差别染色鉴定死活细胞

差别染色鉴定死活细胞

【摘要】在生物体外培养的细胞经过一段时间培养，可通过染色鉴别细胞的死活，从而确定细胞培养的死亡率或存活率。

【关键字】死活细胞染色鉴别计数

【背景介绍】

细胞染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。主要体现在：1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过，而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。2）死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。

活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的细胞燃料有：中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯等。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞，从而与解体的DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡冻得被染色的细胞，并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂（参见脂肪细胞染色实验）。伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。

【实验仪器及试剂】

血细胞计数板、显微镜、盖玻片、试管、吸管

细胞悬液、台盼蓝、伊红、Nacl溶液

【实验步骤】

1、将培养箱中的培养皿取出；

2、先用肉眼，然后用显微镜观察培养的细胞。记录细胞悬液的

颜色是浅紫色；同时和其它组的培养皿进行对比，观察培养

液的颜色是否正常，同时分析原因；

3、敲打培养皿，使得贴壁细胞释放出来，旋摇培养皿，使细胞

充分悬浮；

4、取0.5ml细胞悬液，分别加入一滴台盘蓝，或1.5ml 伊红。

轻轻充分混合后，室温下染色二分钟。

5、在计数器上盖上盖玻片。

6、将细胞悬液滴在计数器两边V字形槽内。细胞悬液依毛细作

用扩散到计数区。

7、在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格

内死活细胞的数量。

【注意事项】

1、当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方

线上的细胞。

2、轻轻敲打培养皿的侧壁，不要用力过大，以免破坏培养皿；

3、染色过程要混合均匀，以免影响染色效果；

4、在细胞计数板上滴上细胞液时，量要适当，而且位置要适当，

不要过多，以免污染镜台和物镜；

5、在显微镜下观察时要轻微调节视野，观察到适宜的视野进行计

数统计；

【实验结果】

以下便是在显微镜下观察到伊红染色的细胞图片：

以下是用台盼蓝染色的细胞图片：

此即为在一个视野中观察到的一个中格中的细胞数目，同时在观察时可以发现几乎所有的细胞都死亡，没有存活的细胞，细胞都已被染色而且由以上观察计数的实验结果可计算得：

细胞浓度=（27+22+20+33+18+30）×5×104 ×4=3.12×105（个/ml）。【实验讨论】

1、实验进行过程中，动手同时又动脑，提高自己各方面的能力；

2、实验开始的培养皿中培养液的颜色，如果细胞进行代谢，则呈

黄色，如果没有进行代谢，则为浅紫色，与开始时的细胞液的

颜色一致；

3、用细胞计数板进行计数时，操作得当，不可盲目操作，思考怎

样做到最好，也可以多次操作，熟悉操作技巧；

【参考文献】

1、蔡文琴．现代实用细胞与分子生物学实验技术[M]．北京：人民

军医出版社，2003．13

2、《分子细胞生物学》第三版韩贻仁主编高等教育出版社；

调整细胞密度：做10-1、10-2、10-3浓度梯度，准备6只装有9mL无菌水的试管

诱变准备：两瓶25mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，两瓶25mL0.9%的生理盐水（带玻璃珠），6只9mL的无菌水，5只1mL的移液管（或者5个1mL的枪头），1瓶100mL的无菌水，离心管两个，涂布棒两只，16个培养皿。

酵母菌的死活细胞鉴定

酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数 一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。 二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有 气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为 了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳； 另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。 附:计数板的结构及测定原理 利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。 目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。 计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度 细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数 三、实验结果

个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25

细胞的组成及其结构

考前回归教材—考前读一读 第一部分细胞的组成及其结构 [基本图例] 细 胞 结 构 和 功 能 1．糖类、脂质、蛋白质和核酸共有的元素是C、H、O，除此之外，蛋白质中还含有N等元素，核酸中还含有N、P。 2．组成蛋白质的氨基酸约有20种，不同氨基酸理化性质差异的原因在于R基不同。 3．DNA和RNA在分子组成上的差异表现为DNA中含有脱氧核糖和胸腺嘧啶，而RNA中含有核糖和尿嘧啶。 4．DNA多样性的原因主要是碱基(脱氧核苷酸)的排列顺序不

