锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析
锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析
摘要：为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息，从锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ株）获得ORF108基因，应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF108基因结构和功能。结果显示，ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da。KHV-CJ 株与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区。该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高，预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因。
关键词：锦鲤疱疹病毒;ORF108基因;生物信息学分析
基金项目：长春市科学技术局先进实用技术的示范推广项目（12XN35）
中图分类号：S941.41
文献标识码： A DOI编号：
10.14025/https://www.wendangku.net/doc/4810273813.html,ki.jlny.2015.22.043
自从20世纪90年代末，锦鲤疱疹病毒病（Kioherpesvirusdisease，KHVD）就在普通鲤鱼和观赏锦鲤
上发现并报道[1-2]。感染本病毒后病鱼聚集在进水口，身体出现白色斑块，皮肤呈现砂纸状纹理并变得粗糙。病鱼出现鳃和眼睛凹陷坏死等症状。
引起本病的病原较早称锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）。有人根据其病理变化又称为鲤肾炎鳃坏死病毒。2012年ICTV（国际病毒命名委员会）发布的第九次分类报告将本病毒命名为鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。本病毒隶属于疱疹病毒目（Herpesvirales）异样疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）成员。相关文献一般仍沿用锦鲤疱疹病毒这个名字。
鲤疱疹病毒属内还有鲤疱疹病毒Ⅰ型和鲤疱疹病毒Ⅱ
型两种病毒。锦鲤疱疹病毒具有双链DNA基因组，是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒[3]，长达295kbp，有156
个开放阅读框[4]。基因装在20面立体结构的核衣壳内，外面包裹来源于宿主的囊膜，囊膜上镶嵌病毒表达的糖蛋白。截至目前，病毒的基因有40个结构蛋白被鉴定。包括3个衣壳蛋白，13个囊膜蛋白，2个被膜蛋白以及22个未分类蛋白[5]。
感染本病毒初期鱼体内各组织均有病毒分布，然后病毒在几个组织和外周白细胞中持续感染，使得普通鲤鱼和锦鲤造成潜伏性感染[6]。当鱼在装载、运输等环境压力下，潜伏的病毒能被激活重新复制进入到细胞外面去，造成排毒并发
病[7-8]。因此频繁的异地运输和贸易使得本病快速的传播[9]。锦鲤疱疹病毒病无论在人工养殖的普通鲤鱼和锦鲤中还是在自然水域中都普遍存在。本病死亡率最高可达100%，严重影响观赏锦鲤的全球贸易和鲤鱼养殖。鉴于锦鲤疱疹病毒病的严重性，联合国粮食及农业组织和世界动物卫生组织都将其列入到了水产养殖和食品资源安全威胁列表和必须呈报的疾病名单中[10]。
鲤鱼针对锦鲤疱疹病毒的免疫应答包括先天性免疫和适应性免疫。致病结果很大程度上应答是有利于病毒所采用的逃避策略还是宿主的免疫应答，理解这两个相反的过程可以帮助开发疫苗或治疗，采用合适的手段来控制本病。
锦鲤疱疹病毒病死亡率高，除预防接种外尚无有效的治疗方法[11]。对于病毒与机体的相互作用，机体对本病毒的应答机理也未明确。Michael Gotesman等针对TK基因和DNA聚合酶基因（TP）设计siRNA片段在体外进行实验，结果能有效减少病毒颗粒从CCB的释放[12]。
本研究以锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ株）基因组为模板，利用PCR技术获得KHV膜蛋白ORF108基因，分析基因的生物学信息，目的是为我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息、分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 毒株与试剂
KHV吉林株及锦鲤尾鳍原代细胞（KF-1）由本实验室保存[13]。
新生牛血清、L-15培养基;ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、10×ExBuffer、dNTPMix、DNAMarker、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒。
1.2 引物的设计及合成
依据GenBank上登录的KHV全基因组序列（GenBank：DQ657948.1）的ORF108基因序列，利用引物设计软件Primer Premiers 5.0设计引物如下：
