常见的真核和原核表达系统的启动子(promoters)

常见的真核和原核表达系统的启动子（promoters）真核启动子

常用的原核表达系统启动子

启动子

启动子 科技名词定义 中文名称：启动子 英文名称：promoter;P 定义1：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科） 定义2：对遗传转录起发动作用的基因。 应用学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科） 定义3：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域。在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科） 定义4：决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。 应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶polymerases) 的活动。这种酶指导着RNA复制。 目录 简介

1启动子区的基本结构转录单元 1转录起点 1启动子区 1-10位的TATA区和-35位的TTGACA区 展开 简介 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的 起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA 复制本。一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。这种变化常见于恶性肿瘤。真核细胞含有3类不同的RNA聚合酶，根据其对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同，分为RNA聚合酶Ⅰ（A）、RNA聚合酶Ⅱ（B）、RNA聚合酶Ⅲ（C），如下： 酶的种类[1] 存在功能对抑制物的敏感性 RNA聚合酶 Ⅰ 核仁合成rRNA前体不敏感RNA聚合酶 Ⅱ 核质合成mRNA前体及大多数snRNA 低浓度敏感 RNA聚合酶Ⅲ核质 合成5S rRNA前体、tRNA前体及其他的核和胞质小 RNA前体 高浓度敏感 [1]真核细胞还具有线粒体RNA聚合酶，存在于线粒体，能产生线粒体RNA；叶绿体RNA聚合酶，存在于叶绿体，能产生叶绿体RNA。 如RNA聚合酶Ⅱ识别Ⅱ类启动子，催化mRNA和大多数核内小RNA（snRNA）合成，它的启动子很复杂，主要包括4个部位：第一个部位为转录的起始部位其碱基大多为A；第二个部位是TATA框（TATA box），其共有序列为TATA（A/T）A（A/T），是富含AT的7个核苷酸。TATA框是类似于原核启动子的Pribnow框，位于-25；第三个部位为CAAT框（CAAT box），其共有序列为GGNCAATCT（其中N为C或T），位于-75附近；第四部分为增强子（enhancer），增加转录的速率

常见真核启动子及原核启动子特点

真核启动子 EF1a 常规表 达用 mRNA 人延长因子1α来 源的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表 达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表 达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子 杂交 TRE 常规表 达用 mRNA 四环素响应元件启 动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达

Ac5 常规表 达用mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动 子 组成型果蝇表达系统的常用启动子 CaMKIIa 光遗传 学基因 表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶 II 启 动子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受 到钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表 达用mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表 达用mRNA 乙醇脱氢酶I的酵 母启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表 达用mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达

U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型 小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子 T7lac 高水平基因表达 T7噬菌体来源的启动子加上lac 操纵子 几乎没有本底 表达，需要T7 RNA 聚合酶，受 到lac 操纵子的控制，可以被 IPTG 诱导。 常用与pET 载体，受到lac 操纵子的严格调控 Sp6 体外 转录/ 常规 表达 Sp6噬菌体来源的启动子 组成型, 需要SP6 RNA 聚合 酶 当用于体外转录的时候，专路方向有可能是正向的也可能是 反向的，取决于启动子相对于目的基因的方向 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代谢操纵 子的启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD 载体。适合于快速调控和低的本底表达

T7 启动子

https://www.wendangku.net/doc/7719295586.html,/questionDetail.do?id=29117 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。 T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。 2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。 CMV：CMV基因组有229kb，属疱疹病毒亚β科。CMV DNA只有一个单向性的IE启动子复合体，可指导多个基因的表达[1]。在IE94基因上游存在一个强启动子，IE94的上游区比SV40病毒的72bp重复序列具有更高的增强子功能。IE94基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间着保守的序列。在这一区段的-50～-580bp之间至少有4套13～18bp 的重复序列。IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2增强子或CMV增强子，是上游调节区复合体的一部分。因集中了