同；而蛋白质多样性的原因是组成蛋白质的氨基酸的种类、数目、排列顺序以及肽链的空间结构不同。 5．熟记实验中的颜色反应： 蛋白质＋双缩脲试剂→紫色； DNA＋甲基绿染液→绿色； RNA＋吡罗红(派洛宁)染液→红色； 加热砖红色； 还原糖＋斐林试剂――→ 脂肪＋苏丹Ⅲ(Ⅳ)染液→橘黄色(红色)； 线粒体＋健那绿染液→蓝绿色。 6．乳糖和糖原只分布于动物细胞；蔗糖、麦芽糖、淀粉和纤维素只分布于植物细胞。 7．脂质主要包括脂肪、磷脂和固醇，其中固醇又包括胆固醇、性激素和维生素D等。 8.脂肪的含氢量高于糖类，因此氧化分解时，耗O2多，释放能量也多。 9.自由水/结合水的比值越大，生物新陈代谢越旺盛，但其抗逆性相对较小。 10.原核细胞没有核膜、核仁、染色体及除核糖体以外的细胞器。 11.各种生物膜都主要由脂质、蛋白质组成，细胞膜还含有少量糖类。功能越复杂的膜中，蛋白质的种类和数量越多。 12.生物膜的结构特点是具有一定的流动性，功能特性是具有选择透过性。 13.生物膜系统包括细胞膜、核膜及具膜细胞器。核糖体、中心体不是生物膜系统的组成成分。 14.内质网膜与核膜、细胞膜能直接转化，高尔基体膜与内质网

植物细胞的活体染色与死活鉴定

姓名班级齐鲁医学班学号 科目普通生物学实验题目植物细胞的活体染色与死活鉴定 植物细胞的活体染色与死活鉴定 实验目的： 1.了解活体染色的概念和原理 2.学会鉴别细胞的死活 实验原理： ●活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。 ●中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4~8.0之间（由红 变黄）。在酸性条件下中性红解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在pH7以上，它不解离而以分子态溶于水呈橙黄色的溶液。 ●染色：即使是显微镜有足够的分辨率和合适的放大倍数，未经染色的组织切片或涂片常常不能直 接在光镜下观察，其原因主要是标本各部分结构对光的折射率没有显著的差别。染色则是通过改变标本各部分之间对光的折射率，使其可以在光镜下观察。 ●在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况 下呈酸性反应。因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

姓名班级齐鲁医学班学号 科目普通生物学实验题目植物细胞的活体染色与死活鉴定 仪器与用具： 显微镜；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；吸水纸适量。 试剂： 0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液 实验步骤： 1.切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将 内表皮小块轻轻撕下，将制好的洋葱鳞茎内表皮放置于滴加蒸馏水的载玻片上，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察（注意调节光线强度） 2.另取一小块表皮，滴加0.03%的中性红溶液，染色5~10min；在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片 上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察。 3.将步骤2中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10~15min，再置于载 玻片上镜检（为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1mol/L的硝酸钾溶液中浸泡10min左右，然后取出观察。） 4.将步骤3中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察 实验结果： 第一步的观察结果：细胞呈无色透明状态，液泡充盈整个细胞，细胞彼此排列紧密，可见细胞壁。