ORF108P1：
5'-GATATCATGGACACCAACTATACCAAC-3';
ORF108P2：
5'-GAATTCTTACGATACAAAGGACTCGTC-3';
引物两端加EcoRⅤ和EcoRⅠ限制性酶切位点（划线部位）。
1.3 KHV-CJ株ORF108基因的PCR扩增
取1毫升KHV-CJ株病毒液与尾鳍原代细胞在22℃的条件下共培养。收集病毒并提取病毒DNA作为PCR模版，采用25μL反应体系进行PCR，循环温度和时间如下：95℃预变性5分钟;35个循环：94℃热变形1分钟、退火59.6℃30秒、延伸72℃1分钟;后延伸72℃10分钟。PCR产物低温保存。 1.4 KHV-CJ株ORF108基因的克隆及鉴定
回收PCR产物，克隆入pMD18-T载体，用EcoRⅤ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定。筛选出的阳性质粒送至公司测序。
1.5 KHV-CJ株ORF108基因编码蛋白的生物信息学分析
将测序结果在GenBank中进行BLAST比对，利用软件DNAStar6.0翻译出ORF108基因的氨基酸序列;利用TMHMM Server v.2.0软件进行跨膜区分析;利用ProtScale软件分析蛋白质的疏水性;利用BepiPred1.0 Server软件和DNAStar6.0（Protean）对ORF108序列编码的蛋白进行抗原表位分析。
2 结果
2.1 ORF108基因的PCR扩增和鉴定
PCR扩增出一条约600bpDNA片段。将PCR产物回收，连接pMD 18-T载体，筛选的阳性重组质粒用限制性内切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定（见图1），在588bp处和大于2000bp处各有一条带，说明目的基因克隆至pMD 18-T 载体。测序结果表明：本实验室分离株与美国株同源性均为99%，表明通过PCR获得了KHV-CJ株的ORF108基因。
M：DL2000DNA Markers; 2：pMD18T-108的双酶切产物。
2.2 KHV-CJ株ORF108基因的生物信息学分析
2.2.1 测序结果的BLAST比对将测序碱基序列在GenBank中进行核酸BLAST比对，鲤疱疹病毒3型中国吉
林株（KHV-CJ）ORF108基因与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。
2.2.2 基因的序列和编码蛋白分子特征ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da，等电点为5.947，含有15个碱性氨基酸（K、R ）、18个酸性氨基酸（D、E）、77个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）和54个极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。
2.2.3 跨膜区分析TMHMM预测（http：
//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）结果显示ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区（图2）。85-195位于细胞膜内部。
图2鲤疱疹病毒3型中国吉林株（KHV-CJ）ORF108的跨膜区分析序列的TMHMM预测后概率
2.2.4 疏水性分析ProtScale在线分析（http：
//https://www.wendangku.net/doc/4810273813.html,/
protscale/）表明（Hphob. / Kyte & Doolittle算法），ORF108基因编码蛋白具有一定的疏水性，ORF108最大疏水指数为3.256，最小疏水指数为-2.244。进入ProtParam工具（http：//https://www.wendangku.net/doc/4810273813.html,/protparam/），ORF108的总平均疏水
值为0.127，其疏水区域大于亲水区域，可判断为蛋白疏水性蛋白。
2.2.5 抗原表位分析利用http：
//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在线软件和DNAStar 6.0（Protean）对锦鲤疱疹病毒ORF108序列编码的蛋白进行抗原表位分析，ORF108抗原表位主要集中在第12～17、99～104、117～120、161～168和187～192位氨基酸（图3），表明蛋白的表面抗原决定簇主要位于这些区域，预示这些抗原表位可能与该病毒的免疫原性有关。
图3鲤疱疹病毒3型中国吉林株（KHV-CJ）ORF108基因的抗原表位分析
3 讨论
针对锦鲤疱疹病毒ORF108基因编码的蛋白进行抗原表位分析，显示出该蛋白的表面抗原决定簇相对集中于后半段，峰值高。囊膜蛋白位于病毒的最外面，由于其曝露于血液当中常产较多的特异性抗体，因此可作为检测的特异性抗原。浆细胞产生的抗体通常仅仅识别一个抗原决定簇，而一个抗原决定簇仅有5～8个氨基酸组成，因此利用原核表达蛋白上的部分抗原决定簇可用来检测阳性抗体，也可以将其免疫动物制备抗体来检测病原。ORF108基因的分析提示其可以用来制备作为检测锦鲤疱疹病毒的备用基因。正确而详细地绘制蛋白质表位图谱，对定点改造蛋白质分子，设计疫
苗分子结构及免疫干预治疗等具有重要意义。
