚊种为库蚊和按蚊 。 13. 蝇每年监测的时间是每年的（3月—11月）。 14. 室内药物灭蝇常用方法？（拟除虫菊酯类药物） 15. 蟑迹为（尸体）（残体）（空卵鞘）（粪便）等。 16. 登革热疫点以查找（小型积水）为主，乙脑和疟疾疫点以查找（稻田）（池塘）等清水 型孳生地为主。 17. 蝇是属于___昆虫__纲、____双翅_____目、____环裂 ___亚目。 18. 蟑螂孳生繁殖必须具备4个条件温暖、潮湿、食源、和隐蔽场所。 19. 成蝇可分为_头、胸、腹_三部份。 20. 倍硫磷用 1%灭臭虫，0.5%～1%灭跳蚤， 1ppm 控制蚊幼孳生地，主要是污水型孳生地，对鱼毒性大。 21、一次灭鼠效果达70％，如果平时不巩固，则 7 个月后鼠密度又可回到原来水平。 22 、我国常见由蚊虫传播的疾病有乙型脑炎、登革热、疟疾、丝虫病 。 23、列举我区常见的四个主要蚊种：淡色库蚊、白纹伊蚊、三带喙库蚊、中华按蚊等。 24、褐家鼠的成幼按体重划分的分界线大约为 80 克 25、当前我国鼠传疾病主要是 流行性热血病 26．蟑螂生活史经历 成虫 、 卵 和 若虫 3期。 27．对蟑螂用喷洒方法杀灭时应先进行滞留喷洒，然后进行缝隙喷洒，二者结合，提高灭效。 28．大多数蝇类成蝇的口器均为____舐吸____式。 29．小家鼠的怀孕期17天左右天左右 30．在常年情况下，淡色库蚊成虫的数量高峰一般出现在 7月份。 题。将判断结果填入括号中。正确的填“√”，错误的填“×”。每题1分，满分10分。) 31雄蚁只能在纷飞季节才能采到 （ ） 32. 误食毒鼠毒饵后首先应打解毒药，以争取抢救时间 （ ） 33室内灭蟑最有效的措施是填缝补洞 （ ） 34. 家蝇栖息最适合的温度是 25-35°C （ ） 35成蝇由头、胸、翅、足、腹五部分组成 （ ） 36、调查灭蚊效果时，灭蚊前后的方法必须一致。 （ ） 37．蟑螂一次交配,终生产卵 （ ） 38．如果灭鼠率只有 50%，肯定不达标。 （ ） 39化学杀灭技术是灭蚊灭蝇的最重要、最常用的措施。 （ ） 40. 褐家鼠和小家鼠的粪便都是纺锤形。 （ ） 红色是正确 考 生 答 题 不 准 超 过 此 线
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细
主要害虫及其防治技术常识
主要害虫及其防治技术常识 园林植物不仅改善生态环境，美化生活，而且还能取得良好的社会效益。而害虫的危害不仅影响园林的生长建设，还会造成经济损失。害虫严重影响了园林绿化美化功能。随着人们环保意识的提高，园林主管部门和研究机构制定了安全有效的控制害虫方法，以减少喷药，保护环境。 1 园林植物害虫的种类 1．1 食叶害虫 大多取食树木及草坪叶片，猖獗时能将叶片吃光，削弱树势，并为天牛、小蠹虫等蛀干害虫侵入提供适宜条件，既影响植物的正常生长，又降低植物的美化功能和观赏价值。此类害虫主要有鳞翅目的袋蛾、刺蛾、大蚕蛾、尺蛾、螟蛾、枯叶蛾、舟蛾、美国白蛾、国槐尺蛾、凤蝶类，鞘翅目的叶甲，膜翅目的叶蜂等。 1．2刺吸式害虫及螨类 刺吸式害虫是园林植物害虫中较大的一个类群。它们个体小，发生初期往往受害状不明显，易被人们忽视，但数量极多，常群居于嫩枝、叶、芽、花蕾、果上，汲取植物汁液，掠夺其营养，造成枝叶及花卷曲，甚至整株枯萎或死亡。同时诱发煤污病，有时害虫本身是病毒病的传播媒介。此类害虫主要有蚜虫类、介壳虫类、粉虱类、木虱类、叶蝉类、蝽象类、蓟马类、叶螨类等。 1．3蛀食性害虫 蛀食性害虫生活隐蔽，天敌种类少，个体适应性强，是园林植物的一类毁灭性害虫。它们以幼虫蛀食树木枝干，不仅使输导组织受到破坏而引起植物死亡，而且在木质部内形成纵横交错的虫道，降低了木材的经济价值。此类害虫主要有鳞翅目的木蠹蛾科、透翅蛾科、鞘翅月的天牛科、小蠹科、吉丁甲科、象甲科、膜翅目的树蜂科、等翅目的白蚁等。 1．4地下害虫 地下害虫主要栖息于土壤中，取食刚发芽的种子、苗木的幼根、嫩茎及叶部幼芽，给苗木带来很大危害，严重时造成缺苗、断垄等。此类害虫种类繁多，主要有直翅目的蝼蛄、蟋蟀，鳞翅目的地老虎，鞘翅目的蛴螬、金针虫，双翅目的种蝇等。 2 园林植物害虫防治技术