人体细胞数量

人体细胞数量 人体细胞中O2/CO2的比值，线粒体内比细胞质基质高 下面是小编整理的人体细胞中O2/CO2的比值，线粒体内比细胞质基质高，供大家参考! 上理工附中2015学年第一学期高三生命科学摸底测验卷 (本试卷分选择题和综合题两部分。满分100分，考试时间90分钟。) 一、选择题(共30分，每小题只有一个正确选项) 1、下列对各种生物大分子合成场所的叙述，正确的是 A、酵母菌在高尔基体中合成膜蛋白 B、肌细胞在细胞核中合成mRNA C、T2噬菌体在细菌细胞核内合成DNA D、叶肉细胞在叶绿体外膜上合成淀粉 2、细胞膜是细胞的重要结构。关于细胞膜的叙述，错误的是 A.细胞膜是一种选择透过性膜 B.乙醇通过细胞膜需要消耗ATP C.氨基酸借助膜蛋白可通过细胞膜 D.蛋白质分子可以嵌入磷脂双分子层中 3、细胞是生命活动的基本单位。关于细胞结构的叙述，错误的是 A.细菌有核塘体，无叶绿素 B.蓝藻无细胞核，含DNA和RNA人体细胞中O2/CO2的比值，线粒体内比细胞质基质高 C.水绵有细胞核，也有叶绿体 D.酵母菌有细胞核，无叶绿体 4、ATP是直接为细胞生命活动提供能量的有机物。关于ATP的叙述，错误的是 A.酒精发酵过程中有ATP生成 B.ATP分子含糖 C.ATP中高能磷酸键水解可释放能量 D.ATP的A指腺嘌呤 5、精子内的顶体由溶酶体特化而来。精卵识别后，顶体膜与精子细胞膜融合，释放溶酶体酶使卵子外层形成孔洞，以利于精卵融合形成受精卵。下列叙述正确的是 A.顶体内储存的溶酶体酶是在精子的溶酶体中合成的 B.受精卵中的遗传物质一半来自父方另一半来自母方 C.顶体膜和精子细胞膜融合体现生物膜的选择透过性 D.精子游向卵子所需的能量来自线粒体和细胞质基质 6、一条由50个氨基酸形成的环状多肽，至少含有H原子

1.酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别-4学时

1.酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别-4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 预习内容： 1. 光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页） 2. 酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）预习思考题： 1. 随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？视野范围是如何变化的？ 2. 制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3. 影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4. 如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5. 标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1. 了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法； 2. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 3. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 4. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、实验原理 1. 酵母菌 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

2. 美蓝染液 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母 活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使 美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还 原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观 察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 图1：酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40）图2：酵母菌浸片观察30min（10×40） 三、实验设备及材料 1. 菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2 天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2. 溶液或试剂：0.1%和0.05%吕氏碱性美蓝溶液(或0.01%美蓝水溶液)，革 兰氏染色用碘液等。 3．器材：显微镜，擦镜纸，吸水纸，盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶 头滴管、小烧杯、洗瓶等等。 四、实验步骤与内容 1．美蓝浸片的观察 （1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种 环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗 接种环。

1酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别 预习内容: 1、光学显微镜的使用（参见周德庆,微生物学实验教程第3 版,23-27 页） 2、酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆,微生物学实验教程第3 版,91-95 页） 预习思考题: 1、随着物镜放大倍数的增加,视野的亮度就是增强还就是减弱？应如何调节？视野范围就是如何变化的？ 2、制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3、影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH 等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4、如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5、标本片上的某一物象,第一次瞧到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1、了解普通光学显微镜的构造及原理,正确掌握使用显微镜的方法; 2、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式; 3、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法; 4、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、实验原理 1、酵母菌 酵母菌就是不运动的单细胞真核微生物,其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍,不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大,采用涂片的方法制片有可能损伤细胞,一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖,有的分裂繁殖;有性繁殖就是通过接合 产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片与水一碘液水浸片来观察酵母的形态与出芽生殖方式,并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

美蓝就是一种无毒性的染料 ， 它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形 态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞与活细胞。 图1：酵母菌美蓝浸片观察3min(10 X40)图2:酵母菌美蓝浸片观察30min(10 X40) 三、实验设备及材料 1、菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia? 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensi培养2天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2、溶液或试剂：0、1%与0、05%吕氏碱性美蓝溶液(或0、01%美蓝水溶液), 革兰氏染色用碘液等。 3?器材:显微镜，擦镜纸，吸水纸,盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。 四、实验步骤与内容 1. 美蓝浸片的观察 (1) 在载玻片中央加一滴0、1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。 注:染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 (2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，用吸水纸吸取多余的液体。 2、美蓝染液