KHV ORF108基因产物为囊膜蛋白[5]。通常囊膜蛋白与病毒的感染甚至病毒的毒力相关。对于囊膜病毒而言，通过其囊膜糖蛋白（Envelope glycoprotein）介导的病毒囊膜和宿主细胞膜的融合而启动病毒的侵染。囊膜病毒表面的蛋白与宿主细胞的受体结合后，引起了病毒融合蛋白构象发生变化，引起宿主通过胞吞导，病毒进入细胞导致病毒感染细胞。根据病毒的囊膜蛋白构象变化方式，可将囊膜病毒分为两类：Ⅰ型病毒膜融合和Ⅱ型病毒膜融合。Ⅱ型病毒膜分子机制不是很清楚。Ⅰ型病毒膜融合过程中，囊膜蛋白形成折叠的发夹三聚体结构时，缩短了细胞膜和病毒囊膜的距离，这一过程会释放能量，能量更促进膜融合。ORF108基因产物为Ⅰ型囊膜蛋白，分子大小约21kDa，质谱测试完全匹配上的肽段序列17.3%，protein score得分87。以上述理论研究为基础设计的C肽/N肽小分子抑制子，有可能通过结合囊膜与病毒受体产生竞争或者与囊膜蛋白结合后影响了蛋白的
折叠使两膜之间的距离不能靠近从而阻止Ⅰ型囊膜蛋白的
融合机制。这就为病毒疾病的防治提供了新思路和策略。
参考文献
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作者简介：王好，博士，吉林农业大学动物科学技术学院，讲师，研究方向：动物病原学。
高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)
基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？
(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法
2006锦鲤疱疹病毒病的研究进展_刘宗晓
１前言 锦鲤疱疹病毒（ＫＨＶ），属于疱疹病毒科，是双链ＤＮＡ病毒，有囊膜，与其同科的ＣＨＶ、ＣＣＶ之间有免疫交叉反应［１］。ＷａｌｔｚｅｋＴＢ等［２］通过比较疱疹病毒的主要囊膜蛋白基因、衣壳蛋白基因、ＤＮＡ聚合酶基因、螺旋酶基因４个基因，认为，ＫＨＶ与ｃａｒｐｐｏｘｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（Ｃｙｐｒｉｎｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１，ＣｙＨＶ－１）和ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｏｆｇｏｌｄｆｉｓｈ（Ｃｙｐｒｉｎｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ２，ＣｙＨＶ－２）十分相近，而与ｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｖｉｒｕｓ（Ｉｃｔａｌｕｒｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１，ＩｃＨＶ－１）也有在相近之处，因此建议将ＫＨＶ隶属于ＣｙＨＶ－３。目前ＫＨＶ的主要囊膜蛋白基因、衣壳蛋白基因、ＤＮＡ聚合酶基因、螺旋酶基因、胸苷激酶基因及某些未知功能的蛋白基因的部分或完整的核苷酸序列已有报道，但关于ＫＨＶ的其他基因的研究未见报道，其完整的基因组序列及基因图谱还有待于进一步研究和完善。ＫＨＶ的感染谱较小，仅感染锦鲤和鲤鱼；死亡率高达８０％￣１００％，且很快死亡；研究表明，该病毒的致病性具有水温依赖性，该病毒的最适生活温度为１８￣２７℃，其发病水温主要在２３￣２８℃之间；ＫＨＶ的潜伏期长，一般为１４天，甚至更长。 ２国内外流行现状 １９９８年在以色列的ＭａｇａｎＭｉｃｈａｅｌ地区的首次暴发锦鲤疱疹病毒病，但以色列官方宣称这次发作是来源于欧洲，也许是从英国非法进口的鱼及渔场设备所致。在１９９８年夏至１９９９年春的发病导致渔场主损失肉用鲤鱼６００ｔ，出口损失近４００万美元，但直到１９９９年才确认ＫＨＶ为其真正的病原。自１９９８年以来该病在英国、欧洲大陆、美国及以色列等国家和地区暴发流行。日本也于２００３年１０月首次证实了该病的存在［４］。自１９９８年以来，ＫＨＶ在英国每年夏天都要流行一次。另外，１９９８年南非也有此病的报道。 ２００１年４月在以色列的Ｈａｚｏｒｅａ地区再次暴发流行ＫＨＶ，且由于这次ＫＨＶ的暴发流行，ＫＨＶ被列入以色列水生动物疾病名录，作为以色列必须向官方报告的水生动物疾病。但目前还不能明确判断ＫＨＶ的危害在生产实践中所占的地位。随后该病在美国、德国、中国台湾均有报道，据分析该病的流行和蔓延主要通过外贸出口及观赏鱼类的交流所造成。 ２００２年４月，广东省某养殖场进口的锦鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）出现了暴发性疾病，死亡率高达８０％以上，刘荭［５］等人用ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ证实了本次流行的主要病原可能是ＫＨＶ，同时伴有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的继发感染。究其原因，ＫＨＶ可能是从进口的观赏锦鲤中传入我国的。这提示，ＫＨＶ随着进口锦鲤进入我国的风险极大，并且有可能对我国养殖锦鲤及锦鲤出口贸易造成严重的影响。 ３临床症状 ＫＨＶ感染锦鲤后，临床症状主要表现为：停止游泳；鱼皮肤上出现苍白的块斑与水泡；鳃出血，产生大量的粘液或组织坏死；鳞片有血丝；鱼眼凹陷，类似寄生虫感染和细菌感染，出现症状后２４￣４８ｈ死亡；有些鱼表现神经症状，极小的刺激能引起较强烈的反应，然后是不活跃期［６］。 ４诊断方法研究进展 锦鲤疱疹病毒病的临床表现与许多普通的细菌感染和寄生虫侵袭相似，这些现象会掩盖病毒所致的危害。不能单纯通过观察鱼的外部特征或临床表现来进行决定性的判断，因此，确诊还需必要的实验室诊断。目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、原位杂交技术及ＬＡＭＰ法等，聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和细胞培养技术是ＯＩＥ推荐的诊断方法。 ４．１常规的临床诊断 如果出现下列情况，再结合临床特征，则可怀疑ＫＨＶ的感染： １）仅有鲤鱼（包括锦鲤）及其普通变种能被感染 锦鲤疱疹病毒病的研究进展 刘宗晓刘荭江育林 （华中农业大学水产学院，湖北武汉，４３００７０）（深圳出入境检验检疫局动植中心，广东深圳，５１８００１）作者简介：刘荭（１９７１－），女，毕业于华中农业大学，博士，高级兽医师，已发表文章４０多篇。
【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
生物信息学分析实践
水稻瘤矮病毒(RGDV)外层衣壳蛋白 P8的同源模建 高芳銮(Raindy) 同源模建(homology modeling) ，也叫比较模建(Compatative modeling)，其前提是一个或多个同源蛋白质的结构已知，当两个蛋白质的序列同源性高于35%，一般情况下认为它们的三维结构基本相同；序列同源性低于30%的蛋白质难以得到理想的结构模型。同源模建是目前最为成功且实用的蛋白质结构预测方法， SWISS-MODEL 是由SwissProt 提供的目前最著名的蛋白质三级结构预测服务器，创建于1993年，面向全世界的生物化学与分子生物学研究工作者提供免费的自动模建服务。SWISS-MODEL 服务器提供的同源模建有两种工作模式：首选模式(First Approach mode)和 项目模式(Project mode)。 本实例以RGDV P8蛋白为研究对象采用首选模式进行同源模建。 图1 SWISS-MODEL 的主界面 操作流程如下： 1.选择模式 单击左侧的“MENU ”菜单下方的“First Approach mode ”，右侧窗口自动SWISS-MODEL 工作窗口，在相应文本框中分别输入的E-mail 、项目标题、待模建的蛋白质序列，SWISS-MODEL 支持以FASTA 格式直接输入或提交UniProt 的登录号，如图2所示。 《生物信息学分析实践》样 稿
图2 SWISS-MODEL 的序列提交页面 2.参数设置 当前版本只有一个选项可设置，如果用户需要使用指定的模板，可在“Use a specific template ”后的输入框填入ExPDB 晶体图像数据库中的模板代码，其格式为“PDBCODE+ChainID ”，如“1uf2P ”。本例不使用指定模板，默认留空。完毕，点击“Submit Modeling Request ”提交模建请求，服务器返回提交成功的提示，如图3所示： 图3 成功提交 SWISS-MODEL WORKSPACEW 页面会自动刷新，直至模建完成，如图4所示，同时模建结果也会发送到指定的邮箱。 3结果解读 点击下图右上方的“Print/Save this page as ”后的图标，可以将整个结果以PDF 文档格式保存到本地计算机中。模建结果给出了五个部分的信息：模建详情(Model Details)、比对信息(Alignment)、模建评价 (Anolea/Gromos/Verify3D)、模建日志(Modelling log)、模板选择日志(Template Selection Log)。 《生物信息学分析实践》样稿
分子克隆基本操作
分子克隆基本操作 一、PCR（聚合酶链反应）扩增体系 实验成分加入量（ul）终体积 模板DNA 0.1 dNTP 0.4 上游引物（P1）0.5 下游引物（P2）0.5 20 ul 10×Taq Buffer 2.0 TaqDNA聚合酶0.1 ddH2O 16.4 PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸3个步骤组成的不断重复过程： 反应条件 PCR反应变性退火延伸循环周期１940C预变性5min 1 ２940C 1 min 50~570C1 min 720C 1 min 25~35 ３720C 5min (反应结束后，样品可与40C暂存) 二、PCR产物的凝胶电泳检测 1.1%琼脂糖凝胶配制： 配胶：将卡子放于制胶器孔中； 称取0.3g琼脂糖溶于30ml 1×TAE之中置于微波炉中煮沸三次； 倒胶：待温度降低600C左右时（手感容器能耐受），在凝胶中加入EB 至终浓度0.5ug/ml（30ml凝胶1.5ulEB）,摇匀后缓慢倒入制胶器中。避免产 生气泡，尤其注意梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管吸去。 凝胶条件：在室温中放置30~45min.。 拔梳子：小心垂直拔出梳子，保持点样孔完整。 2.加样： 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm。将PCR产物与6×加样缓冲液，混合均匀加至加样孔中。同时，根据待分离片段的大小选择不同的DNA分子量标准作对照。加样孔处于电泳槽的阴极端。（加样是勿碰坏凝胶孔壁，否则DNA带型不整齐。） 3.电泳： 接通电源，开启电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，且负极比正极气泡多，设置电泳电压及电泳时间（电泳时间视具体样品而定，一般15~30min）。 4. 拍照： 胶置于凝胶成像分析仪中，根据图片用途调整焦距及灯光。 三、DNA切胶回收 1.切胶: 于紫外灯下确定欲回收的DNA片段，取干净EP管称重m1标记，用
锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析
锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因的克隆及生物信息学分析 摘要：为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息，从锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ株）获得ORF108基因，应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF108基因结构和功能。结果显示，ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da。KHV-CJ 株与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区。该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高，预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因。 关键词：锦鲤疱疹病毒;ORF108基因;生物信息学分析 基金项目：长春市科学技术局先进实用技术的示范推广项目（12XN35） 中图分类号：S941.41 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/https://www.wendangku.net/doc/4810273813.html,ki.jlny.2015.22.043 自从20世纪90年代末，锦鲤疱疹病毒病（Kioherpesvirusdisease，KHVD）就在普通鲤鱼和观赏锦鲤
上发现并报道[1-2]。感染本病毒后病鱼聚集在进水口，身体出现白色斑块，皮肤呈现砂纸状纹理并变得粗糙。病鱼出现鳃和眼睛凹陷坏死等症状。 引起本病的病原较早称锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）。有人根据其病理变化又称为鲤肾炎鳃坏死病毒。2012年ICTV（国际病毒命名委员会）发布的第九次分类报告将本病毒命名为鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。本病毒隶属于疱疹病毒目（Herpesvirales）异样疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）成员。相关文献一般仍沿用锦鲤疱疹病毒这个名字。 鲤疱疹病毒属内还有鲤疱疹病毒Ⅰ型和鲤疱疹病毒Ⅱ 型两种病毒。锦鲤疱疹病毒具有双链DNA基因组，是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒[3]，长达295kbp，有156 个开放阅读框[4]。基因装在20面立体结构的核衣壳内，外面包裹来源于宿主的囊膜，囊膜上镶嵌病毒表达的糖蛋白。截至目前，病毒的基因有40个结构蛋白被鉴定。包括3个衣壳蛋白，13个囊膜蛋白，2个被膜蛋白以及22个未分类蛋白[5]。 感染本病毒初期鱼体内各组织均有病毒分布，然后病毒在几个组织和外周白细胞中持续感染，使得普通鲤鱼和锦鲤造成潜伏性感染[6]。当鱼在装载、运输等环境压力下，潜伏的病毒能被激活重新复制进入到细胞外面去，造成排毒并发
甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析
第9卷第1期2011年3月生物信息学 China Journal of Bioinformatics Vol．9No．1Mar．，2011 收稿日期：2010－04－29；修回日期：2010－09－06．基金项目：国家948项目（2010－C21）。 作者简介：李国印，男，山东菏泽，硕士研究生E －mail ：lyion029@163．com． *通讯作者：许莉萍，女，福建莆田，博士，博导、研究员，E －mail ：xlpmail@yahoo．com．cn． doi ：10.3969/j．issn．1672－5565．2011．01．006 甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析 李国印，阙友雄，许莉萍* ，郭晋隆，闫学兵，陈如凯 （福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350002） 摘要：用电子克隆方法获得甘蔗MYB2基因，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构 域、 疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明：甘蔗MYB2基因全长991bp ，包含570bp 的ORF ，编码189个氨基酸。