昆虫病毒怎样分离与纯化
昆虫病毒怎样分离与纯化 不同病毒的分离纯化过程并不相同，但所采用的技术大同小异，通过39蜂疗网调查发现病毒分离纯化主要是以下几种常用的通用技术。 1.差速离心 所谓差速离心，就是对同一份样品，用高速、低速循环交替离心，高速使病毒沉淀；沉淀饴浆再悬浮，低速除去污染杂质，最终获得较纯净的病毒粗提物。差速离心，可以除去大部分比病毒粒子大或小的杂质。但与病毒粒子大小相似的颗粒却难以除尽，并且由于杂质的吸附作用，实际病毒获得量低，这是本法的缺点。 差速离心的高速、低速是相对而言的；所需的时间也因溶液的密度、黏度的不同而有变化。 2.密度梯度离心 〔1）蔗糖密度梯度区带离心事先于离心管内分层注入不同密度（浓度）的蔗糖溶液，密度大的位于管底部，密度小的在顶部，形成一个蔗糖密度梯度。将需离心分离的混合液置梯度的顶部，离心过程中，不同密度的粒子，移行到与本身密度相同的蔗糖密度部位，即不再向下移行，达到平衡状态，形成致密的沉淀带。有时不同密度粒子尚未移到各自密度相同的梯度部位，但根据粒子大小、密度不同，沉降速度不同，已分别形成清晰的区带，亦可达到良好的分离目的，离心结束后，各区带可按次分部收集。 （2）平衡密度梯度离心将待分离的混合物，均匀地悬浮于适当浓度的重金属盐溶液中（如CsCl、RbCl等），经长时间离心，重金属盐溶液建立起稳定而连续的密度梯度。待分离的粒子被离心力场驱入溶液密度与粒子本身密度相同的区域内，即达到平衡，从而获得了良好的分离效果。 3. 判断沉淀纯度 可以根据紫外吸收光谱判断。各沉淀组分（或沉淀带），稀释到一定浓度，分别置紫外分光光度计中，在波长200～300nm的范围内测定其紫外吸收值。看其是否具有核蛋白的特征性光谱。核蛋白的特征光谱为：最小吸收值在245nm左右，最大吸收值在260nm左右，260nm 于280nm吸光度的比例大干1，小于2，越接近2，纯度越高。
二芳甲酰基肼类(DAH)昆虫生长调节剂的构效关系及作用机理研究概述
第７卷第３期现代农药Ｖ０１．７Ｎｏ．３２００８年６月ＭｏｄｅｍＡｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＪｕｎ．２００８ 二芳甲酰基肼类（ＤＡＨ）昆虫生长调节剂的 构效关系及作用机理研究概述 张一宾 （上海市农药研究所，上海２０００３２） 摘要；介绍了二芳甲酰基肼类昆虫生长调节剂的构效关系和作用机理． 关键词：二芳甲酰基肼类；昆虫生长调节剂；构效关系；作用机理 中图分类号：ＴＱ４５３．４；ＴＱ４５０．１＋２文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－５２８４（２００８）０３?０００４－０６ ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐａｎｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＡｃｔｉｏｎ ｏｆＤｉａｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅｓＩｎｓｅｃｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｏｒ ＺＨＡＮＧＹｉ?ｂｉｎ （ＳｈａｎｇｈａｉＰｅｓｔｉｃｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００３２） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐａｐｅｒｄｉｓｃｕｓｓｅｓＱＳａｇａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｄｉａｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉａｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ；ｉｎｓｅｃｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ；ＱＳＡＲ；ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ 较之其他类动物，昆虫起源最早（４亿年前）， 其物种也占压倒多数（１００万种以上）。