常见真核启动子及原核启动子特点精编版

常见真核启动子及原核 启动子特点 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

真核 启动子 EF1a 常规 表达用 mRNA 人延长因子 1α来源的强哺乳动物表达启动子 组成型? 表达水平十分稳定， 与细胞类型无关 PGK1(人/小鼠) 常规 表达用 mRNA 磷酸甘油酸 酯激酶基因 来源的哺乳 动物启动子 组成型? 广泛表达,但可能因 细胞类型而异。由于 甲基化或脱乙酰作 用，倾向于抵抗启动 子下调。 humanbetaactin 常规 表达用 mRNA β-肌动蛋白基因来源的哺乳动物启动子 组成型? 无处不在，鸡的启动 子常用与启动子杂交

TRE 常规 表达 用 mRNA 四环素响应 元件启动子 被四环 素或者 类似物 诱导 通常有本底表达 Ac5常规 表达 用 mRNA 果蝇Actin5c 基因来源的 强昆虫启动 子 组成型? 果蝇表达系统的常用 启动子 CaMKIIa 光遗 传学 基因 表达 mRNA? Ca2+/钙调蛋 白依赖的蛋 白激酶II启 动子 特异的 用于中枢神经系统/ 神经元表达。受到钙 和钙调蛋白调节。 GAL1,10常规 表达 用 mRNA 酵母双向启 动子 被半乳 糖诱 导，被 葡萄糖 抑制 可以单独使用或一起 使用。受GAL4和 GAL80调节。 TEF1常规 表达 用 mRNA 酵母转录延 伸因子启动 子 组成型? 与哺乳动物的EF1a 启动子类似

ADH1常规 表达 用 mRNA 乙醇脱氢酶I 的酵母启动 子 被乙醇 抑制 全长版本很强，促进 高表达。截短启动子 是组成型的，表达较 低。 Ubi 常规 表达 用 mRNA 玉米泛素基 因的植物启 动子 组成型?在植物中促进高表达 U6小 RNA 表达 shRNA 来源于人U6 小核启动子 组成型? 小鼠U6也使用,但效 率略差。 常用的原核表达系统启动子 T7lac 高水 平基 因表 达 T7噬菌体 来源的启 动子加上 lac操纵 子 几乎没有本底 表达，需要 T7RNA聚合 酶，受到lac 操纵子的控 制，可以被 常用与pET载体，受到lac操纵子 的严格调控

启动子

启动子（promoter）是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。启动子可以被RNA 聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。完全的启动子称为规范序列。 启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。关于其结构特点，Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNase l水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有41～44个核苷酸对。他先后分离了fd噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动子、h 噬σ菌体的PR启动子及大肠杆菌乳糖操纵子的UV5启动子等5段被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。 许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase I水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnowbox），这个框的中

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞，表达载体 1、pCMVp—NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT—Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β—肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞

CMV启动子

CMV启动子 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等。zhengzzh对CMV和T7的来源做了介绍。启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。 T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI 操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。 CMV：CMV基因组有229kb，属疱疹病毒亚β科。CMV DNA只有一个单向性的IE启动子复合体，可指导多个基因的表达[1]。在IE94基因上游存在一个强启动子，IE94的上游区比SV40病毒的72bp重复序列具有更高的增强子功能。IE94基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间着保守的序列。在这一区段的-50～-580bp之间至少有4套13～18bp的重复序列。IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2增强子或CMV增强子，是上游调节区复合体的一部分。因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型的细胞的影响条件下均有活性。根据对基因表达的影响可将此增强子分为3个区。在CMV感染中，增强子调控的表达先激活后抑制。在CMV复制早期可诱导NF-κB、AP-1和CREB/ATF等细胞转录因子与增强子中多位点结合。感染后可诱导产生NF-kB和aP-1。在感染晚期，A TF的结合受影响，其活性受病毒基因产物的调节。

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。 3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP—Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明： pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落,由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的

真核细胞常见表达载体

真核细胞罕见表达载体之迟辟智美创作 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株. 拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外，载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗

性基因在年夜肠杆菌中的表达. 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外，载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白，该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构. 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目

T7启动子

T7启动子 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的 程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核 苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动， 而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基 因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。 T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧 妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大 的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的 速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争 不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时 目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制

T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3 是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚 合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体 可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是 用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的 潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在 热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达 水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI 操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上 T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以 阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI转化也是同样的原理。如果这还 不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相