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理 通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。 染色原理: 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。 台盼蓝拒染法 台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。 染色原理: 正常细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡的细胞其细胞膜结构被破坏。台盼蓝无法通过正常的细胞膜因而正常的细胞不被台盼蓝染上，而死细胞则可被台盼蓝染成蓝色。 流程: （1）将对数生长期的细胞浓度调整为1~10×10细胞/ml，按10~10个细胞接种于96孔板，每孔100 μl； （2）培养细胞24小时后，对其进行不同处理，每个处理设三个平行对照； （3）收集细胞，经台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数蓝染及不染色细胞，计算细胞存活率； （4）结果统计： 镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。 根据下式求细胞活力： 活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100 注意事项:

台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。 科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。本品为生物染色剂，在细胞毒性试验中用于检测死亡细胞和垂死细胞，也可用于细胞活性的常规评估。如病毒检验，注入循环系统可使肾小管着色，哺乳动物、低等脊椎动物和昆虫的各种组织活体染色。 台盼蓝染色的主要（原理）步骤： 1. 用Hanks液配制0.1%台盼蓝溶液； 2. 用0.5%胰蛋白酶：0.2%EDTA=1：1混合液来消化培养的贴壁细胞； 3. 再加入适量Hanks液制成细胞悬液； 4. 将待染色细胞稀释至所需浓度（方法及浓度范围与细胞计数相同）； 5. 每0.1ml细胞悬液约加新鲜配制的染液一小滴，室温下染3—5min； 6. 染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察； 7. 死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽； 8. 计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目； 9. 统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活率。 细胞活率（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数×100。 死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。 通常认为细胞膜丧失完整性,细胞即可被认为已经死亡.台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂.健康的正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成蓝色.依据此原理,细胞经台盼蓝染色后,可通过显微镜,直接镜下计数或拍照后计数,实现对细胞存活率比较精确的定量分析。 作为细胞染色剂之一的台盼蓝(Trypan Blue)已被证明受到活体细胞的排斥，而死亡细胞摄入染料显示蓝色。通过常用的光学显微镜可以观察到细胞染色情况，同时可以定量计数，但是该染色无法区别自杀细胞还是坏死细胞。

死活细胞的鉴定方法

活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。 不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 常用的方法包括染色法和仪器分析法。 1 染色法 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身

细胞工程复习题及答案

细胞工程复习题 一、名词解释 1.细胞工程：以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 2.外植体：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料 3.植物组织培养：将植物的器官、组织或细胞，在无菌条件下接种于人工配置的培养基上，使其细胞分裂、增值、分化、发育，甚至形成完整植株的方法。 4.愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。 5．离体无性繁殖:简称离体繁殖，是指利用组织培养方法进行植物离体培养，在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。 6．继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。 7.体细胞杂交：（原生质体融合）指在人工控制条件下不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 8 细胞分化：即由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。 9 细胞脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。 10 细胞再分化：即脱分化后的分生细胞在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体，这一过程成为细胞再分化。 11 人工种子：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 12 植物细胞全能性：指植物体的每一个活细胞都具有该植物的全套遗传信息，具备发育完整植株的潜在能力。 13 胚状体：在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

细胞死活鉴定

姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者 科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号 【实验目的】 1、回顾细胞培养的有关知识； 2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 7、学习实验过程的详细描述及实验记录。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧

微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )

BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

死活细胞的鉴别word版

（一）、死活细胞的鉴别 生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微 镜来观察。 染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方 法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未 经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。 所用染料的分类： 一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染 料才能进入细胞膜。 第一类：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易 穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)： 0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。 ③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。 第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯 胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一 特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构 专一性的结合。 ①1%结晶紫染色生理 1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成 蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变 化，基本上不影响细胞的生命活动。 ②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。 丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发 下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰， 它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸 引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNA Page 9发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散 布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物 质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合 在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主 要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸。 本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。 （二）细胞核和染色体的染色 Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。 醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质 丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有 丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色 体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即 可观察。 （三）细胞器的特殊染色