历经４亿年 之久的长期分化，使昆虫类在动物中十分繁荣，也 形成了其他生物物种未有的特殊功能，蜕皮即为其中之一。它通过２０一羟基蜕皮酮（２０－ｈｙｄｒｏｘｙｅｃｄｙ－ｓｏｎｅ，图１）作为蜕皮激素来控制蜕皮。蜕皮激素结构的确认已有半个世纪左右【ｌＪ，其间人们也进行各种研究，目前对其作用机理及受体分子间的作用亦基本清楚‘２１。 昆虫系从卵到幼虫，再经蛹后长成成虫，雌性成虫产卵后一生结束。在昆虫的生长周期中，幼虫期会经几次蜕皮，逐渐长大。在此期间，其需摄取大量食物，不少食植性昆虫就需食取农作物以获取养分，由此也危害了不少农作物。昆虫在反复蜕皮中，必须脱去由几丁质和蛋白质组成无伸缩功能的坚硬表皮才能生长。为此，人们通过探明蜕皮激素和蜕皮激素活性物质的杀虫活性，进而解明由此引发的在有机化学、生物化学及分子生物学方面的研究结果，此十分有助于新农药的开发，以及有助于对作用机理的进一步认识。 Ｈ０ Ｈ０ 图１２０．羟基蜕皮酮和松甾酮Ａ的结构式 在确认了蜕皮激素结构后，不少人对其类似化合物作为杀虫剂进行了研究。他们发现，由外部给予蜕皮激素活性物质，会使幼虫身体还未生长到应有程度大小时就引起未成熟的异常蜕皮，导致昆虫死亡。鉴于天然的蜕皮激素及其类似物具有以下特性：①有多个不对称碳原子的甾醇类化合物为骨架，合成十分困难；②分子内有多个羟基，亲水性强，表皮渗透性差；③易在昆虫体内代谢等，故难以在实际中应用。１９８８年，在发现了非甾醇类的Ｎ＇Ｎ’－二芳甲酰基肼类化合物ＲＨ一５８４９具有蜕皮激素活性后，人们对此类化合物进行了广泛的研究，并取得了迅速发展。至今已有虫酰肼（ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ）、 收稿日期：２００８—０４—０８ 作者简介：张一宾（１９４４－－），男，高级工程师，长期从事农药信息研究工作和“世界农药》编辑工作。 万方数据
核型多角体病毒在害虫生物防治中的应用
核型多角体病毒在害虫生物防治中的应用 摘要: 随着化学农药问题的日益严重，昆虫病毒防治害虫是生物防治的一种有效方法。本文主要针对核型多角体病毒的形态特征、病毒的作用机理、后效作用以及重组昆虫病毒和能够感染并增效病毒的物质方面进行的浅显的阐述。 关键词：核型多角体病毒，生物防治，增效作用 化学农药的大量使用，引起农药残留、害虫产生抗性、再猖獗问题日益突出。随着社会对环保意识的高度重视，开发应用高效、低毒、与环境兼容、和谐的农药，减少或替代传统的广谱、高毒有机化学农药，是农药发展的必然趋势[1]。普遍认为21世纪的农药将成为一种“环境和谐农药”(environment acceptable／friendly pesticides)[2]。昆虫病毒作为生物防治的重要手段之一，其优点在于特异性强、毒力高、稳定性好、安全无害，用后能引起害虫群体病毒疾病的流行传播，在相当长时间内可自然控制害虫消长，导致相继世代害虫持续带毒，感染死亡。与其他化学农药和生物农药相比，昆虫病毒杀虫剂到目前未发现抗性问题，这为病毒杀虫剂的发展带来了良好的契机。 1 核型多角体病毒的形态特征 形态 核型多角体病毒（NPV）含包涵体，为多角体病毒Polyhedra。核型多角体直径：~15微米（μm=μ=10-6米）病毒粒子直径：26~70毫微米，长200~400毫微米（nm=mμm=10-9米）粒子杆状，核含双股RNA被壳螺旋状。 不同的昆虫形态有所不同，如黄地老虎核多角体病毒（AsNPV）多角体大多呈六边形。