启动子与增强子

第三章第二节启动子与增强子 教学目标： 教学重、难点： 教学内容： 一、原核生物启动子 1 启动子：是一段位于结构基因5 '端上游区的DNA 序列，在转录起始之前被RNA 聚合酶结合的DNA 部位称为启动子；启动子的结构影响它与RNA 聚合酶的亲和力，决定基因表达强度。 转录单元：是一段从启动子开始到终止子（terminator ）结束的DNA 序列，RNA 聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA 链；在细菌中，一个转录单 元可以是一个基因，也可以是几个基因。 2 转录起点：指与新生RNA 链第一个核苷酸相对应DNA 链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。 上游：常把起点前面，即5 '末端的序列称为（upstream ）上游; 下游：起点后面即3 '末端的序列称为下游（downstream ）。 在描述碱基的位置时，起点为＋1 ，下游方向依次为＋2 ，＋3 ……， 上游方向依次为－1 ，－2 ，－3 ……。 3 启动子结构： Pribnow框：在起始点上游，几乎在所有启动子都存在一个6 bp富含A/T区域TATAAT。通常位于－18位到－9位，称为Pribnow框。该区域是RNA聚合酶牢固结合位点，RNA聚合酶结合后， 这一富含A/T的DNA双链解开。 Sextama框：位于－35区附近有一TTGACA序列，是RNA聚合酶中的σ因子识别位点。以上这两个位点对于转录起始都是非常重要的。σ因子识别－35区并与之结合。由于RNA聚合酶分子覆盖面积能达到70bp，因此酶分子上的一个合适部位能接触－10区。酶分子一旦与－10区结合以后，就从识别位点上解离下来。此外，－35序列的重要性还在于在很大程度上决定了启动子的强度。。－10 区和－35 区的最佳距离： 在原核生物中，－35 区和－10 区的距离大约是16 ～19bp ，小于15bp 或大于20bp 都会降低启动子的活性；保持启动子这两段序列以及它们之间的距离是十分重要的，否则就会改变它所控制的基因表达水平。 在细菌中常见两种启动子突变： 下降突变：如果把Pribnow 其从TATAAT 变成AATAAT ，就会大大降低其结构基因的转录水平； 上升突变:：即增加Pribnow 区共同序列的同一性。 突变后的-10 区和-35 区越接近共同序列，转录的RNA 就越多；越远离共同序列，转录的RNA 就越少。

原核真核启动子及BL21相关知识

感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS BL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。 真核原核启动子 原核： 几个常用的启动子和诱导调控表达系统 1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。 突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。 启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。 启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。 5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30℃下抑制转录，42℃开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。 7.以λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大

真核生物的启动子

真核生物的启动子 由于真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA 框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H 2 B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白，（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNA pol 结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。 (一)Ⅱ类基因的启动子和调控区 Ⅱ类基因的启动子由核心元件和上游元件组成。核心元件包括TATA框和转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr）。 在起始点一般没有同源序列，但mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py 组成（在原核启动子的CAT起始序列也有这种情况），称为起始子（initiator）， 一般由P Y2CAP Y5 构成，位于-3～+5，可能提供RNA pol Ⅱ识别。无论TATA是否 存在，Inr对于启动子的强度和起始位点的选择都是十分重要的。现已分离纯化了与Inr特异结合的蛋白质因子。 1．核心元件 TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚语称为金砖 （Goldbrick），其一致序列是：T 85A9 7 T 93 A 85 A 63 A 83 A 50 ，常在起始位点的上游-25左 右，相当于原核的-10序列。但-10是不可缺少的，而真核启动中也有的缺乏TATA 框。其作用是：(1) 选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector），当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的这一作用，如鼠的脱氨核苷转移酶（Tdt）基因就没有TATA框，但有17bp的Inr；(2) 影响转录的速率。TATA框的8bp的保守序列一般都是由A.T对组成，少数情况在其中的两个位点上由G.C对取代了A.T，可见它是较容易打开。当它的序列因发生突变和缺失而改变时就会影响它和酶的结合能力，从而影响转录的能力。在伴清蛋白基因中，当TATA框突变为TAGA后，转录效率大大降低。兔的珠蛋白基因当TATA框的保守序列ATAAAA人工突变为ATGTAA时转录效率会下降80%。人的