人体细胞

人体细胞 人体细胞是人体的结构和功能的基本单位。共约有40 万亿-60万亿个，细胞的平均直径在10-20微米之间。除成熟的红血球和血小板外，所有细胞都有至少一个细胞核，是调节细胞生命活动、控制分裂、分化的遗传控制中心。人体细胞中最大的是成熟的卵细胞，直径在200微米左右；最小的是血小板，直径只有约2微米。 1、细胞是紧密相连，但又独立存在，组成我们人的身体器官和系统。 2、年轻人的细胞新陈代谢周期快，中年及中年以上人细胞代谢的周期慢，根据每个人的健康状况来决定。 3、细胞是由细胞壁和细胞核构成，细胞壁每天定时开合，细胞壁张开将营养成份输送给细胞核，产生蛋白质、蛋白酶、玻尿酸、胰岛素等人体生存所必要的营养物质。细胞核吸收营养，生成氨基酸，氨基酸脱水、缩合、生化成链状的肽细胞也是人体的清洁工和搬运工，它将营养成份输送、运载给人体，也将人体排出毒素和产生的垃圾运出体外。细胞不健康，它的运载能力就会下降，出现罢工现象，不再生成和供给人体营养，细胞就慢慢坏死、变白，形成白癫疯等疾病。 细胞也有分工和名称：

如有：非白细胞、白细胞、红细胞 白细胞，又含有20来种细胞，很复杂 红细胞，也含有20多种细胞 各有分工，各司其职 细胞正常，各细胞工作到位，人体就正常、健康。 什么是肽 肽是以氨基酸为底物。由氨基酸的氨基缩合、生化成肽。多个肽进行多级、折叠就组成一个蛋白质分子，蛋白质也被称为“多肽”。 肽的种类： 分为肽、多肽、活性肽与大肽

低聚肽也称为小分子活性多肽，生物学家将小分子活性多肽称为“生物活性肽”。 肽的应用：从功能角度来分，可以分为降压肽、抗氧化肽、降胆固醇肽、活性肽与营养、荷尔蒙、酵素抑制、调节免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常紧密的关系。 多肽大体分为：多肽类药物和多肽类保健品 2011年对多肽类药物的开展已经发展到疾病防治的各个领域特别是在抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、细胞因子模拟肽抗菌活性肽、多肽疫苗、诊断用多肽等领域。肽对于我们人体小到每个细胞，大到每个系统都是有保护和修复作用的。《肽的功能和功效》 1、肽，能逆转青春，服用后人年轻，漂亮，减肥。 2、对消化系统的作用：能迅速被胃肠壁细胞直接吸收，激活胃肠功能，促进消化酶的分泌，增进食欲，调理慢性胃肠病患。 3、对循环系统的作用：降低血粘稠度，清除低密度脂蛋白，防止动脉硬化，增强心肌和血管的弹性，有效调理心脑血管疾病。 4、对呼吸系统的作用：激活肺部细胞，修正气血屏障，清除肺部毒素，预防和调理肺气肿、肺供氧不足等呼吸系统疾病。 5、对骨骼系统的作用：促进生成大量的成骨细胞，抑

07 动物细胞培养及死活细胞鉴别

山东大学实验报告2018年5月21日 ________________________________________ _________________________ 姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午 科目：细胞生物学实验题目：动物细胞培养及死活细胞鉴别学号：201600140055 一、目的要求 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.了解动物细胞培养的原理及注意事项。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞计数方法，计算细胞存活率 二、实验原理 1、细胞培养 细胞培养技术指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术，也叫细胞克隆技术。 细胞培养技术可以由一个细胞经过一段时间的培养得到大批的简单的单细胞或极少分化的多细胞，通过细胞培养可以得到大量的细胞或细胞代谢产物。细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 细胞培养具有其他生物技术无可比拟的优点：培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构，细胞生长及发育等过程的观察。在生物学的各个领域已被广泛应用。 但细胞培养也存在一定的局限性：细胞的培养是在脱离了机体的外界环境之中，与体内环境存在一定的差别，因此细胞培养过程中观察到的现象有时难以正确反映机体内的状况。 2、细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存在以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允 许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台 盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶（PI）或溴化乙啶（EB）等 为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。 此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择 透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁 分离。