甘蔗MYB2基因包含有MYB 功能域，在序列组成、高级结构及活性位点等方面，与玉米等其它植物的MYB2基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。关键词：甘蔗；MYB2基因；电子克隆；生物信息学中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1672－5565（2011）－01－024－04 Electronic cloning and characterization of MYB 2gene from Saccharum officinarum using bioinformatics tools LI Guo-yin ，QUE You-xiong ，XU Li-ping *，GUO Jin-long ，YAN Xue-bing ，CHEN Ru-kai （Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement ，Ministry of Agriculture ，Fujian Agriculture＆Forestry University ，Fuzhou 350002，China ） Abstract ：An novel MYB2gene from Saccharum officinarum was cloned in silico based on the EST seqences from Unigene of NCBI．Some characters of the MYB2encodes amino acid were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics in the following aspects ，including the compositon of amino acid sequence ，hydrophobicity or hydro-philicity ，secondary and tertiary structure of protein and funcion．Bioinformatical analysis showed that the full －length of MYB2gene from S．officinarum was 991bp and it contained a complete ORF which encoded 189amino acid．The MYB2gene contained an typical MYB domain and was highly conservative compared with MYB2from several different plant species in sequence compositon ，advanced structure and activity sites．The results will pro-vide the basis for MYB2gene cloning in experiment． Key words ：Saccharum officinarum ，MYB2gene ，In silico cloning ，Bioinformatics 在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB 结构 域的转录因子C1基因［1］ ， 此后在植物中发现的MYB 相关基因的数量迅速增加。对其功能的研究表明，植物MYB 转录因子具有广泛的生理功能，几乎参与植物发育和代谢的各个方面，重点是调控环境胁迫，如干旱和病害逆境胁迫、次生代谢调节、激素调控应答及控制细胞分化等。 植物MYB2转录因子是MYB 大家族中一个小的亚族，虽然不同植物的MYB2基因具有不同的生物学功能 ［2，3］ ，但它们都是在转录水平上调控植物 各个阶段的生长发育。通过突变体及基因敲除技 术，已克隆了很多植物MYB 类基因，但在甘蔗MYB 方面研究甚少。 以NCBI 数据库为基础，电子克隆得到甘蔗中编码MYB2的cDNA 序列，利用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、疏水性、亚细胞定位及结构功能等方面进行预测和分析，为后续通过实验手段克隆甘蔗MYB2基因和基因功能研究奠定基础。
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
蛋白质组学生物信息学分析介绍
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析 【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。 