大小一般为—，为多粒包埋类型，每个病毒束内有2—7个棱衣壳，以3—4个最多见。核衣壳为杆状，有的稍有弯曲，大小约为308nm ×52nm[3]。扁刺蛾核型多角体病毒(TsNPV) 在透射电镜下观察多角体平面观量不规则的四边形，五边形以及少量六边形。多角体大小不均一，为～，平均直径为±。多角体在弱戚中作用15分钟左右时，可看到多角体内的病毒粒子随机分布，大小均一，并包埋于多角体的空膜中。同时，还可见到囊状的多角体空膜[4]。 理化性状 主要成份蛋白质不同多角体所含的氨基酸成份不同；不溶于水和多种有机溶剂，如乙醇、乙醚、笨、丙酮等；不能为细菌或细胞蛋白酶破坏；活体外用Na2CO3的稀溶液（~0.05M）溶解获得病毒粒子被食感染虫体，能在中肠释放粒子，多角体不溶于血淋巴，耐低温，－135~150℃下冻融5次不失活。 2 核型多角体病毒的研究与应用 病毒研究利用的历史 第一个关于昆虫病毒病的记录文献是我国12世纪中叶的《农书》中有关于家蚕“高节”、“脚肿”病的记载。这就是我国养蚕农民俗称“脓病”的核型多角体病毒病[5]。迄今为止，已发现的昆虫病毒有很多种。到1995年，已知可从716种昆虫和迄今为止，已发现的昆虫
杆状病毒介绍
杆状病毒 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
农药基础知识精心整理)
农药基础知识 1、农药定义 农药，系指用于防治危害农林牧业生产的有害生物（害虫、害螨、线虫、病原菌、杂草及鼠）。和调节植物生长的化学药品和生物药品。（通常把用于卫生及改善有效成分物化性质的各种助剂也包括在内。） 2、农药剂型 2.1可湿性粉剂WP 指不溶于水或微溶于水的固体或液体原药，表面活性剂（润湿剂、分散性）填料和载体组成，并粉碎一定细度，遇水能被水润湿并形成相对稳定的悬浊液的一种剂型。 2.2可溶性粉剂ＳＰ 有效成分能迅速分解而完全溶解于水中的一种剂型。 75%乙酰甲胺磷；90%杀虫单；90%敌白虫可溶粉；井岗霉素可溶粉。 2.3乳油ＥＣ 由农药原药（原油或原粉）按规定比例溶解在有机溶剂中，再加入一定量的农药专用乳化剂而形成的均相油状液体，加水能形成相对稳定的乳状液，这种油状液体称为乳油。 2.4悬浮剂ＳＣ 不溶于水的固体农药在水中的分散体，该农药剂型是以水为分散介质，将原药、助剂（润湿剂、分散剂、增稠剂、触变剂）经湿法超微细粉碎制得的农药剂型。 2.5微乳剂ＭＥ 农药原药按规定比例溶液解在水中，再加入一定量的乳化剂而形成的均匀液体，不含有机溶液，具有１、环保，以水为溶剂２、无臭味，不伤害人体３、颗粒小，渗透性强４、不污染果疏表面５、闪点高，贮运容易６、溶于水是无色。 2.6水剂ＡＳ 由农药原药和水组成，成本低，但不稳定。 2.7可分散粒剂WDG 2.8水乳剂ＥＷ ３、农药分类 农药有很多分类方法，但一般按三种分类方式： １、按来源分类 ２、按防治对象分类 ３、按作用方式分类 3.1按来源分类 起源于天然矿物原料的无机化合物和石油的农药，统称为矿物源农药。 如：波尔多液、石硫合剂、柴油乳剂、机油乳剂 生物农药是指利用生物资源开发的农药，生物包括动物、植物、微生物。 １、植物源农药：烟碱、印楝素、苦参碱、鱼藤酮 ２、微生物源农药： 农用抗生素—井冈霉素、春雷霉素、多抗霉素、土霉素、链霉素、多杀霉素。 活体微生物农药—真菌（白僵菌、绿僵菌），细菌（Bt），病毒（棉铃虫核多角体病毒、颗粒体病毒、苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒）；（活体微生物农药是利用有害生物 的病原生物活体作为农药，以工业方法大量繁殖其活体并加工成制制剂来应用，而
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 摘要 本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。 说明 定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。