细菌分类鉴定方法的研究进展

细菌分类鉴定方法的研究进展 目录 细菌分类鉴定方法的研究进展 (2) 摘要 (2) ABSTRATC (3) 1、引言 (4) 1.1细菌分类鉴定 (4) 1.1.1 细菌常规鉴定方法 (4) 1.1.2细菌的数值分类和自动化鉴定 (4) 1.1.3化学分类鉴定法 (4) 1.1.4分子遗传学分类鉴定法 (4) 1.2细菌分类鉴定方法的前景 (5) 细菌的鉴定方法的介绍与总结 (5) 1、细菌常规鉴定方法 (5) 1. 1 免疫诊断技术 (5) 1. 1. 1 凝集试验 (5) 1. 1. 2 免疫酶技术 (5) 1.1. 3 免疫荧光技术 (5) 1. 1. 4 放射免疫测定技术 (6) 1. 1. 5 免疫胶体金标记技术 (6) 1. 2 蛋白质图谱分析 (6) 2、细菌的数值分类和自动化鉴定 (6) 3、化学分类鉴定法 (7) 3.1 磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）[6] (7) 3．2 高效液相色谱（HPLC）[7] (7) 3.3 气相色谱（GC）[7] (7) 4、分子遗传学分类鉴定法 (7) 4. 1 细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定 (7) 4. 2 核酸杂交技术 (7) 4. 3 限制性核酸内切酶分析法 (7) 4. 4 质粒图谱分析法 (7) 4. 5 脉冲场凝胶电泳分析法 (8) 4. 6 PCR技术 (8)

4. 7 16SrRNA 序列和16S～23SrRNA 间区序列分析法 (8) 4. 8 微生物全基因组测序 (8) 6、参考文献 (9) 细菌分类鉴定方法的研究进展 摘要 细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。分子遗传学鉴定法[1]是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA 进行分析,核酸杂交、PCR 技术、16SrRNA 和16 ～23SrRNA 序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。本文主要来介绍各种分类方法以及每种方法的优缺点。 关键词：细菌分类鉴定表型鉴定分子遗传学鉴定

细胞死活鉴定

【实验目的】 1、回顾细胞培养的有关知识； 2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 7、学习实验过程的详细描述及实验记录。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重

要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代上的差异：活细胞中新代作用强，细胞的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 1.细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第

死活细胞鉴定及细胞活力测定

死活细胞测定及细胞活力测定 【实验原理】 （一）染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在： （1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。 （2）死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原 能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。 常见的细胞染料有：中性红（细胞器的专有染料）、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸 酯（FDA等。 ①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。利用细胞膜的通透性差异，用来染 原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。中性红无毒，常做活体染色的染料。 ②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合， 使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。 ③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细 胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞. ④甲基蓝染色法：甲基蓝染色与台盼蓝类似的染色机理。 （二）植物细胞质壁分离法及活体染色测定细胞死活 （1 ）质壁分离法：成长的植物细胞一般具有中央液泡，在中央液泡和细胞壁之间为细胞质的薄层及其内外膜——液泡膜和质膜。液泡中的胞液具有一定的溶质势（或称渗透势），而活的原生质特别是液泡膜和质膜则具有半透性。所以，当细胞与外界溶液接触时，便与外液构成渗透系统，并可能发生水分的移动。若外液的水势低于胞液的溶质势，则水分外渗的结果可使原生质随着液泡一起收缩而脱离细胞壁，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而是质壁分离复原。 （2 ）活体染色法：活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。