【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析 Clone and bioinformatics analysis of lactase gene WANG Zheng1, 2, MA Wen li1, ZHENG Wen ling1 (1.Institute of Gene Project, South Medical University Guangzhou 510510, China; 2.Key Laboratory of Molecular Biology, Hainan Medical College Haikou 571101, China ) ［ABSTRACT］Objective: To clone and analyze lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Methods: Cloned lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus with PCR, made sequencing and bioinformatics analysis. Results: Cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. It was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 KDa, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. Made homology comparison with other lacteses. Conclusion: The lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. It provides foundation for further study and colonization at low cost. ［KEY WORDS］Lactase gene; Clone; Bioinformatics analysis 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%［2］，从而导致“乳糖不耐症”的发生。 乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β 半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，
生物信息学分析
生物信息学分析 生物信息学难吗？ 经常有人向我问这个问题，这有什么疑问吗？如果不难学，根本就不用问我这个问题。也无需投入那么多时间精力就能掌握，更无需花费三四千元参加线下的培训班，也不会月薪过万。所以，答案很肯定，道理很简单：生物信息比较难学。 为什么难学？ 我总结里几点原因。首先，这是一个交叉学科，要求你既要有生物学的基础，又要有很强的计算机操作技能。这个就有点困难了。因为只是一个生物学就包括多个门类，有很多东西需要去学习，还需要学习计算机知识。很多人一门内容还没学明白，现在还得在加一门，这就属于祸不单行，雪上加霜，屋漏偏逢连夜雨。因此，这种既懂生物学，又懂计算机的复合型人才就比较短缺。而且，生物信息本质上属于数据挖掘，除了生物，计算机，到后面还需要极强的统计学知识才能做好数据分析，所以，还得加上统计学，也就是生物信息学=生物学+计算机科学+统计学三门学科的知识，这也就是为什么生物信息学比较难学。 第二个原因，生物信息本身就包括很多内容，比如DNA的分析，RNA的分析，甲基化的分析，蛋白质的分析等方面，每一
门类又完全不同，从物种方面来分，动物，植物，微生物，医学等有差别很大，很难有一劳永逸，放之四海而皆准的分析方法。 第三个原因就是生物信息是一门快速发展的学习，会出现很多新的测序方法，比如sanger测序，illumina，BGIseq，PacBio，IonTorrent，Nanopore等，每一个平台技术原理完全不同，因此数据特点也完全不同，这就需要针对每一个平台的数据做专门的学习，而且每个平台又在不断的推陈出现，可能今天你刚开发好的方法，产品升级了，都得推倒重来。还有很多新的技术，例如现在比较火的单细胞测序，Hi-C测序，Bionano测序等等内容，以后还出现更多新技术新方法，足够让你活到老，学到老。当然，你先要能活到老，吾生也有涯，而知也无涯。以有涯随无涯，殆已！ 高风险才有高收益 当然啦，虽然你已经看到学习生物信息肯定是不容易了，门槛很高，但是呢，门槛高也有很多好处，就是挡住了一部分人，当你学会了，迈过门槛，你的身价就提高了。如果人人都很容易掌握了，那么也就不值钱了。所以，生物信息，前途是光明的，道路是曲折的。
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP） 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 二〇〇八年九月修订
目录 一、细菌培养系统（责任人：郑子峥） 二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜） 三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕） 四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛） 五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、） 六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉） 一、细菌培养系统 1、LB培养基:
每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。 2、固体培养基: LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。 3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）： 注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。 注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。 4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan） 注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。 注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。 5、细菌培养： 配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
EST电子延伸克隆专题讨论总结
【EST电子延伸/克隆】专题讨论总结 目的： 方便后来战友的参考，积累资源。 原因： 1。最近求助较多； 2。是一种较常用的生物信息学手段。 形式： 1。可以为原创总结 2。可以为本版关于EST电子延伸讨论的总结(需要有连接) 3。以上二者结合（推荐） 内容： 1。在线/离线的工具，并简单介绍优缺点。 2。推荐优秀的工具。 3。可能存在的问题以及解决方法的探讨。 4。以上3点并不强求全部都有，能就一点深入即可。 5。也可提供线索。 奖励： 1。积分奖励：根据总结的情况，奖励底线：3分，最高奖励：20分或更高，不设上线（适用于自编软件）。 2。提供线索视情况加1-2分。 2。战友的点击、浏览、学习、肯定、收获、回报其实才是最大的奖励 衷心感谢参与讨论的诸位战友： starrweb；wxbing； tussah ；yinhp01 ；crickfrancis； hxygz ；sunxjk ；fxd ；楚布衣；ke nmed ；稀糊醋鱼；tonyybn ；yxiangmind； huazii_2003 ；Gmail ；newdragon； xiaoxiao ；ttdcs ；magicwang； tussah ；jef。 你们的参与促成了讨论的成功。 感谢magicwang；yinhp01；crickfrancis的精心总结，你们的工作使得大家的讨论更有意义。 --------imsupergene
电子克隆简介 新基因搜寻和蛋白质功能分析是人类基因组图谱公诸于世后的研究热点，电子克隆技术以数学为核心，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签（EST）和生物信息数据库，可以加速对人类基因组未知功能新基因的发掘，为人类功能基因组学与蛋白质组学研究提供新的线索和基础。利用电子克隆并结合实验验证可以纠正或避免现有的人类基因组编码序列错误。 电子克隆定义： 依托现有的网络资源等,用同源性检索、聚类、序列拼装等获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。其方法是以目的EST作为种子序列，对选定的dbEST进行同源性搜索，将所选高度同源的ESTs归类，作为种子序列库，进行序列拼装，构建序列重叠群，再以此重叠群为种子序列重复进行同源性搜索、聚类、拼接直至无法进行，已达到最有效延伸。 电子克隆意义： 获得整个编码区或者可变剪接体，寻找全长基因并发现新基因，加速基因结构、功能研究的进程，推动比较基因组学的发展和基因的进化的研究。（以前我以为是设计好的引物做BLAST，观察引物的好坏，哈哈） 具体步骤: 获得了感兴趣的并可能有潜在功能位点的EST，以此EST为种子序列采用dbEST进行同源性搜索，以期获得有片段重叠、同源性高的ESTs。经聚类分析，尽量避免含有旁系同源基因，拼接后产生的序列重叠群，这相当于实验中的一部分cDNA步移工作。以新获得的为种子序列重复进行上述两步骤，至不能获得延伸为止。进行实验，PCR反应获得拼接片段，继续步移，最终获得全长cDNA序列。将新基因对非冗余库进行搜索，以证明这是个全新基因。将新基因注册，获取注册号。 普适性:这得取决EST数目大小，能否覆盖基因组的转炉产物。 大规模EST克隆新基因方法： 大概思路可否如下:组织文库基因获取---模拟消减杂交(类似试验中的SSH)---克隆全长cDNA---电子拼接、RACE----基因全长--功能域、功能基序分析--染色体定位--功能预测---推断新基因的功能----最终可获得一到几条序列即可。 如果能从现有的EST库中寻找差别：如正常组织和肿瘤组织的EST差别。甚至自己仅仅构建一些膜蛋白的文库，利用跨膜蛋白的保守区域克隆所有的细胞表面蛋白，分析表达差异，看看能否和理论预测达到比较好的吻合。 ------yxiangmind 电子序列延伸的生物信息学策略： 1.利用序列同源性比较软件将待进行电子延伸的序列的序列（以下简称种子序列）对库检索。 2.从数据库中挑选出全部相关序列。 3.对所有序列进行片段整合分析（即CONTIG分析），形成延伸后的序列。 4.将新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能被进一步延伸为止。 --------tussah 序列分析，电子克隆等初探 生物信息学可指利用信息技术管理和分析生物学数据。这就意味着生物信息学所涉及的范围相当广泛，从人工智能、机器人一直到基因组(genome)分析。就基因组分析这一角度来看，生物信息学主要是指核酸和蛋白质序列数据的计算机处理和分析。近年来，蛋白质结构数据的快速增长，使蛋白质三维结构的处理分析也归入到生物信息学的范畴。